一种广谱抗病促生的芽胞菌菌株

摘要

本发明涉及一种芽胞菌属的菌株，该菌株是短小芽胞杆菌（Bacilluspumilus）WP8；保藏编号为CGMCCNo.5206。本发明使用时仅需用该菌株浸种10~20min，晾干栽种即可，具有用量省、见效快、适应性强等特点，可节约20%~70%农药化肥投入量，对多种病害的生防效果达60%以上，有效地解决了多种果蔬、作物生产中过度依赖农药化肥的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种芽胞菌属的菌株，特别是涉及一种利用微生物筛选技术，从小麦根际土壤分离获得的对多种植物有较强促生和生防作用的芽胞菌菌株。

背景技术

植物根际促生菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)是农用生物制剂常用的微生物素材。过去十几年间，用PGPR菌株及其相关产品进行植物促生和生防应用已屡见不鲜，但真正能大范围应用的产品却不多见，其原因是大多PGPR菌株环境适应性差、在土壤中竞争力不强。因此，筛选高效广适的PGPR，是研发生物制剂的关键。迄今为止，人们筛选出的PGPR菌株通常都具有促生专一性或局限性。不少国内外文献报道了一些PGPR菌株具有高效广谱的促生能力，如Jetiyanon等人报道了几株Bacillus spp.菌株对番茄枯萎病、辣椒炭疽病和黄瓜花叶病等病害具有较好的生防作用；Suresh等人报道了一些Pseudomonas spp.菌株能拮抗多种病原真菌。但这些研究都仅仅涉及PGPR对病原菌的拮抗作用或实际的生防作用，这些菌株在健康土壤中是否还具有促生作用，我们不得而知。但可以推断，这些PGPR大多很难适应不同的土壤环境和植物。这是因为，以往报道PGPR的生防途径，主要是产生HCN、抗生素等，对于健康土壤而言，增加这些物质可能对植物起负面作用。目前国内推广应用的一些农业微生物制剂仍然存在产品作用专一性强、环境适应性差等缺陷。事实上，这些问题对于微生物制剂开发人员而言可能是比较清楚的，只是出于某些原因不便明言罢了。

发明内容

本发明针对以往PGPR菌株作用局限性，应用筛选技术，从根际土壤获得1株真正既广谱抗病，又高效促生的PGPR菌株，并已在水稻育秧、豇豆、番茄、蚕豆等等植物上应用成功。

本发明提供的菌株为短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）WP8（以下简称为WP8菌株），是从我国江苏省扬州大学农学院试验农场小麦根际土壤中分离、筛选出的，其已于2011年8月31日在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏管理中心”保藏，保藏编号为CGMCC No. 5206。

本发明所述的WP8菌株具有下述性质：

A、形态特征

在肉汤琼脂培养基28℃培养2天后，用光学显微镜和电子显微镜进行观察，WP8细杆状，长度2~3微米，宽度为0.6~0.7微米，革兰氏阳性，产芽孢，以极生鞭毛运动。

B、培养特征：

在肉汤琼脂培养基上菌落乳白，半透明，表面粗糙但有光泽，边缘辐射状。

C、菌株生理生化特性：

WP8菌株在10%氯化钠培养基上亦可缓慢生长，接触酶、甲基红反应阳性，能液化明胶，产硫化氢，V-P反应阴性，不能水解淀粉、尿素，不能还原硝酸。

D、菌株16S rRNA基因序列如SEQ ID NO. 1所示。

E、菌株鉴定结果

通过形态特征、理化特性，结合16S rRNA基因序列结果，将该菌株鉴定为短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）。

本发明使用时仅需用该菌株浸种10~20 min，晾干栽种即可，具有用量省、见效快、适应性强等特点，可节约20%~70%农药化肥投入量，对多种病害的生防效果达60%以上，有效地解决了多种果蔬、作物生产中过度依赖农药化肥的问题。

附图说明

图1为WP8菌株对6种常见病原真菌的体外拮抗作用。图中从左至右分别为Botrytis cinerea、Bipolaris sorokiniana、Fusarium graminearum、Rhizoctonia cerealis、Rhizoctonia solani、Fusarium moniliforme。

图2为WP8菌株在水稻育秧中的促生效果。其中图左为对照，图右为添加WP8处理。

图3为WP8菌株在番茄青枯病生防中的效果。其中图左为对照，图右为添加WP8处理。

图4为WP8菌株电镜形态（9 700×）。

具体实施方式

实施例1：WP8菌株的筛选方法

采集扬州大学农学院试验田小麦根及其附着土壤(≤2 mm区域)，置于冰盒(温度约4℃)，立即带回实验室。取植物根部，用无菌dH₂O轻柔冲洗，以去除外围土壤，切成长约3 cm小段（利于内生细菌释放），各称取约1 g根段加入200 mL无菌dH₂O，150 r/min混合30 min，梯度稀释后，分别吸取20 μL菌液涂布于3种筛选培养基：Jensen’s 培养基、King’s B培养基’和NA (nutrient agar)培养基，28℃培养72 h，挑取共计98株形态各异的细菌，分别编号，按照溶磷、解钾、固氮、产IAA、产嗜铁素、抗生素等指标进行PGPR菌株的进一步筛选，最终获得1株高效促生能力的WP8菌株。

WP8菌株于2011年8月31日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 5206；分类命名为短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

