氮杂环化合物在制备抑制淀粉样多肽毒性的药物中的用途

摘要

本发明公开了氮杂环化合物在制备用于抑制淀粉样多肽毒性的药物中的用途。具体来说，本发明公开了氮杂环化合物在制备用于抑制淀粉样多肽对神经细胞毒害作用的药物或抑制剂中的用途。此外，还提供了氮杂环化合物在制备治疗和/或预防淀粉样变相关疾病的药物中的用途，为治疗淀粉样变相关疾病的药物的开发提供了一条新思路。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体地说，本发明涉及一种实现抑制淀粉样多肽毒性的调节剂及其应用。

背景技术

众所周知，淀粉样多肽的错误折叠和异常组装行为与大概30多种人类疾病的发病机制相关，其中Beta-淀粉样多肽的聚集与阿尔茨海默氏病相关。目前的一些报道显示，淀粉样多肽通过聚集形成的寡聚体、原纤维、纤维等都对神经细胞有毒害，而越来越多的研究表明，与由淀粉样多肽形成的纤维相比，在脑皮层中的可溶性β淀粉样多肽单体和由该单体形成的寡聚体可能会对脑神经细胞的突触造成更严重的损伤(可参考Klein，W.L.等人，Neurochemistry International 2002，41，345；Lambert，M.P.，Klein，W.L.等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 1998，95，6448.；Selkoe，D.J.，Nature 2003，426，900.)。

根据上述对多肽聚集体毒性的研究可知，如果要抑制淀粉样多肽的毒性，我们必须找到有效的方法来调控淀粉样多肽的聚集。目前的研究主要集中在以下两个方面：1)通过加入小分子调节剂(如刚果红和硫磺素T及其衍生物等)和多肽调节剂(如NH₂-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-COOH)与淀粉样多肽发生相互作用来抑制淀粉样多肽聚集，进而起到抑制淀粉样多肽毒性的效果；2)通过引入一种由多肽调节剂与有机分子共价形成的化合物来解聚已形成的淀粉样多肽的聚集体，进而达到抑制淀粉样多肽毒性的目的。

上述报道的两种抑制淀粉样多肽毒性的方法均从抑制多肽聚集的角度来实现对淀粉样多肽神经毒性抑制的效果，目前尚未有利用其它作用机理抑制淀粉样多肽毒性的方法。

发明内容

有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的含义。

除非另外说明，本文中的“调节剂”或“调节剂分子”指的是用于调节淀粉样多肽聚集行为的氮杂环化合物。

除非另外说明，本文中的“聚集体”指的是：淀粉样多肽自聚集形成的单组分聚集体；“共聚集体”指的是淀粉样多肽或者淀粉样多肽的片段与调节剂分子共聚集形成的多组分聚集体。

除非另外说明，本文中的“淀粉样多肽”指的是淀粉样多肽以及淀粉样多肽的片段。

针对现有技术的不足，本发明期望提供一种抑制淀粉样多肽毒性的新思路和新方法。因此，本文的一个目的是提供调节剂在制备用于抑制淀粉样多肽对神经细胞毒害作用的药物中的用途。本文的另一个目的是提供该调节剂在制备淀粉样多肽对神经细胞毒害作用的抑制剂中的用途。此外，本发明的又一个目的是提供该调节剂在制备治疗和/或预防与淀粉样变有关的疾病药物中的用途。

用于实现上述目的的技术方案如下：

一方面，本发明提供氮杂环化合物在制备用于抑制淀粉样多肽对神经细胞毒害作用的药物中的用途。

另一方面，本发明提供氮杂环化合物在制备淀粉样多肽对神经细胞毒害作用的抑制剂中的用途。

又一方面，本发明提供氮杂环化合物在制备治疗和/或预防与淀粉样变相关的疾病的药物中的用途。优选地，所述疾病为与淀粉样多肽聚集有关的疾病；更优选地，所述疾病选自阿尔茨海默氏病、2型糖尿病、亨廷顿氏病、帕金森氏病、牛海绵状脑病和克罗伊茨费尔特-雅各布氏病中的一种或多种。

在上述用途中，所述淀粉样多肽对神经细胞的毒害作用是由淀粉样多肽的错误折叠和/或异常组装造成的；优选地，所述淀粉样多肽对神经细胞的毒害作用是由淀粉样多肽的聚集造成的。

