水稻花期干旱胁迫应答蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体为一种水稻花期干旱胁迫应答蛋白及其编码基因与应用。本发明的蛋白的氨基酸残基序列如SEQIDNo：1所示；编码所述蛋白的干旱胁迫应答蛋白的基因的核苷酸序列如SEQIDNo:2所示；本发明还提供一个水稻抗旱基因及建立于此基因调控元件基础上的有效检测植物所受干旱胁迫程度的方法。经检测，该方法具有快速、有效估量水稻植株所受干旱的特点。本发明为植物缺水检测提供了一种快速、便捷、有效的方法，并为植物抗旱研究及干旱育种提供了一个优质基因，具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻花期可以有效应答干旱胁迫的蛋白及其编码基因，以及这种基因的调控元件在水稻抗旱中的应用。

背景技术

随着世界环境的变化和人口数目的增多，粮食问题越来越突出，尤其是对于人口基数大的发展中国家。水稻是在亚洲地区广泛种植的一种主要粮食作物，已经有上千年的种植历史。但是水稻的种植对淡水资源的需求量很大。随着全球气候的不断变化，在一些地区已经出现了气候的异常，如雨季，河流汛期的改变等等，会造成一些水稻主要产区的水资源的短缺，对水稻的产量影响很大。在我国的北方地区温度条件已经可以满足水稻的生长，而且由于北方地区昼夜温差大的气候特点反倒会促进水稻糖分的积累，种出的水稻具有口感好，糖粉积累多等优点，只是因为水资源不够丰富而没办法大力推广种植，所以在全国范围内对于耐旱品种的研究和推广就很有必要。  

水稻作为一种淡水资源依存度比较高的农作物，对干旱非常敏感。与其他植物相比，水稻对水分胁迫更为敏感，水分亏缺会使植株发育受阻，分蘖减少，花粉败育，产量减少等。植物生理学家和育种专家对水稻的长期种植实践和观察发现，生殖发育时期有几个阶段对外界逆境非常敏感，此时遭受胁迫可能会导致产量的大幅度下降，比如说水稻的第一苞分化至颖花原基分化始期（决定花的个数），减数分裂期（决定雌雄育性），灌浆期（决定种子饱满程度，千粒重）。这些时期遭受干旱胁迫会使得花的个数减少、颖花退化、空瘪等（杨弘远编著. 水稻生殖生物学. 2005，浙江大学出版社）。

近年来对于植物对干旱响应过程的研究表明，植物遭遇干旱逆境时，植物体迅速感知外部信号，并迅速传导到细胞内部，进而激活许多干旱胁迫应答基因的表达，在植物体内产生大量的特异性蛋白，协同调节植物生理生化一级代谢的变化，从而提高对干旱的耐性。同时随着水稻全基因测序工作的完成，针对水稻组织的全基因组表达技术如基因芯片、蛋白质组分析等的不断发展和完善，使得我们分析克隆水分亏缺条件下的响应基因，进而从中发现新的抗旱基因和抗旱调控元件成为可能。

发明内容

本发明的目的是提供一个来源于水稻的可应答干旱胁迫的蛋白及其编码基因，以及该编码基因的调控元件在报告水稻干旱程度中的应用。

本发明对处于花期的水稻进行干旱胁迫处理，利用基因芯片技术进行转录谱分析，筛选出一个干旱胁迫后诱导表达的基因Os01g0702500。Os01g0702500是一个脱水素蛋白，能稳定细胞膜和许多大分子的结构以避免脱水对细胞造成的伤害，在抗旱过程中起到重要作用。 对基因Os01g0702500进一步分析后发现，该基因的表达图谱具有非常高的专一性，且该基因的启动子为诱导型启动子，故Os01g0702500仅在受到干旱胁迫的水稻花穗中特异表达，以抵御干旱逆境。利用这一特性，本发明在该基因的启动子3’端连接一个报告基因GUS，在植物受到干旱逆境胁迫时，报告基因便开始表达，经过一种便捷有效的染色方法就可以估量植物水分的缺失，以便及时补救，有效减少甚至避免损失。

Os01g0702500蛋白及其编码基因的特性让我们对此基因在研究抗旱功能方面有很高的期望，对深入研究植物抗旱机制及功能有重大意义。而该基因的启动子不仅可以通过驱动报告基因表达提供了一种检测植物遭受干旱胁迫程度的手段，同时这个启动子还可以驱动其他抗旱基因，使植物受到干旱胁迫时超量表达特定的抗旱蛋白，以抵御干旱的伤害。因而本发明涉及的这种可以有效应答水稻干旱胁迫的蛋白及其编码基因，以及这种基因的有效的专门响应干旱刺激的启动元件在水稻抗旱中应用前景广阔。

