一种控制水稻株型,器官大小,根系及结实率性状的XIAO基因的克隆与应用

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种水稻功能基因的克隆与应用。所述的XIAO基因与调控水稻株型，器官大小，结实率和根性发育有关，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述，其编码区如序列表SEQ ID NO：1中第3001-7474位所示序列所对应的序列。本发明通过筛选T-DNA突变体库，得到一个株型直立，器官变小，结实率下降，根卷曲的突变体，通过共分离和互补试验证实该突变体的表型是由于T-DNA插入XIAO基因导致的。生理学试验也表明所述的突变体对油菜素内酯敏感。本发明的基因可望在水稻遗传改良中得到应用，尤其是调控水稻株型，器官大小，结实率和根性发育生长等相关性状中的应用。

说明书

技术领域

本发明涉及植物生物技术和基因工程技术领域。具体涉及一个位于水稻第四染色体长臂上参与油菜素 内酯信号传导途径，控制水稻株型、器官大小、根系和结实率多效性基因XIAO的克隆及应用。

背景技术

多种因素会影响水稻的产量。其中分蘖、每穗颖花数、谷粒的大小、株型、结实率以及根系的发达程 度都会对产量造成极大的影响。随着水稻功能基因组平台的建立和发展，分离克隆这些水稻重要农艺性状 基因的速度明显加快。利用T-DNA插入突变体克隆基因显得尤为突出。

株高是影响产量的一个重要因子。矮化水稻，可提高水稻的耐肥性，从而大幅提高产量。上世纪60 年代在亚洲大面积推广的矮化品种，大幅提高了产量，并称为水稻的“第一次绿色革命”。2002年，水稻 绿色革命基因SD1被克隆，发现它是一个赤霉素合成途径的基因(Sasaki et al.，2002)。陈了赤霉素，油菜素 内酯、生长素、细胞分裂素都发现参与株高的控制。产量的构成因子还有每穗颖花数(穗大小)，粒重(粒 大小)。综合来看，株高、穗大小、粒大小都是植物器官变化的单个表现形式，本质上是细胞分裂，分化 的结果。另外，株型、叶倾角其实是由叶枕细胞分裂，伸长所致。因此，从细胞分裂入手，直接寻找控制 细胞分裂的基因，是一种快速，高效克隆产量基因的方法。

细胞如何分裂是最基本的生物学问题之一。过去对细胞分裂，细胞周期的研究成果大部分是基于单细 胞的水平。研究植物器官大小，不仅能在植物整体发育水平上研究细胞分裂问题，更能够提高产量。

植物器官大小是由组成器官的细胞数目和细胞大小决定的(Li et al.，2008；Mizukami and Fischer，2000； Szecsi et al.，2006)，并且，从目前克隆的基因来看，细胞数目的变化是器官变化的主要细胞学基础。从发 育的角度来看，器官原基的大小，细胞分裂持续的时间以及分裂的速度三者决定了最终器官的大小 (Anastasiou et al.，2007；Barroco et al.，2006)。细胞数目的变化是由细胞周期决定的。AINTEGUMENATA(ANT) 调控拟南芥器官大小的发育生物学基础是使细胞持续分裂的时间延长，它的分子机制则是ANT使细胞周期 蛋白CycD3的表达时间延长，在9星期发育成熟的老叶中，超表达的植株叶片中CycD3的表达量显著高 于对照，而在细胞分裂旺盛的花芽中CycD3的表达差异不显著(Mizukami and Fischer，2000)。因此，通过 调控细胞周期基因就有可能达到控制植物器官大小的目的。依赖细胞周期蛋白的激酶抑制因子(CDKI)通 过与细胞周期蛋白(cyclin)和依赖细胞周期蛋白激酶(CDK)复合体结合，达到抑制CDK的活性，从而 抑制细胞周期的进行。Barroco发现在超表达CDKI的水稻的第6片叶比对照要短14％，叶片变小的机制 是CDKI降低了的细胞分裂速率(Barroco et al.2006)。

植物激素在植物的形态建成中发挥了重要的作用。其中一种机制就是植物激素通过调控细胞周期相关 基因的表达来实现的(del Pozo et al.，2005)。受生长素响应的ARGOS是一个控制拟南芥器官大小的基因， 它通过延长它的下游基因ANT和CycD3的表达时间，使得细胞持续分裂的时间延长，最终决定了器官的 大小(Hu et al.，2006)。并且，ARGOS在水稻中的同源基因OsARGOS也能使拟南芥器官变大，OsARGOS 同时受生长素和细胞分裂素诱导。生长素控制器官大小的另一个例子就是生长素响应因子(AUXIN RESPONSE FACTOR 2，ARF2)。在arf2突变体中，ARGOS，ANT和CycD3的表达时间都延长了，最终 导致arf2的种子变大(Schruffet al.，2006)。