所述淀粉样多肽可以选自β-淀粉样多肽1-42、β-淀粉样多肽1-40、β-淀粉样多肽1-28以及这些淀粉样多肽的片段中的一种或多种；优选地，所述淀粉样多肽为β-淀粉样多肽10-20。

所述氮杂环化合物包括但不限于嘧啶、吡嗪、咪唑、吡咯、吡啶化合物中的一种或多种，优选为吡啶化合物，例如4，4’-联吡啶、1，2-二(4-吡啶基)乙烯和三联吡啶中的一种或多种；进一步优选的氮杂环化合物为4，4’-联吡啶和/或1，2-二(4-吡啶基)乙烯；最优选的氮杂环化合物为1，2-二(4-吡啶基)乙烯。

所述嘧啶化合物可以选自嘧啶(1，3-二嗪)，5-甲氧基-嘧啶，2，6-二羟基嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，尿嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶核苷，胞嘧啶核苷，尿嘧啶核苷，腺嘌呤核苷，鸟嘌呤核苷，胸腺嘧啶脱氧核苷，胞嘧啶脱氧核苷，尿嘧啶脱氧核苷，腺嘌呤脱氧核苷，鸟嘌呤脱氧核苷，胸腺嘧啶核苷酸，胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核苷酸，腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核苷酸，胸腺嘧啶脱氧核苷酸，胞嘧啶脱氧核苷酸，尿嘧啶脱氧核苷酸，腺嘌呤脱氧核苷酸，鸟嘌呤脱氧核苷酸中的一种或多种；

所述吡嗪化合物可以选自吡嗪(1，4-二嗪)，四甲基吡嗪(川芎嗪)，3-异丁基-2-甲氧基-吡嗪和3-异丙基-2-甲氧基-吡嗪中的一种或多种；

所述咪唑类化合物可以为咪唑和/或N-甲基咪唑；

所述吡咯类化合物可以选自吡咯，N-甲基吡咯烷酮，聚乙烯吡咯烷酮，四氢吡咯，N-乙烯基吡咯烷酮，2，5-二甲基吡咯和3-吡咯啉中的一种或多种。

以下是本发明的详细描述：

为了获得本发明的技术方案，本发明进行了以下几个方面的探索和研究：

1)将淀粉样多肽分子进行聚集，获得多肽分子聚集体的扫描隧道显微镜图像；

所述聚集体的制备方法包括如下步骤：

i)将所述淀粉样多肽分子制成溶液；

ii)将步骤i)得到的溶液滴加到导电性基底，例如石墨，金、银、铜、铂等金属基底以及硅等半导体基底表面，以形成聚集体。

其中，多肽分子形成聚集体，除去溶剂在固/气界面获得聚集体的扫描隧道显微镜图像。

2)将淀粉样多肽分子和调节剂分子进行聚集，以获得调节剂分子和多肽分子共聚集体的扫描隧道显微镜图像；

所述共聚集体的制备方法包括如下步骤：

i)将所述多肽分子与调节剂分子充分混合，形成混合液；

ii)将步骤i)得到的混合液滴加到导电性基底，例如石墨，金、银、铜、铂等金属基底以及硅等半导体基底表面，以形成共聚集体。

其中，多肽分子和调节剂分子形成共聚集体，除去溶剂在固/气界面获得共聚集体的扫描隧道显微镜图像。

3)获得步骤1)中多肽分子聚集体的原子力显微镜图像；

4)获得步骤2)中调节剂分子和多肽分子结合后形成的共聚集体的原子力显微镜图像；

在制备聚集体和共聚集体中，采用超声来充分混合。所述导电性基底为石墨，优选为新解理的高定向石墨。高定向石墨具有原子级平整的表面，而且在很多环境中都很稳定，适于扫描隧道显微镜和原子力显微镜的研究。

