金针菇中具有抗肿瘤作用的可皂化提取物及其制法和用途

摘要

一种金针菇中具有抗肿瘤作用的可皂化提取物，它是金针菇子实体经醇溶液提取，浓缩提取液，用水分散后用低极性非质子有机溶剂萃取，回收低极性非质子溶剂后，加碱的醇溶液进行皂化，皂化液回收醇溶剂后加水分散，经低极性非质子有机溶剂萃取，经低极性非质子有机溶剂萃取后的皂化液用盐酸酸化至pH=1-2，再次用低极性非质子有机溶剂萃取，萃取液回收溶剂后得到的金针菇中具有抗肿瘤作用的可皂化提取物。该提取物具有体外抑制HepG2、SGC、U251和A549肿瘤细胞生长的活性。本发明公开了其制法。

说明书

技术领域：

本发明涉及金针菇可皂化提取物及其制备方法；本发明进一步涉及所述可皂化提取物的药物组合物；本发明还涉及所述可皂化提取物在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

肿瘤是当今世界上危害人类健康的最严重疾病之一，世界各国的专家学者都在积极研究寻找治疗肿瘤的方法和药物，尤其对食用菌中抗肿瘤物质的研究十分活跃，有关这方面的动物实验及初步临床观察表明食用菌中的多糖和某些蛋白对动物移植肿瘤有较强的抑制作用，能增强机体的免疫功能，减轻放疗、化疗的毒性反应。

金针菇Flammulina velutipes (Curt.:Fr.) Sing.，又名金钱菌、朴菇、冬菇、毛柄金钱菌，属真菌门 (Eumycota)，担子菌亚门 (Basidiomycotina)，层菌纲 (Hymenomycetes)，伞菌目 (Agaricales)?，口蘑科 (Tricholomataceae)，小火焰菌属 (Flammulina)、或金钱菌属 (Collybia)，是中外著名的食用菌之一，也是当今市场上十分走俏的天然保健食品之一。金针菇广泛分布于中国、日本、俄罗斯西伯利亚和小亚西亚以及欧洲、北美洲、澳大利亚等地。在我国，北起黑龙江，南至广东，东起福建，西至四川的广大区域内，均有金针菇分布 (郭美英主编, 《中国金针菇生产》, 北京: 中国农业出版社, 2000.)。

金针菇作为一种食用菌不仅营养丰富，而且富含多种活性物质。从上世纪七十年代起，日本、美国等国学者已经开始对金针菇进行抗肿瘤方面的基础研究，随后引起了国际研究学者的广泛兴趣。研究表明，其活性成分主要为蛋白质和多糖类成分。蛋白质类包括Flammulin、Velutin、Flammin和Velin等四种核糖体失活蛋白、真菌免疫调节蛋白、金针菇毒素、火菇素、火菇蛋白原、酶和凝集素等 (Maruyama H., Ikekawa T., International Journal of Medicinal Mushrooms, 2007, 9(2): 109-122.  Kenji, F., Michika, H., Sadaki, A., et al. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2008, 72(12): 3107-3113.)。多糖类包括SFA1、胞外多糖、FVP2、PA₃DE和PA₅DE等 (M.Y.K. Leung, K.P. Fung, Y.M. Choy, Immunopharmacology, 1997, 35: 255-263.  K.S. Shin, K.W. Yu, H.K. Lee1, et al, Food Technol. Biotechnol., 2007, 45 (3): 319-326.)。这些成分具有抗肿瘤，抗病毒，抗虫，抗真菌，抗人的免疫缺陷病毒 (HIV)，降低血清胆固醇，降压，提高机体免疫力等广泛药理活性。特别是抗肿瘤作用研究得最多，对肉瘤-180、艾氏腹水瘤等均有抑制作用。其机理被认为是免疫调节作用，即在机体免疫功能受损的情况下，能够增强T细胞功能，激活淋巴细胞及吞噬细胞，促进抗体产生，并能够诱导干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α的产生，它对肿瘤的抑制生长作用是通过恢复和提高整个机体的免疫能力。