本发明从细胞分裂的角度，克隆参与水稻株型、产量相关基因，并挖掘植物激素在其中发挥的重要作 用，为水稻理想株型的分子设计育种挖掘基因资源。

发明内容

针对上述研究背景，本发明的目的在于分离克隆水稻产量相关基因XIAO(大写斜体表示，下同)， 并为利用植物激素应答而调节水稻产量提供一种新的途径。XIAO基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷 酸序列，也包括与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列有90％以上同源性的基因序列，也包括因插入、替代 或缺失一个或多个碱基而产生的突变体等位基因或衍生物。本发明也包括SEQ ID NO：2所示的XIAO(大 写正体表示，下同)蛋白的氨基酸序列，及与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有90％同源性以上的氨 基酸序列，也包括因插入、替代或缺失一个或多个氨基酸而产生的功能类似物。

本发明克隆的水稻XIAO基因的T-DNA插入失活突变体xiao(小写斜体表示，下同)在形态上总体 表现出器官变小、株型直立，根系卷曲及结实率下降(见实施例2，图1，图5)，并且突变表型也与在XIAO 基因内的T-DNA插入共分离(见实施例1)。正常功能的XIAO基因转化该突变体后植株恢复为野生型的 表型(见实施例1，表1)。

实现本发明的具体技术步骤如下：

1.筛选华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室创建的水稻T-DNA插入突变体库(Wu et al.， 2003)，筛选得到一个产量相关的突变体材料05Z11EJ51，我们将其命名为xiao，突变体的筛选鉴定方法见 实施例1第1部分中详细描述。

2.本发明比较了野生型(WT，下同)和突变体xiao对外援施加植物激素油菜素内酯(BR，下同)的 反应，结果表明产生突变体的表型的原因是由于突变体对BR超敏感(见实施例3)。

3.通过对突变体xiao的T-DNA插入与突变性状的共分离验证及功能互补实验(见实施例1)，成功克 隆产量相关基因XIAO。

详细的技术发明细节在《具体实施方式》中列出。

本发明的优点是：

1.本发明克隆了一个同时控制多种产量构成因子的基因。

2.本发明发现调控植物激素如油菜素内酯能够调节水稻产量。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1：是本发明分离克隆来源于水稻品种“日本晴”的XIAO基因的核苷酸序列，序列 全长6474bp，包括编码区(3001-6474bp)。

序列表SEQ ID NO：2是本发明分离克隆的来源日本晴的XIAO蛋白的氨基酸序列。

图1：野生型和突变体xiao的表型比较。

图1A：成熟期水稻野生型植株与不育植株形态比较：左为野生型WT，右为突变体xiao。

图1B：成熟期水稻野生型植株与不育植株株高比较：左为野生型WT，右为突变体xiao。

图1C：成熟期水稻野生型植株与不育植株花药比较：左为野生型WT，右为突变体xiao。

图1D：成熟期水稻野生型植株与不育植株种子比较：左为野生型WT，右为突变体xiao。

图1E：成熟期水稻野生型植株与不育植株剑叶叶倾角比较：左为野生型WT，右为突变体xiao。

图2.XIAO基因型鉴定。

图2A：XIAO基因的结构和T-DNA插入位点分析。起始密码(ATG)和终止密码(TGA)已经标出， 实心黑方框表示XIAO基因的唯一一个外显子，空心黑方框表示UTR；三角形表示xiao T-DNA插入的位 置。P1，P2，表示跨T-DNA的两条基因组引物，P3表示位于xiao突变体中T-DNA上的边界引物。

图2B：是一个xiao T-DNA插入杂合植株后代的基因型检测。植株基因型的确定当P1和P3配对时 才可以扩增出目标产物，由于T-DNA插入片段太大，P1与P2配对扩增的产物无法得到；野生型植株由于 没有T-DNA的插入，所以P1和P3配对扩增没有产物，但可以利用引物P1与P2配对扩增得到目标产物； 而XIAO杂合T-DNA插入转基因植株则P1和P2配对以及P1和P3配对时都可以扩增得到产物。植株表 型：20个T1代单株中第4、7、8、10、16和18株为突变表型(以M表示)。由图可知突变体的基因型 均为纯合T-DNA插入，而正常植株的基因型为野生(以W表示)或杂合型(以H表示)，这一结果表明 表型与XIAO基因内的T-DNA插入共分离。