此外，在制备聚集体和共聚集体中，还包括除去基底表面残留液的步骤，可以采用吹惰性气体(例如氮气)的方式来除去所述基底表面的残留液。

5)利用光散射技术测试淀粉样多肽分子在溶液中的聚集行为。

所述淀粉样多肽光散射样品的制备方法包括如下步骤：

i)将所述淀粉样多肽分子制成0.1μM溶液；

ii)将i)中所述的淀粉样多肽溶液放入标准的石英池中，在荧光光谱仪中进行测试。测试选取特定条件，通过测试发射光强度反映溶液中多肽的聚集程度。

6)利用光散射技术测试调节剂分子在溶液中对淀粉样多肽分子聚集行为的调控效果。

所述淀粉样多肽和调节剂分子混合物光散射样品的制备方法包括如下步骤：

i)将所述淀粉样多肽分子和调节剂分子的混合溶液制成0.1μM溶液；

ii)将i)中所述的淀粉样多肽和调节剂分子的混合溶液放入标准的石英池中，在荧光光谱仪中进行测试。测试选取特定条件，通过测试发射光强度反映溶液中多肽的聚集程度。

所述荧光光谱仪为PerkinElmer LS55；所述石英池子长度为1cm；所述测量条件为测试时激发光和检测的发射光波长均为400nm。使用时间驱动模式，光谱的带宽设置为1nm，狭缝宽度为2.5nm。光散射的强度值为测试15s中强度的平均值。整体测试使用衰减模式。

7)利用细胞毒性测试实验检测淀粉样多肽的细胞毒性。

所述淀粉样多肽细胞毒性测试的样品制备方法包括如下步骤：

i)将所述淀粉样多肽分子分别制成100μM、500μM、1mM和2mM的溶液；

ii)将i)中所述的淀粉样多肽溶液各取10μL加入到培养好的神经肿瘤细胞中，经过48小时的孵育后，利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来测试神经肿瘤细胞的存活率，通过存活率判断淀粉样多肽对神经肿瘤细胞损伤的程度。

8)利用细胞毒性测试实验检测调节剂分子和淀粉样多肽混合溶液的细胞毒性来判定调节剂分子对淀粉样多肽毒性的抑制效果。

所述淀粉样多肽和调节剂分子混合溶液的细胞毒性测试的样品制备方法包括如下步骤：

i)将所述淀粉样多肽分子和调节剂分子制成100μM和500μM的混合溶液；

ii)将i)中所述的淀粉样多肽和调节剂分子的混合溶液各取10μL加入到培养好的神经肿瘤细胞中，经过48小时的孵育后，利用酶标仪测试细胞样品的吸光度值来测试加入混合溶液的神经肿瘤细胞的存活率，通过存活率判断调节剂分子对淀粉样多肽神经毒性的抑制效果。

优选地，所述淀粉样多肽分子为β-淀粉样多肽10-20(Aβ10-20)，其它淀粉样多肽也可以使用，如β-淀粉样多肽33-42(Aβ33-42)，β-淀粉样多肽1-42(Aβ1-42)，β-淀粉样多肽1-40(Aβ1-40)，β-淀粉样多肽1-28(Aβ1-28)等。优选地，淀粉样多肽分子为β-淀粉样多肽10-20(Aβ10-20)。

优选地，所述调节剂分子为嘧啶、吡嗪、咪唑、吡咯、吡啶类氮杂环分子及其衍生物，例如4，4’-联吡啶、1，2-二(4-吡啶基)乙烯，三联吡啶、嘧啶等，优选地，所述调节剂分子为4，4’-联吡啶或1，2-二(4-吡啶基)乙烯。

优选地，所述嘧啶类分子及其衍生物为嘧啶(1，3-二嗪)，5-甲氧基-嘧啶，2，6-二羟基嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，尿嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶核苷，胞嘧啶核苷，尿嘧啶核苷，腺嘌呤核苷，鸟嘌呤核苷，胸腺嘧啶脱氧核苷，胞嘧啶脱氧核苷，尿嘧啶脱氧核苷，腺嘌呤脱氧核苷，鸟嘌呤脱氧核苷，胸腺嘧啶核苷酸，胞嘧啶核苷酸，尿嘧啶核苷酸，腺嘌呤核苷酸，鸟嘌呤核苷酸，胸腺嘧啶脱氧核苷酸，胞嘧啶脱氧核苷酸，尿嘧啶脱氧核苷酸，腺嘌呤脱氧核苷酸或鸟嘌呤脱氧核苷酸；

