N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成及其负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法

摘要

N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成及其负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法，它涉及壳聚糖的合成及其负载疫苗纳米粒的制备方法。合成：脱乙酰处理的壳聚糖；壳聚糖的浸泡处理；粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖；精制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖。制备：N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶液中加新城疫病毒液，获得溶液A；溶液A中加三聚磷酸钠，PBS和司班-80，获得溶液B；将溶液B离心取沉淀并加PBS悬浮，加海藻糖脱脂奶，冷冻干燥后即完成。本发明制备的纳米粒，粒径容易控制，载药纳米粒粒径小，包封率高、载药量大、制备条件温和、药物毒副作用低、缓释时间长，制备工艺简单，生产成本较低，易于规模化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及壳聚糖的合成及其负载疫苗纳米粒的制备方法。

背景技术

壳聚糖是甲壳素脱乙酰后的产物，是一种天然可再生资源。壳聚糖的化学名称为聚(2- 氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖)。一般而言，甲壳素脱乙酰度在55％以上就可称为壳聚糖。甲壳素 广泛存在于低等动植物特别是节肢动物的甲壳中，世界每年可生物合成甲壳素达100亿吨之 多，被誉为仅次于纤维素的第二大天然高分子聚合物。因此，壳聚糖是一种总量很大，目前 尚未得到充分利用的天然资源。

制备纳米载药粒子的过程中，选择包裹药物的基质材料极为重要。壳聚糖作为自然界唯 一带有阳离子的天然多糖，具有良好的生物活性、生物相容性、生物可降解性以及抗菌等特 殊功能，广泛应用于医药、功能材料等领域，近年来，在纳米载药、载基因体系中备受关注。 但由于壳聚糖的水溶性差，在一定程度上限制了它的应用，对壳聚糖进行化学改性，可改善 它的水溶性、生物活性及力学性能，拓展壳聚糖在上述各领域中的应用。

壳聚糖能溶于酸性溶液中，形成直链聚阳离子，但在中性及碱性条件下，壳聚糖不溶于 水。壳聚糖分子结构中除了含-OH外，还有活泼的-NH₂。在-OH或-NH₂上引入活性基团，能 改善壳聚糖的溶解性和生物活性。本发明通过对壳聚糖进行化学改性，引入亲水性强的羟丙 基三甲基氯化铵基团，制备N上取代的羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，改善了壳聚糖的水溶性， 保持了分子的阳离子性能。N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖由于具备永久正电性和生理环境 下的水溶性，可有效地降低跨上皮细胞电阻，打开上皮细胞的紧密连接，通过细胞旁路增加亲 水性大分子的转运，提高纳米粒的摄取率。

纳米级聚合物粒子通常定义为直径在10-1000nm，N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米 粒子作为药物控释载体具有其独特的优势，不仅具有良好的生物相容性，药物包封率高，载 药量大，高效的药物利用率，稳定性强和释药时间长及改变给药途径等优点，而且还由于N-2- 羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖具有可溶性，带正电性和附着在生物体粘膜表面所具有的独特的 特点，使得N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒子适用于具有生物活性大分子药物的包埋 和释放，如多肽、蛋白质、核酸、疫苗等。

发明内容

本发明提供了N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成及其负载新城疫减毒活疫苗纳米粒 的制备方法。

本发明N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成方法按以下步骤实现：

一、将50g脱乙酰度为85％的壳聚糖分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中，在90～120 ℃下回流搅拌反应1h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，然后分散在200mL NaOH的 异丁醇溶液中，继续回流搅拌反应1.5～8h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，获得脱 乙酰处理的壳聚糖；

二、将2～3g脱乙酰处理的壳聚糖溶于100～150mL体积浓度为1～3％乙酸溶液中，搅 拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物，获得壳聚糖溶液，然后在500～1000r/min搅拌条件下逐滴 加入浓度为0.1～2mol/L NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH至8～9并有白色沉淀析出，浸泡 8h后抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分，然后向滤饼中加入15～20mL异丙醇，搅 拌30min后倒入三口烧瓶，完成壳聚糖的浸泡处理；

三、在N₂保护条件下，将步骤二中的三口烧瓶升温至75～85℃，每隔2h逐滴加入2，3- 环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，每次滴定时间30min，共滴加三次，反应8～14h后将 烧瓶冷却至室温，加入150～300mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0.5h后抽滤，冷冻干燥24h， 完成壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应，获得粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚 糖；