此外，曹培让等从金针菇深层发酵菌丝体中分得5种化台物：大豆异黄酮，染料木素，6-甲氧基大豆素，腺苷，腺嘌呤 (曹培让, 王淑芳, 徐贵祥, 等. 中草药, l992, 23(10): 511.)。陈智毅等采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法 (HS-SPME-GC-MS) 测定金针菇中的挥发性成分，得到5种酯类成分，4种醛类成分，烯烃、醇类、呋喃类各1种 (陈智毅, 刘学铭, 施英, 等. 食用菌学报, 2009, 16(1), 73-75.)。汪金玉等采用水蒸汽蒸馏法提取金针菇中挥发性成分，应用GC-MS法分离出30个组分，并鉴定出苯乙醛、邻苯二甲酸异丁酯、邻苯二甲酸丁酯、软脂酸、软脂酸乙酯、亚麻酸等6个组分 (汪金玉, 陈康, 林励, 等. 时珍国医国药, 2008, 19(5), 1145-1146.)。Lee等从金针菇中测定出C10:0、C14:0、C16:0、C18:0、C18:1、C18:2六种脂肪酸的含量 (KJ Lee, IJ Yun, KH Kim, et al, Journal of Food Composition and Analysis, 24 (2011) 175-178.)。然而，未见上述物质的药理学或生物活性研究的报道。

康洁等对金针菇菌丝体95%乙醇提取物的化学成分进行了研究，共得到20余个化合物，包括7个甾体、3个氨基酸、3个环二肽类化合物、2个黄酮、2个核苷类化合物、2个多元醇类化合物、1个倍半萜、一个神经酰胺。其中17个化合物为首次从金针菇发酵菌丝体中得到。单体化合物药理筛选结果表明：麦角甾醇和鸟嘌呤核苷有较强的抑制乙酰胆碱酯酶的作用，而甘露醇和核糖醇有较强的改善东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍的作用 (康洁. 构菌，海漆和蒙桑化学成分及生物活性研究[D], 北京：中国协和医科大学, 2006.)。

中国专利申请03132324.3《富锗金针菇多糖及其制法和用途》，200610036622.5《一种高活性金针菇多糖-肽-Fe²⁺鳌合物及其制备方法》，200810222271.6《一种金针菇提取物及其获得方法与应用》以及200910010576.5《重组金针菇免疫调节蛋白的制备方法及应用》涉及了金针菇功效及用途，但都是关于金针菇中蛋白质或多糖类物质，未涉及可皂化类成分。

经查阅国内外文献，有关金针菇可皂化成分的研究较少，特别是在抗肿瘤药用方面，目前尚未见到有关金针菇可皂化成分抗肿瘤作用研究与应用方面的报道。

发明内容：

本发明的目的之一是，提供一种金针菇抗肿瘤可皂化提取物及其制备方法。

本发明的目的之二是，提供一种以所述可皂化提取物为有效成分的药物组合物。

本发明的目的之三是，提供所述可皂化提取物在制备抗肿瘤及相关药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

一种金针菇中具有抗肿瘤作用的可皂化提取物，它是金针菇子实体经醇溶液提取，浓缩提取液，用水分散后用低极性非质子有机溶剂萃取，回收低极性非质子溶剂后，加碱的醇溶液进行皂化，皂化液回收醇溶剂后加水分散，经低极性非质子有机溶剂萃取，经低极性非质子有机溶剂萃取后的皂化液用盐酸酸化至pH=1-2，再次用低极性非质子有机溶剂萃取，萃取液回收溶剂后得到的金针菇中具有抗肿瘤作用的可皂化提取物。

一种制备上述金针菇具有抗肿瘤作用的可皂化提取物的方法，它包括如下步骤：

步骤1. 将金针菇子实体粉碎后用70%-95%的乙醇回流提取，冷却，过滤，浓缩提取液得浸膏；

步骤2. 将步骤1的浸膏加水分散，用低极性非质子有机溶剂萃取，萃取液蒸馏回收溶剂后，加碱的乙醇溶液加热回流皂化，冷却；

步骤3. 将步骤2的皂化液蒸馏回收乙醇，加水后用低极性非质子有机溶剂萃取，萃取后的皂化液加盐酸酸化至pH=1-2，再次用低极性非质子有机溶剂萃取，萃取液回收溶剂后即得金针菇中具有抗肿瘤作用的可皂化提取物。

具体的操作可以是：

一种制备上述金针菇中具有抗肿瘤作用的可皂化提取物的方法，它包括如下步骤：

步骤1. 将金针菇的子实体粉碎，用生药量1～10倍的70%-95%的乙醇溶液提取三次，合并提取液，回收溶剂得浸膏；

步骤2. 浸膏加水分散，用1～10倍体积的低极性非质子有机溶剂萃取，萃取液蒸馏回收溶剂后，加浓度为1mol/L的碱的乙醇溶液加热回流进行皂化；

步骤3. 皂化液回收乙醇后加水分散，经1～10倍体积的低极性非质子有机溶剂萃取，萃取后的皂化液用盐酸酸化至pH=1～2，再次用低极性非质子有机溶剂萃取，萃取液回收溶剂后即得金针菇中具有抗肿瘤作用的可皂化提取物。；