图3.XIAO基因功能互补实验。

图3A：互补载体pC2301-XIAO结构示意图，该载体的构建说明见实施例1中的第3部分，即将含有 基因XIAO的完整的编码区和其启动子区域用EcoR I和Xbal I从BAC克隆(OSJNBa0020J04)酶切后克 隆到载体pCAMBIA2301(由澳大利亚CAMBIA实验室赠送，

http://www.cambia.org/daisy/cambia/materials/overview.html)上形成的新质粒。以pCAMBIA2301空载体转 化植株作为阴性对照。

图3B：XIAO基因功能互补实验所用的载体pCAMBIA2301结构示意图。

图4：野生型和突变体花药纵切比较细胞数目。

图4A、图4C表示野生型成熟花药花药纵切片。

图4B、图4D表示突变体成熟花药花药纵切片。

英文字母分别表示花药的结构。E：表皮细胞，P：花粉粒。Bars＝50μm

图5.用表油菜素内酯(BL)处理野生型和突变体的结果。

图5A：在对照(不添加BL)培养基中生长的根，左为野生型WT，右为突变体xiao。

图5B：在处理(添加0.01μM BL)培养基中生长的根，左为野生型WT，右为突变体xiao。

图5C：将WT和xiao种子在培养基(依次添加0，0.01，0.1，1μM BL)中黑暗发芽，测量胚芽鞘长度， 作图。

图6.构建本室突变体库所用到的载体pFX-E24.2-15R

图7.用Realtime PCR方法检测野生型和突变体中细胞周期基因的表达量

具体实施方式

实施例1：XIAO基因的分离克隆

1.xiao突变体的获得

所用的水稻T-DNA插入突变体库由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室利用载体 pFX-E24.2-15R构建而成(Wu et al.，2003)。突变体的筛选鉴定方法是：从上述水稻T-DNA插入突变体库 (RMD：http://rmd.ncpgr.cn/)中将T₀代转基因水稻种子(转化受体是中花11号，为中国农业科学院培育 的常用水稻品种)，经浸种、催芽后播于秧田，20天后移栽至大田。种植密度为5寸×8寸，种植地点为 中国湖北省武汉市洪山区华中农业大学的试验田，按常规的水稻种植方法进行田间管理。经过大田筛选得 到一个器官变小，不育，株型直立的家系(图1)。原始编号为05Z11EJ51。申请人将这个突变体命名为xiao。 该突变体已经收集到水稻突变体库中(RMD：http://rmd.ncpgr.cn/)，该突变体库的所有资源均可被研究人员 索取(Zhang et al.，2006)。

2.T-DNA插入侧翼序列与突变表型的共分离检测

为了证实xiao的突变表型是由于XIAO基因内的T-DNA插入引起，本发明对20个T₁代转基因植株(其中， 第4、7、8、10、16和18株为突变单株)进行了T-DNA插入位点侧翼序列与突变表型的共分离检测。共分 离检测的具体步骤为：(1)在XIAO基因T-DNA插入位点两侧设计一对基因组引物P1

(5′-TTGACGGTGCTCGACCTTTC-3′)和P2(5′-TACGCACTGCATTCGTTCTC-3′)，在T-DNA上设计一条 载体引物P3(5’-ATCCAGATCCCCCGAATTA-3’)，如图2A。在T₁代植株中，XIAO纯合T-DNA插入植株只 有当P1和P3配对时才可以扩增出目标产物；而由于T-DNA插入使P1与P2配对扩增的产物＞10kb，在申请人 设定的PCR反应程序无法得到相应PCR产物(这样鉴定植株基因型的方法是领域内的通用方法)。野生型植 株由于没有T-DNA的插入，所以P1和P3配对扩增没有产物，但可以利用引物P1与P2配对扩增得到目标产物。 而XIAO杂合T-DNA插入转基因植株则P1和P2配对以及P1和P3配对时都可以扩增得到产物。(2)应用CTAB 法(Liu et al.，1997)。从20株T₁代单株中分别抽提总DNA作为模板，用(1)中引物组合P1+P3和P1+P2进行 PCR扩增。反应体系为20μL，具体包含：DNA模板1μL；10倍体积的Taq酶反应缓冲液1.5μl；2mM dNTP 0.9μL；25mM镁离子1.2μL；10μM引物各0.2μL；1个单位Taq酶，加双蒸水至15μL。反应参数设置如 下：94℃ 4min；94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃ 1.5min，35 cycles；72℃ 5min，25℃ 1min。(3)将反 应产物经琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶上的带型判定各个单株的基因型。实验结果显示，20株T₁代单株中，6 株突变体表型植株的基因型均为XIAO纯合T-DNA插入，而其他14株表型正常的植株基因型为野生或杂合型 (如图2B)。这表明xiao突变体的突变表型是由于XIAO基因内的T-DNA插入造成，且该突变体表现为隐性 纯和突变体。