实施例2：WP8促生及生防指标测定

A、体外抑菌能力测定

用改进的平板双培养法测定WP8体外抑菌率（图1）。在PDA平板边缘均匀接种3滴10⁸ CFU/ mL菌液，28℃培养24 h。从长有病原菌的PDA平板上用打孔器挖取4 mm直径病原菌块，转置于长有细菌的平板中央，继续培养7 d。抑菌率(%) = (平板面积－病原菌覆盖面积)/平板面积×100%。结果显示，WP8对Botrytis cinerea、Bipolaris sorokiniana、Fusarium graminearum、Rhizoctonia cerealis、Rhizoctonia solani、Fusarium moniliforme等原真菌的拮抗率分别为53.99%、64.67%、14.52%、30.91%、13.27%和64.94%。

B、产嗜铁素鉴定

将CAS培养基划分成若干等分，接种供试菌株(10 μL 10⁶ CFU/mL)，28℃培养48 h-72 h，如菌株周边有黄绿色晕圈产生，即表明该菌株具产嗜铁素能力。结果表明，WP8有一定的产嗜铁素能力。

实施例3：WP8对豇豆幼苗促生能力测试（盆栽试验）

将消毒过的豇豆种子在10⁸ cfu/mL WP8细胞液内浸泡20 min，于无菌操作台上风干后，备播种用。豇豆播种，每孔穴播入3粒种子，深度为2-3 cm，覆土后每孔穴补充5 mL自来水，置于室温环境。整个试验期不施任何肥料，只在土表干燥时，每孔穴补以等量自来水。7 d后，统计种子出苗率，之后间苗至1棵/穴；15 d后，将幼苗小心取出，测量根、茎长度；自来水下冲洗洗净后，将茎叶和根部分离，置于烘箱80℃烘8 h左右至恒重，分别称重。试验中，WP8浸种处理出苗率分别比对照提高14.29%，株高比对照提高14.39%，干物重比对照增高18.43%，差异均达显著水平。

实施例4：WP8对水稻塑盘旱育秧苗素质的影响

将消毒过的水稻种子在10⁸ cfu/mL WP8细胞液内浸泡20 min，于无菌操作台上风干后，备播种用。在434孔规格的塑盘旱育抛秧盘中，每盘均匀撒播45 g种子，用细土覆土2 cm，喷洒自来水使苗盘湿润，覆膜。齐苗后，在第一叶完全抽出1.0 cm左右时揭膜。早晚时分洒水补湿。20 d后，取出秧盘，测量茎长、茎基粗等；自来水下冲洗洗净后，将茎叶和根部分离，置于烘箱80℃烘8 h左右至恒重，分别称重。试验中，WP8处理的茎高比对照减少7.27%，茎基粗对照增粗21.05%，差异均达显著水平；WP8处理的地上部和地下部干重分别比对照增重8.23%和4.82%（如图2）。

实施例5：WP8对番茄青枯病的生防作用

将消毒过的番茄种子在10⁸ cfu/mL WP8细胞液内浸泡20 min，于无菌操作台上风干后，备播种用。在土壤中拌入10⁷ cfu/g soil浓度的番茄青枯病病原菌，播种，设对照和WP8菌株浸种2个处理，每孔播3粒种子，覆土后喷洒自来水使育苗盘湿润，置于室外环境。12 d后间苗至每孔2株。早晚时分洒水补湿。12 d间苗时统计出苗株数，出苗率(%)=出苗株数/播种粒数×100%；35 d后，取出育苗盘，统计健株数，健株率(%) = 健苗株数/出苗株数×100%，防治效果(%) = (病原菌对照发病苗数－处理组发病苗数)/病原菌对照发病苗数×100%，测量茎长、根长、茎基粗等；自来水下冲洗洗净后，将茎叶和根部分离，置于烘箱80℃烘8 h左右至恒重，分别称重。试验中，WP8处理的出苗率比对照增加25.91%，番茄健株率比对照增加180.36%，差异达显著水平，生防效果达52.10%（如图3）。

实施例6：菌株的鉴定

A、形态及培养特征：接种WP8菌株于营养肉汤琼脂上28℃培养2~4天后，观察菌落形状及菌体颜色，并用光学显微镜及电子显微镜进行常规菌体形态的观察（如图4）。

B、生理生化实验：参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》的内容对菌株进行生理生化鉴定。

C、16S rRNA基因序列分析：按反复冻融法提取细菌基因组DNA。以总DNA为模板，利用特异引物27F/1492R (引物见SEQ ID NO. 2和3)扩增16S rRNA基因近乎全长片段。50 μL的反应体系中含有1×PCR Buffer (含MgCl2)，200 μmol/L的dNTPs，0.2 μmol/L的引物，1×Taq DNA聚合酶(Takara，大连宝生物)和1 μL的模板。PCR反应程序为：94°C预变性5 min；94°C变性45 s，64°C退火1 min，72°C延伸90 s，20个循环，每次循环退火温度降低0.5°C；72°C延伸20 min。PCR产物送上海生工测序。根据获得16S rDNA序列，在GenBank中Blast搜索同源序列。

                        SEQUENCE LISTING

 

<110>  扬州大学

 

<120>  一种广谱抗病促生的芽胞菌菌株

 

<130> 

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1470

<212>  DNA

<213>  Bacillus pumilus

 

<400>  1

acggccgggg gcgggggtgc taatacatgc aagtcgagcg gacagaaggg agcttgctcc     60

 

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ccgccgaagg tgggccgatg cctttaattt                                    1470

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

agagtttgat cmtggctcag                                                 20

 

 

<210>  3

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

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