本发明所提供的可应答干旱的基因，名称为Os01g0702500，来源于水稻（Oryza sativa ssp. japonica）；是下述氨基酸残基序列之一：

1）序列SEQ ID No:1;

2）将序列SEQ ID No:1的氨基酸残基序列经过一至二十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且对植物的生长发育具有调控作用的蛋白质。

序列SEQ ID No:1由188个氨基酸残基组成。

编码本发明Os01g0702500，是下述核苷酸序列之一： 

1) 序列SEQ ID No:2的核苷酸序列；

2) 编码序列SEQ ID No:1蛋白质序列的DNA；

3) 与序列SEQ ID No:2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；

4) 在高严谨条件下可与序列SEQ ID No:2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件为：用0.1×SSPE（或0.1×SSC），0.1%SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

序列SEQ ID No:2由 567 个碱基组成，其编码框为自5’端第 1 位碱基，编码具有序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸残基序列的蛋白质。

本发明所提供的可应答干旱的基因Os01g0702500的调控元件为该基因的启动子区域，是是下述核苷酸序列之一：

1) 序列SEQ ID No:3的核苷酸序列；

2) 与序列SEQ ID No:3限定的核苷酸序列具有90％以上同源性的核苷酸序列；

3) 在高严谨条件下可与序列SEQ ID No:3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件为：用0.1×SSPE（或0.1×SSC），0.1%SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

本发明还提供含有本发明基因及其专门响应干旱刺激的启动子元件的重组表达载体、转基因细胞系和工程菌以及扩增该序列中任一片段的引物对。

本发明还提供一种检测植物遭受干旱胁迫程度的方法。

在实际应用中，将Os01g0702500的启动子（promoter）与报告基因GUS融合，将该构建Os01g0702500p-GUS转化水稻，可以估量植物水分的缺失。

上述重组表达载体均可按照常规方法构建。

本发明的Os01g0702500是一个抗旱基因，可以在水稻花期受到干旱胁迫时大量表达，以抵御干旱逆境。而Os01g0702500p-GUS的转基因植株可以报告水稻水分的缺失。本发明不但提供了一种抗旱基因，更提供了一种检测植物遭受干旱胁迫程度的方法，同时也对深入研究植物抗旱机制及功能有重大意义。即本发明基因的调控元件可在水稻抗旱中的获得应用。本发明的蛋白质及其编码基因具有较高的实际应用价值，应用前景广阔。

附图说明

图1为水稻幼苗(seedling)、未进行干旱处理的水稻花序(flower)和进行干旱处理后的水稻花序(drought-induced flower)中Os01g0702500的表达水平。

图2为pCAMBIA1301-Os01g0702500p-GUS转化水稻植株与野生型水稻经过干旱处理后花苞中的GUS染色结果。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。所用引物由英骏生物技术有限公司完成，测序工作由上海桑尼生物科技有限公司完成。

实施例1.水稻抗旱基因Os01g0702500的筛选。

在水稻二级枝梗形成时，停止灌溉，监测土壤含水量，使之保持在20-30%，持续一周。取水稻花苞为材料，提取总RNA（Promega，SV total RNA isolation system），通过基因芯片比较分析对照植物与被胁迫植物的基因表达谱，初步筛选到一些候选基因，Os01g0702500便是其中之一。以水稻幼苗时期（seedling）、未受干旱胁迫的花期（flower）、受到干旱胁迫的花期（drought-induced flower）的总RNA为模板，用AMV反转录酶（TaKaRa）合成cDNA（依据Plant RT－PCR Kit 2.01（TaKaRa）的用户手册进行），用荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）检测对照植物与被胁迫植物中Os01g0702500的表达情况（依据TaKaRa的用户手册进行）。所用5’和3’引物分别为5'-TGTGACAGTGTGACTGTGAGGC-3'（SEQ ID No:4

）和5'- CAAACCCAACACACAACGCTA-3'（SEQ ID No:5）。反应按照下列程序进行：预变性 95℃ 3分钟，1个循环；变性95℃ 10秒，退火与延伸60℃ 30秒，40个循环。对比该基因的在幼苗时期（seedling）、未受干旱胁迫的花期（flower）和受到干旱胁迫的花期（drought-induced flower）的表达量，我们发现Os01g0702500的表达具有非常高的专一性，仅在受到干旱胁迫后的水稻花穗中特异表达（图1）。