四、将粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水，应用3G砂芯漏斗过滤后将 滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀，然后真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥24h，即完成 N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成；

其中步骤一中NaOH的异丁醇溶液中NaOH的质量分数为15％～40％，异丁醇的量为每 克壳聚糖加入10～30mL异丁醇；步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液中2，3- 环氧丙基三甲基氯化铵与异丙醇溶液的质量体积比为1g∶2mL；步骤三中2，3-环氧丙基三甲基 氯化铵的总加入量为2～27g；步骤四中粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与去离子水的质 量体积比为1g∶25mL。

用上述方法合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备 方法按以下步骤实现：

一、取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为0.5～2mg/mL的溶液，然后取5mL 并滴加1.25～7.5mL新城疫病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A；

二、溶液A在室温、无菌条件下以900～1300r/min磁力搅拌30s，然后滴加2.5mL浓度 为0.5～3mg/mL的三聚磷酸钠，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌8～30min，再滴加 1mL的PBS，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌8～30min，然后滴加1mL的司班-80， 维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌8～30min，获得溶液B；

三、将溶液B于4℃、12000r/min离心2min，取沉淀并用PBS洗三次，然后加入15mL浓 度为0.01mol/L的PBS悬浮，再加入2mL质量浓度为1％海藻糖脱脂奶，真空冷冻干燥24h， 获得新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒(简称为 NDV-N-2-HACC-NPs)，即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米 粒；

其中步骤一中新城疫病毒液为经过去离子化处理的L系新城疫病毒液，蛋白含量为 620μg/mL，血凝价为1∶1024，病毒粒子的粒径为20～300nm；步骤二中司班-80在1400r/min 下乳化30min。

本发明N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成，是将2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(ETA) 连接到壳聚糖的氨基上，具有原料易得(2，3-环氧丙基三甲基氯化铵已实现工业化生产)、操 作简单、成本低等优点。

本发明N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒，使其作为口服递 送载体，具备了永久正电性和生理环境下的水溶性，可有效地降低跨上皮细胞电阻，打开上 皮细胞的紧密连接，通过细胞旁路增加亲水性载药纳米粒子的转运，提高纳米粒的摄取率。

与壳聚糖纳米粒子相比，本发明制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚 糖纳米粒，其粒径容易控制，制备的载药纳米粒粒径小，包封率高(40％～90％)、载药量大 (20％～70％)、制备条件温和、药物毒副作用低、缓释时间长。本发明制备工艺简单，生产 成本较低，易于规模化生产。

本发明制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒，其中病毒含量 为10^6..5EID₅₀/0.1mL，符合《中华人民共和国兽用生物制品规程》中新城疫低毒力活疫苗制苗 用毒液标准。本发明制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒可用于 鸡新城疫免疫，经口服给药，给药量为每只鸡0.5mL。

附图说明

图1是具体实施方式一中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的主要反应过程图；图 2是具体实施方式一中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与现有壳聚糖的傅立叶转换红 外线光谱分析图，其中HACC为N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，chitosan为壳聚糖；图3 是具体实施方式一中现有壳聚糖的¹H NMR谱图；图4是具体实施方式一中N-2-羟丙基三甲 基氯化铵壳聚糖的¹H NMR谱图；图5是具体实施方式一中N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖 的¹³C NMR谱图；图6具体实施方式一中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和壳聚糖溶 液的透光率对pH的依赖关系图，其中HACC为N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，chitosan 为壳聚糖；图7具体实施方式五中制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖 纳米粒的透射电镜图；图8具体实施方式五中制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯 化铵壳聚糖纳米粒的透射电镜图；图9具体实施方式五中制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙 基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒的Zeta电位图；图10具体实施方式五中制备的新城疫减毒活 疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒的粒径分布图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组 合。

具体实施方式一：本实施方式N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成方法按以下步骤实 现：

一、将50g脱乙酰度为85％的壳聚糖分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中，在90～120 ℃下回流搅拌反应1h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，然后分散在200mL NaOH的 异丁醇溶液中，继续回流搅拌反应1.5～8h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，获得脱 乙酰处理的壳聚糖；