上述的金针菇中具有抗肿瘤作用的可皂化提取物的方法，所述的低极性非质子有机溶剂是乙醚或乙酸乙酯。

本发明所述的皂化反应是指碱催化下的酯水解反应，尤指油脂的水解。

本发明进一步提供了金针菇中可皂化提取物在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。以抑制人肝癌细胞（HepG2）、人胃腺癌细胞（SGC）、人胶质瘤细胞（U251）、人肺腺癌细胞（A549）、人宫颈癌细胞（HeLa）和人结肠癌细胞（Lovo）增殖能力为活性指标进行抗肿瘤活性实验。实验结果表明，当药物浓度为100 μg·mL^-1或者125 μg·mL^-1，时间从24 h延长至72 h时，可皂化提取物对肿瘤细胞的抑制率越来越高，72 h时达到最大值，抑制率分别为68.49%（HepG2）、71.40%（SGC）、61.57%（U251）、76.87%（A549）、0.31%（HeLa）和44.20%（Lovo）。药物对HepG2、SGC、U251和A549的增殖抑制率强于HeLa和Lovo。

有益效果：

1、本发明的优点和效果在于采用溶剂提取、萃取等常规方法，从金针菇中提取得到了新的具有抗肿瘤作用的有效组合物—可皂化提取物，该有效组合物经实验证明具有体外抑制HepG2、SGC、U251和A549肿瘤细胞生长的活性。

2、本发明拓展了抗肿瘤药物的原料渠道，扩大了金针菇的用途，使金针菇从普通食品发展成为抗肿瘤药物的新原料，可显著提高金针菇的附加值；同时，为从食用菌中筛选发现新的抗肿瘤药物提供了新思路。

 

具体实施方式：

以下所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1金针菇可皂化提取物的制备

将鲜金针菇子实体5000 g粉碎，用95%乙醇回流提取2小时，乙醇量为金针菇重量的3倍，过滤后的残渣重复提取1次，过滤，合并二次乙醇提取液34 L，回收乙醇至近无醇味，继续浓缩至600 ml，加等体积的乙醚萃取4次，合并乙醚萃取液2400 ml，无水硫酸钠脱水干燥，回收乙醚，约得乙醚提取物10 g。乙醚提取物加入1.0 mol/L氢氧化钾的95%乙醇溶液，搅拌加热回流，皂化液除去乙醇后加适量蒸馏水稀释，用乙醚萃取不皂化物4～5次；用浓盐酸将萃取不皂化物后的水相皂化液调至pH=1～2，用乙醚萃取可皂化物3～4次，合并乙醚提取液，经蒸馏水洗至中性，无水硫酸钠脱水后，过滤，回收乙醚即得可皂化提取物20 mg。

实施例2金针菇可皂化提取物的制备

将鲜金针菇子实体50℃下鼓风烘干，粉碎，用70%乙醇回流提取2小时，乙醇量为金针菇重量的10倍，过滤后的残渣重复提取1次，合并乙醇提取液；回收乙醇，加乙醚萃取4次，合并乙醚萃取液，无水硫酸钠脱水干燥，回收乙醚，即得乙醚提取物。乙醚提取物加入1.0 mol/L氢氧化钾的95%乙醇溶液，搅拌加热回流，皂化液除去乙醇后加适量蒸馏水稀释，用乙醚萃取不皂化物4～5次；用浓盐酸将萃取不皂化物后的水相皂化液调至pH=1～2，用乙醚萃取可皂化物3～4次，合并乙醚提取液，经蒸馏水洗至中性，无水硫酸钠脱水后，过滤，回收乙醚即得可皂化提取物。

实施例3抗肿瘤活性实验

以实施例1或实施例2得到的金针菇不皂化提取物为受试药物，体外培养人肝癌细胞HepG2，取指数生长期的细胞，用胰酶消化后，1500 r·min^-1离心5 min，将细胞重悬于培养基中，细胞浓度调至为2×10⁴个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，放置细胞培养箱（37℃, 5%CO2）中培养24 h。之后加入受试药物20 μL，阴性对照组加入终浓度为0.5%DMSO，各组均设3个复孔。分别在加药24 h、48h、72 h后，每孔加入5 mg·mL^-1MTT试剂20 μL，继续置于37℃培养4 h。每孔加入DMSO 100 μL，振荡混匀，测定各孔在波长570 nm处的吸光度值。计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。其结果见表1.