实施例2. Os01g0702500启动子的克隆。

提取水稻总DNA，以水稻总DNA为模板，PCR扩增_Os01g0702500的启动子部分。（引物序列分别为：5’-AAGCTTTTTGCACTGTTGTATTTTTTGA-3’（SEQ ID No:6）， 5’-CCATGGTGGTTGGTGTCGTCGAGTTGCT－3’（ SEQ ID No:7 ）。50ul PCR反应体系包含：模板2ul，高保真酶KOD plus（TOYOBO） 1ul，10×缓冲液5ul，2.5uM dNTP 8ul，20uM的 5'和3’引物各1ul，水32ul。反应条件为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，55℃退火1分钟，68℃延伸2分30秒，共30个循环。，然后将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化得到2040bp的扩增片段。PCR产物经HindⅢ和NcoI酶切位点克隆到大肠杆菌表达载体pCAMBIA1301杆菌表达质粒pCAMBIA1301-Os01g0702500p-GUS。

实施例3. 重组质粒pCAMBIA1301- Os01g0702500p-GUS转化水稻植株。

将重组质粒pCAMBIA1301-Os01g0702500p-GUS转化到水稻中。参照Hiei等（Plant Mol Biol，1997，35：205－218）的方法转化水稻。将质粒pCAMBIA1301-Os01g0702500p-GUS通过电激法转入根瘤农杆菌EH105中，经筛选获得阳性克隆。将携带质粒pCAMBIA1301-Os01g0702500p-GUS的农杆菌EH105接种到5ml含100mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中，28℃摇菌培养至对数生长期晚期，再1：100扩大培养到OD600为0.5左右。收集农杆菌菌体并重悬于转染培养基中。按照常规方法浸染水稻日本晴的愈伤组织，经共培养感染、抗性培养基筛选及分化培养基上分化得到潮霉素抗性的阳性苗。待小苗长至10cm左右时，将小苗移至室外网室种植，收种即得T1代种子。

实施例4. 质粒pCAMBIA1301-Os01g0702500p-GUS转基因水稻植株报告干旱胁迫效果的检测。

将得到的转基因水稻T1代种子与野生型水稻正常种植，在花期初期对两组水稻进行为期1周的干旱处理。取两组水稻的花序浸于GUS染色中，于37℃放置24h后，70%乙醇浸泡24h以洗脱杂色，观察经过干旱处理与对照组的花器染色程度。图2即为转基因水稻植株和野生型水稻花序的GUS染色结果。未受干旱处理的转基因水稻植株，其花序里报告基因GUS的表达水平非常之低，而受过干旱处理的转基因水稻植株，其报告基因却呈现了高度表达，因而证明了Os01g0702500的启动子为一种干旱诱导型的启动子，在植物受到干旱胁迫后在花器官中诱导表达。同时我们的结果还提供了一种检测植株水分缺亏的方法，即通过便捷有效的染色就可以估量植物水分的缺失，以便及时补救，有效减少甚至避免损失。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  复旦大学

<120>  水稻花期干旱胁迫应答蛋白及其编码基因与应用

<130>  001

<160>  7    

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  188

<212>  PRT

<213>  稻属水稻（Oryza sativa ssp. japonica）

<400>  1

Ile Gln Phe Pro Ile Ser Ser Ile Ala Arg Ile Thr His Gly Ser Lys

1               5                   10                  15     

Arg Val Thr Glu Leu Glu Thr Glu Glu Ala Pro His Pro His Glu Ser

            20                  25                  30         

Ala Val Met Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ala Val Ala Pro Gly Gly Glu

        35                  40                  45             

Ala Tyr Thr Arg Asp Gly Gly Gly Val Val Pro Pro Ala Gly Glu Lys

    50                  55                  60                 

Thr Phe Ala Tyr Glu Gly Thr Val Ser Ala Ala Gly Val Thr Gly Ala

65                  70                  75                  80 

Ser Gly Gln Leu Gln Pro Thr Thr Arg Glu Glu Gly His Thr Thr Leu

                85                  90                  95     

Gly Glu Thr Leu Arg Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser

            100                 105                 110        

Ser Ser Glu Asp Asp Gly Gln Gly Gly Arg Arg Lys Lys Lys Ser Ile

        115                 120                 125            

Lys Glu Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly Ser His Lys Gln Glu Glu