二、将2～3g脱乙酰处理的壳聚糖溶于100～150mL体积浓度为1～3％乙酸溶液中，搅 拌溶解，真空抽滤，滤去不溶物，获得壳聚糖溶液，然后在500～1000r/min搅拌条件下逐滴 加入浓度为0.1～2mol/L的NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH值至8～9并有白色沉淀析出， 浸泡8h后抽滤，去离子水洗至滤液呈中性，抽干水分，然后向滤饼中加入15～20mL异丙醇， 搅拌30min后倒入三口烧瓶，完成壳聚糖的浸泡处理；

三、在N₂保护条件下，将步骤二中的三口烧瓶升温至75～85℃，每隔2h逐滴加入2，3- 环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，每次滴定时间30min，共滴加三次，反应8～14h后将 烧瓶冷却至室温，加入150～300mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0.5h后抽滤，冷冻干燥24h， 完成壳聚糖与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应，获得粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚 糖；

四、将粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水，应用3G砂芯漏斗过滤后将 滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀，然后真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥24h，即完成 N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成；

其中步骤一中NaOH的异丁醇溶液中NaOH的质量分数为15％～40％，异丁醇的量为每 克壳聚糖加入10～30mL异丁醇；步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液中2，3- 环氧丙基三甲基氯化铵与异丙醇溶液的质量体积比为1g∶2mL；步骤三中2，3-环氧丙基三甲 基氯化铵的总加入量为2～27g；步骤四中粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与去离子水的 质量体积比为1g∶25mL。

本实施方式步骤四中完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成后可进行分装，充入N₂密封室温保存。

本实施方式中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的主要反应过程如图1所示；

本实施方式中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与现有壳聚糖相比较，其傅立叶转 换红外线光谱分析如图2所示，可见N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的氨基的伸缩振动峰减 弱，在1480cm^-1处出现-CH₃的C-H弯曲振动强吸收峰，表明引入了羟丙基三甲基氯化铵的季 铵盐侧链。壳聚糖的¹H NMR谱图如图3所示，N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的¹H NMR 谱图如图4所示，N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的¹³C NMR谱图如图5所示，表明其结构 与预期结构相符。

实施例1：

N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成方法按以下步骤实现：

一、将50g脱乙酰度为85％的壳聚糖分散在200mL NaOH的异丁醇溶液中，在110℃下 回流搅拌反应1h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，然后分散在200mLNaOH的异丁 醇溶液中，继续回流搅拌反应1.5h，去除上清液后沉淀用去离子水洗至中性，获得脱乙酰处 理的壳聚糖；

二、将3g脱乙酰处理的壳聚糖溶于150mL体积浓度为2％乙酸溶液中，搅拌溶解，真空 抽滤，滤去不溶物，获得壳聚糖溶液，然后在750r/min搅拌条件下逐滴加入浓度为0.1mol/L 的NaOH溶液，调节壳聚糖溶液pH值至8.8并有白色沉淀析出，浸泡8h后抽滤，去离子水 洗至滤液呈中性，抽干水分，然后向滤饼中加入20mL异丙醇，搅拌30min后倒入三口烧瓶， 完成壳聚糖的浸泡处理；

三、在N₂保护条件下，将步骤二中的三口烧瓶升温至80℃，每隔2h逐滴加入2，3-环氧 丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液，每次滴定时间30min，共滴加三次，反应12h后将烧瓶冷 却至室温，加入300mL冷藏处理的无水乙醇，浸泡0.5h后抽滤，冷冻干燥24h，完成壳聚糖 与2，3-环氧丙基三甲基氯化铵开环反应，获得粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖；

四、将粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖溶于去离子水，应用3G砂芯漏斗过滤后将 滤液在5倍体积冷藏处理的丙酮中沉淀，然后真空抽滤，滤饼分散后冷冻干燥24h，即完成 N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成；

其中步骤一中NaOH的异丁醇溶液中NaOH的质量分数为20％，异丁醇的量为每克壳聚 糖加入20mL异丁醇；步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的异丙醇溶液中2，3-环氧丙基三甲 基氯化铵与异丙醇溶液的质量体积比为1g∶2mL；步骤三中2，3-环氧丙基三甲基氯化铵的总加 入量为3g；步骤四中粗制N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖与去离子水的质量体积比为1g∶ 25mL。