表1  金针菇可皂化提取物抗肿瘤活性实验（HepG2）

实施例4抗肿瘤活性实验

以实施例1或实施例2得到的金针菇不皂化提取物为受试药物，体外培养人胃腺癌细胞SGC，取指数生长期的细胞，用胰酶消化后，1500 r·min^-1离心5 min，将细胞重悬于培养基中，细胞浓度调至为2×10⁴个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，放置细胞培养箱（37℃, 5%CO2）中培养24 h。之后加入受试药物20 μL，阴性对照组加入终浓度为0.5%DMSO，各组均设3个复孔。分别在加药24 h、48h、72 h后，每孔加入5 mg·mL^-1MTT试剂20 μL，继续置于37℃培养4 h。每孔加入DMSO 100 μL，振荡混匀，测定各孔在波长570 nm处的吸光度值。计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。其结果见表2。

表2  金针菇可皂化提取物抗肿瘤活性实验（SGC）

实施例5抗肿瘤活性实验

以实施例1或实施例2得到的金针菇不皂化提取物为受试药物，体外培养人胶质瘤细胞U251，取指数生长期的细胞，用胰酶消化后，1500 r·min^-1离心5 min，将细胞重悬于培养基中，细胞浓度调至为2×10⁴个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，放置细胞培养箱（37℃, 5%CO2）中培养24 h。之后加入受试药物20 μL，阴性对照组加入终浓度为0.5%DMSO，各组均设3个复孔。分别在加药24 h、48h、72 h后，每孔加入5 mg·mL^-1MTT试剂20 μL，继续置于37℃培养4 h。每孔加入DMSO 100 μL，振荡混匀，测定各孔在波长570 nm处的吸光度值。计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。其结果见表3。

表3  金针菇可皂化提取物抗肿瘤活性实验（U251）

实施例6抗肿瘤活性实验

以实施例1或实施例2得到的金针菇不皂化提取物为受试药物，体外培养人肺腺癌细胞A549，取指数生长期的细胞，用胰酶消化后，1500 r·min^-1离心5 min，将细胞重悬于培养基中，细胞浓度调至为2×10⁴个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，放置细胞培养箱（37℃, 5%CO2）中培养24 h。之后加入受试药物20 μL，阴性对照组加入终浓度为0.5%DMSO，各组均设3个复孔。分别在加药24 h、48h、72 h后，每孔加入5 mg·mL^-1MTT试剂20 μL，继续置于37℃培养4 h。每孔加入DMSO 100 μL，振荡混匀，测定各孔在波长570 nm处的吸光度值。计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。其结果见表4。

表4  金针菇可皂化提取物抗肿瘤活性实验（A549）

实施例7抗肿瘤活性实验

以实施例1或实施例2得到的金针菇不皂化提取物为受试药物，体外培养人宫颈癌细胞HeLa，取指数生长期的细胞，用胰酶消化后，1500 r·min^-1离心5 min，将细胞重悬于培养基中，细胞浓度调至为2×10⁴个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，放置细胞培养箱（37℃, 5%CO2）中培养24 h。之后加入受试药物20 μL，阴性对照组加入终浓度为0.5%DMSO，各组均设3个复孔。分别在加药24 h、48h、72 h后，每孔加入5 mg·mL^-1MTT试剂20 μL，继续置于37℃培养4 h。每孔加入DMSO 100 μL，振荡混匀，测定各孔在波长570 nm处的吸光度值。计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。其结果见表5。

表5  金针菇可皂化提取物抗肿瘤活性实验（HeLa）

实施例8抗肿瘤活性实验

以实施例1或实施例2得到的金针菇不皂化提取物为受试药物，体外培养人结肠癌细胞Lovo，取指数生长期的细胞，用胰酶消化后，1500 r·min^-1离心5 min，将细胞重悬于培养基中，细胞浓度调至为2×10⁴个/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，放置细胞培养箱（37℃, 5%CO2）中培养24 h。之后加入受试药物20 μL，阴性对照组加入终浓度为0.5%DMSO，各组均设3个复孔。分别在加药24 h、48h、72 h后，每孔加入5 mg·mL^-1MTT试剂20 μL，继续置于37℃培养4 h。每孔加入DMSO 100 μL，振荡混匀，测定各孔在波长570 nm处的吸光度值。计算细胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-实验组吸光度/对照组吸光度）×100%。其结果见表6。

 表6  金针菇可皂化提取物抗肿瘤活性实验（Lovo）