3.互补载体的构建

互补载体pC2301-XIAO的构建方法如下：以pCAMBIA2301载体为骨架载体，用EcoR I和Xbal I酶 切水稻“日本晴“BAC克隆OSJNBa0020J04，得到一系列将酶切片段，其中包括目的片段：含整个XIAO 基因编码区及ATG前约3.1kb和终止密码后约3.6kb(图3A)。将酶切片段与用EcoR I和Xbal I双酶切的 载体质粒pCAMBIA2301连接(图3B)(所使用的内切酶、碱性磷酸酶均购自Takara公司，连接酶购自 Promega公司，具体用法与用量参考该产品的说明书)。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为eppendorf 公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DH10B(购自 Promega公司)中，加800ul LB复苏30分钟，取80ul涂于含卡那霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖(X-β-gal) 及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LA平板，37℃温箱培养14-16小时(LA与LB配方参考：萨姆布 鲁克，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)。挑白色单克隆，扩大培养并抽提质粒，酶切 验证及测序验证后得到目的克隆。把构建好的载体电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(由 澳大利亚CAMBIA实验室赠送)中。转化后的菌株命名为EHA105-p2301-XIAO。

4.遗传转化

采用农杆菌介导的遗传转化方法将菌株EHA105-pC2301-XIAO导入xiao突变体的愈伤组织，经过预培 养、侵染、共培养、筛选具有G418(用于筛选阳性的转基因愈伤的一种抗生素，购自北京原平皓生物技 术有限公司)抗性的愈伤组织、分化、生根及炼苗移栽大田得到转基因植株(农杆菌介导的遗传转化试剂 及配方主要应用Hiei等人报道的方法基础上进行优化(Hiei et al.，1994；Lin and Zhang，2005)。参见申请人 先前的专利文献，专利号ZL 200710053552.9，发明的名称：水稻广亲和基因S5的分离克隆及应用  专利 申请日：2007年10月15日；专利公开日：2008年6月18日；公开号：CN101200725；专利授权日：2010 年04月21日)，按照前述专利文献介绍的遗传转化相同的操作方法(含培养基制备及抗性筛选方法)将 空载体pCAMBIA2301导入xiao突变体的愈伤组织，得到的转基因植株作为阴性对照。

本发明结果显示，将互补载体pC2301-XIAO通过农杆菌介导的方法转化导入xiao突变体的愈伤组织， 共获得独立互补转化苗26株，其中14株阳性植株全部恢复正常育性；获得空载体转化苗6株，全部表现 不育的突变表型。以上结果表明xiao不育突变表型是由于XIAO基因突变而造成。大田种植来源于4份T₀家系的下一代植株，其中转基因阳性植株育性均为正常，而转基因阴性植株均表现为突变体表型(见表1)。 这些研究结果进一步表明xiao突变体的突变表型确定是由于XIAO基因的突变而造成的。

表1  WT和xiao以及转基因T1代阳性和阴性的表型统计值

xiao(+)和xiao(-)分别表示转基因阳性和阴性植株。P值是由t测验得到的。数值为平均值±标准误。

5.XIAO ORF的分离和测序

按照cDNA末端快速扩增(RACE)和PCR引物延伸的方法得到XIAO的ORF。RACE使用的试剂为 SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒(购自Clontech公司)，操作方法按照试剂盒提供的方法进 行。