    130                 135                 140                

Gln Lys Gln Ala Gly His Thr Ala Pro Ala Ala Gly Thr Gly Thr Gly

145                 150                 155                 160

Thr Gly Thr His Ala Ala Gly Lys His Glu Lys Lys Gly Ile Val Glu

                165                 170                 175    

Lys Ile Lys Glu Lys Leu Pro Gly His Gly His His

            180                 185            

 

<210>  2

<211>  567

<212>  DNA

<213>  稻属水稻（Oryza sativa ssp. japonica）

<400>  2

atccaatttc ccatcagctc gatcgctcgt atcactcatg gctcaaagag ggtaaccgag     60

ttagaaactg aggaggcgcc gcacccgcac gagagcgcgg tgatgagcgg cgcagccgcc    120

gctgccgtcg caccaggagg cgaggcgtac acgcgcgacg gcggcggcgt agttcccccg    180

gccggcgaga agacgttcgc ctacgagggc acggtcagcg ccgccggcgt cacgggcgcc    240

tccgggcagc tccagcccac caccagggag gaggggcaca cgacgctcgg cgagacgttg    300

cgccgctccg gcaaatccag ctccagctcc agctcgtcgt cggaggatga cgggcaaggt    360

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aagctccccg gccacggcca ccactga                                        567

 

<210>  3

<211>  2041

<212>  DNA

<213>  稻属水稻（Oryza sativa ssp. japonica）

<400>  3

tttgcactgt tgtatttttt gataagcatg gacatttcat tcaacttttg ctgctgtatg     60

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tctatcttct ccagctacta tggtaggtca aaggaggatt gctctaatca ccaggacttg    900

ataccgatca ttctggcaaa tcttgtttgc aaaccgtaaa acattgaagt ttgtgttgaa    960

actaatttgg aacaaatatg tttccgtggc ctgtttctgt ggagaaattt tgtaaagccg   1020

ttgtaaatcg tcacagaggt ggcaatttat ataggaaact agttcagaga actactcgga   1080

gtttttgttt ggagggtgag agatgatgat tggcatatgt aacatgtcgg aggttacgaa   1140

ctatatgaat ggtttcatac gcgtcttctc tcttttcttg atgtcctttt ctattttgct   1200

tacctttcag actcagtgcg cgttctgctt tcatgtagtc ttttgtatct tcatgtcaag   1260

cactcaagct aattgctaat gctatattgc catgttgatt tgaaaaacat cctcgtattt   1320

ttccattggt taaccaggtt gcaaaatcat aatgagattt ggatcccgtt ttccatgtga   1380

aaccagggtg caaaatcgca ttgccggcgc gagaacagcc tgcgtgttga ggctcgcgat   1440

gcagaagcaa caccgtcgga ttgatcagga ctcaggagca gcacggcagc atcgctacaa   1500

gggacaccac tccgccgagg cttcattttg tgattctttt tgcttttctg taggagcatt   1560

tgatattcgt tgcgtccagc attccagcaa agatgttacg atgtggatag tgtgttgcaa   1620

gaccgatgtt tggtccatgt agccacgcaa tattcttcga tattttcgag cctttgatgc   1680

tttagaggta atttggatag ttataatcag gtcttgagat cttcgatggc tatctgcccg   1740

ggcaaagtgt acccttttac tgttcacccg gaaccttcca gagatcaggc cgcaacgtgg   1800

cgcgcccggc gcttacgtgc ccttctccgg tcacgcgcgc cgtccttacg agggcacacg   1860

tggcttgcct gcagggctgc agataccgcc tgtcgcctcc tgtttcctcg tacaaatacg   1920

agtccgcttc cgcttcatca tcatccaatt tcccatcagc tcgatcgctc gtatcactca   1980

tggctcaaag agggtaaccg agttagaaac tgaggaggaa gcaactcgac gacaccaacc   2040

a                                                                   2041

 

<210>  4

<211>  22

<212>  DNA

<213>  

<400>  4

tgtgacagtg tgactgtgag gc                                              22

 

<210>  5

<211>  21

<212>  DNA

<213>  

<400>  5

caaacccaac acacaacgct a                                               21

 

<210>  6

<211>  28

<212>  DNA

<213>  

<400>  6

aagctttttg cactgttgta ttttttga                                        28

 

<210>  7

<211>  28

<212>  DNA

<213>  

<400>  7

ccatggtggt tggtgtcgtc gagttgct                                        28