本实施方式步骤一中获得脱乙酰处理的壳聚糖的脱乙酰度为95％。

本实施方式中合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，经取代度测定，取代度为34％。 合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖和壳聚糖溶液的透光率对pH的依赖关系如6所示， 结果表明，壳聚糖在酸溶液中溶解性良好，但在pH＞6.5的溶液中急剧下降，而N-2-羟丙基 三甲基氯化铵壳聚糖在水中的溶解性随pH变化较小，说明壳聚糖改性为N-2-羟丙基三甲基 氯化铵壳聚糖后其溶解性得到了改善。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤一中壳聚糖的分子量为 71.3。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤二中将2.5g脱乙酰处理的 壳聚糖溶于120mL体积浓度为2％乙酸溶液中。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一的不同是步骤三中冷藏处理的无水乙醇 的温度为4℃。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式用具体实施方式一合成的N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖 负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法按以下步骤实现：

一、取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为0.5～2mg/mL的溶液，然后取5mL 并滴加1.25～7.5mL新城疫病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A；

二、溶液A在室温、无菌条件下以900～1300r/min磁力搅拌30s，然后滴加2.5mL浓度 为0.5～3mg/mL的三聚磷酸钠，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌8～30min，再滴加 1mL的PBS，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌8～30min，然后滴加1mL的司班-80， 维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌8～30min，获得溶液B；

三、将溶液B于4℃、12000r/min离心2min，取沉淀并用PBS洗三次，然后加入15mL浓 度为0.01mol/L的PBS悬浮，再加入2mL质量浓度为1％的海藻糖脱脂奶，真空冷冻干燥 24h，获得新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒(简称为 NDV-N-2-HACC-NPs)，即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米 粒；

其中步骤一中新城疫病毒液为经过去离子化处理的L系新城疫病毒液，蛋白含量为 620μg/mL，血凝价为1∶1024，病毒粒子的粒径为20～300nm；步骤二中司班-80在1400r/min 下乳化30min。

本实施方式步骤二中三聚磷酸钠作为交联剂使用。

本实施方式步骤二中滴加1mL的PBS，使其在溶液B中的终浓度为0.01mol/L；步骤二 中滴加1mL的司班-80，使其在溶液B中的含量为1/10⁴。

本实施方式中新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒的最大包封率可 达90％，最大载药量为70％。

本实施方式中制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒，其Zeta 电位为35～70mV，粒径为200～900nm。

实施例2：

N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法按以下步骤实 现：

一、取N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为1mg/mL的溶液，然后取5mL并滴 加6.25mL新城疫病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A；

二、溶液A在室温、无菌条件下以1200r/min磁力搅拌30s，然后滴加2.5mL浓度为 1mg/mL的三聚磷酸钠，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌5min，再滴加1mL的PBS， 维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌5min，然后滴加1mL的司班-80，维持在5min内匀 速滴完，继续磁力搅拌5min，获得溶液B；

三、将溶液B于4℃、12000r/min离心2min，取沉淀并用PBS洗三次，然后加入15mL浓 度为0.01mol/L的PBS悬浮，再加入2mL质量浓度为1％海藻糖脱脂奶，真空冷冻干燥24h， 获得新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒(简称为 NDV-N-2-HACC-NPs)，即完成N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫减毒活疫苗纳米 粒；

其中步骤一中新城疫病毒液为经过去离子化处理的L系新城疫病毒液，蛋白含量为 620μg/mL，血凝价为1∶1024，病毒粒子的粒径为20～300nm；步骤二中司班-80在1400r/min 下乳化30min。

本实施方式中制备的新城疫减毒活疫苗N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒，其透射 电镜图见图7和8；Zeta电位见图9，Zeta电位为43～46mV；粒径分布图见图10，粒径为 250～600nm。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五的不同是步骤一中取N-2-羟丙基三甲基 氯化铵壳聚糖配制成浓度为1.5mg/mL的溶液，然后取5mL并滴加7mL新城疫病毒液。其它 步骤及参数与具体实施方式五相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式五的不同是步骤二中溶液A在室温、无菌 条件下以1100r/min磁力搅拌30s，然后滴加2.5mL浓度为2mg/mL的三聚磷酸钠。其它步骤 及参数与具体实施方式五相同。