涉及的引物有：

分离5’端的如下：

51FCR2：5′-GGTTCCGAGACACCGAAAGAATCTGCA-3；

51FCR3：5′-GGAGAAGCGGTTGTCTTCGAGATCAAG-3；

分离3’端的如下：

51FCF4：5′-CACTAGTGTTGTTCCATCCATTTTCCGC-3；

51FCF3：5′-GGACGAAGACATCGTGAAGTGGGTGA-3；

该试剂盒提供的通用引物为：

Long UPM：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′；

Short UPM：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′；

最后结合预测的基因模式用引物FCF1和XIAOSUBR1将ORF扩增出来。

FCF1：5′-GAGAGAAAGGTGTTCCTTTC-3；

XIAOSUBR1：5′-AAATCTAGACGCCGGGGATGGCTGG-3；

实施例2：转基因植株的表型观察

1.器官大小，结实率，株型，根性的考察

试验方法：株高从穗到最底下一节用直尺量。剑叶用直尺量取叶片和叶鞘长度。胚芽鞘是取暗室发芽 10天的小苗直接用尺量。种子大小每株量取30粒，每10粒用游标卡尺量。结实率每株取3个主穗，数总 颖花数和实粒数，计算结实率。剑叶夹角的测量是将主穗所在的分蘖从水稻母体取出，用量角器测量剑叶 叶片和叶鞘之间的夹角。根性的观察是将野生型和突变体的种子种在普通的1/2MS培养基(加0.6％琼脂 粉，pH5.8)上，待根长出，即可观察。根据考种的数值计算平均值，做t测验计算P值，结果见表1，图 1。

2.细胞大小和数目的比较

采用半薄切片的方法在花药的最长处纵切，见图4。

半薄切片的具体方法是：

所需材料适量取到已盛有FAA固定液(含有50％乙醇，5％乙酸和3.7％甲醛的水溶液)的玻璃小瓶中。用 真空泵缓慢抽气，放气，待样品沉到瓶底。室温放置16小时后开始脱水。脱水梯度分别为：70％乙醇，85％ 乙醇，95％乙醇(伊红)，100％乙醇，100％乙醇，室温下每级30分钟。脱水后的材料用包埋剂Technovit 7100 树脂(购自德国Heraeus Kulzer公司)包埋(操作按照试剂盒说明书进行)，50℃放置3-5天后，包埋块作半 薄切片(2微米，切片机型号为LEICA EM UC6，方法参考仪器使用说明)。材料用甲苯胺蓝染色(0.1％， PH7.0，试剂购自AMRESCO公司)，显微镜观察，拍照(Leica DFC480显微镜)。

实施例3：用油菜素内酯处理野生型和突变体，记录它们对油菜素内酯应答的不同

1.胚芽鞘伸长实验：

配制胚芽鞘培养基(1/2MS培养基，加不同浓度梯度的植物激素表油菜素内酯(购自sigma公司，货号E1641， Epibrassinolide)，0.6％琼脂粉，pH5.8)。表油菜素内酯使用浓度为：0，0.1μM和1μM。将成熟的野生型(WT) 和突变体(xiao)种子去壳，用0.15％氯化汞(HgCl₂)消毒15分钟，灭菌水洗种子4-5次；然后放在培养 基上发芽，温度26±1℃。暗室培养7天后统计(图5A，B)。

2.根卷曲实验

配制根卷曲培养基(1/2MS培养基，加不同浓度梯度的植物激素表油菜素内酯(购自sigma公司，货号E1641， Epibrassinolide)，0.6％琼脂粉，pH5.8)。表油菜素内酯使用浓度为：0和0.01μM。将培养基煮化，添加表油 菜素内酯后倒入方皿，超净台上吹干，冷却。将成熟的野生型(WT)和突变体(xiao)种子去壳，用0.15％ 氯化汞(HgCl₂)消毒15分钟，灭菌水洗种子4-5次。将消毒后的种子接种在培养基上，平皿倾斜45°，温 度26±1℃，培养5天统计拍照(图5C)。

实施例5：用Realtime PCR方法检测细胞周期基因在野生型和突变体中的表达量

实验材料：野生型和突变体幼穗等长并小于2厘米。

试验试剂和方法：使用invitrogen公司的Trizol试剂盒提取RNA。RNA提取方法按照试剂盒提供的方 法进行。RNA反转录是使用invitrogen公司的DNase I和SuperScript^TMIII反转录酶，方法按照试剂盒提供 的方法进行。Realtime PCR使用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq试剂盒并按其提供的方法进行。做 Realtime PCR的机器是Applied Biosystems公司的7500 real-time PCR system。实验结果是突变体xiao中 MCM3(LOC_Os05g39850)，CYCIaZm(LOC_Os01g59120)和CYCB2(LOC_Os04g47580)表达量低于野生 型WT(图7)。

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