优选地，所述吡嗪类分子及其衍生物为吡嗪(1，4-二嗪)，四甲基吡嗪(川芎嗪)，3-异丁基-2-甲氧基-吡嗪或3-异丙基-2-甲氧基-吡嗪；

优选地，所述咪唑类分子及其衍生物为咪唑或N-甲基咪唑；

优选地，所述吡咯类分子及其衍生物为吡咯，N-甲基吡咯烷酮，聚乙烯吡咯烷酮，四氢吡咯，N-乙烯基吡咯烷酮，2，5-二甲基吡咯或3-吡咯啉。

所述的神经肿瘤细胞为SH-SY5Y细胞，作为神经细胞的模型体系。根据淀粉样多肽的不同，可以选择相应的细胞系验证其毒性抑制效果。

综上所述，本发明的目的在于发展一种抑制淀粉样多肽毒性的新方法，通过加入调节剂在分子水平上调控淀粉样多肽的组装结构，加速淀粉样多肽的聚集，从而抑制淀粉样多肽的毒性。

本发明的一个实施方案利用扫描隧道显微技术观察，引入调节剂分子调控淀粉样多肽的聚集结构，利用光散射技术测试调节剂分子加速多肽聚集的效果，利用神经细胞毒性测试检测调节剂分子对淀粉样多肽毒性的抑制效果。具体包括如下步骤：

1)制备多肽分子溶液，超声30秒钟；

2)在多肽分子的溶液中，加入调节剂分子，使其充分混合；

3)混合之后，将多肽溶液和多肽与调节剂分子共混的溶液各取15微升分别滴在两块新解理的高定向石墨表面，静置5分钟；

4)用高纯氮气把残留在石墨表面的溶液吹走；

5)用扫描隧道显微镜观测，分别观察淀粉样多肽的聚集结构和调节剂分子与多肽分子的共聚集结构，通过观察分析，得到两者的聚集结构差异。

6)用原子力显微镜来观察上述5)中提到的两个样品聚集体形貌的差异。

7)用光散射技术检测0.1μM淀粉样多肽在溶液中的聚集行为，以及相同浓度调节剂分子加入后对淀粉样多肽聚集的影响。

8)用神经细胞毒性测试方法检测淀粉样多肽的神经细胞毒性以及调节剂分子对多肽神经毒性的抑制。

本发明的有益效果在于，与目前的现有的两种抑制淀粉样多肽毒性的方法(通过抑制淀粉样多肽聚集或者解聚已形成的淀粉样多肽聚集体)不同，本发明根据成熟纤维和斑块状大聚集体毒性较低甚至无毒的研究结果，发展了一种实现淀粉样多肽毒性抑制的新方法，即采用一种调节剂分子即氮杂环分子及其衍生物来加速淀粉样多肽的聚集，反而抑制了其对神经细胞的毒害作用，并进而提供了氮杂环分子及其衍生物在制备用于抑制淀粉样多肽分子对神经细胞毒害作用的药物和/或抑制剂中的用途，以及在制备治疗和/或预防淀粉样变性病的药物方面的用途。此外，本发明还具有以下几个技术效果：

第一、本发明利用扫描隧道显微技术在分子水平上观察到了调节剂分子对淀粉样多肽聚集结构的调控，在分子水平上提供了调节剂分子与多肽相互作用的位点，可以使人们清楚地了解调节剂分子调控多肽聚集的机理。

第二、本发明利用原子力显微技术揭示了调节剂分子对淀粉样聚集体形貌的影响，并结合光散射技术进一步提供了调节剂分子加速多肽聚集的信息，发现了一种新的调控多肽聚集的方法。

第三、本发明通过加速多肽聚集的方法来抑制淀粉样多肽的毒性，可以为治疗淀粉样变药物的开发提供了一条新思路。

第四、本发明可以在分子水平上揭示分子与淀粉样多肽的相互作用，为研究药物分子与淀粉样多肽相互作用机理，提供了有效方法。并可以利用此方法为评判调节剂分子对淀粉样多肽神经毒性抑制效果，进而用于药物前体的筛选以及为药物分子的设计提供了指导。

附图说明

图1是淀粉样多肽Aβ10-20聚集体的扫描隧道显微镜图像和对其观察到的多肽长度的统计结果；

图2是调节剂分子与淀粉样多肽Aβ10-20形成共聚集结构的扫描隧道显微镜图像，其中，a为淀粉样多肽Aβ10-20与调节剂分子4，4’-联吡啶形成的共聚集体的扫描隧道显微镜图像，b为淀粉样多肽淀粉样多肽Aβ10-20与调节剂分子1，2-二(4-吡啶基)乙烯形成的共聚集体的扫描隧道显微镜图像，图2a和图2b下方分别是所对应的两种调节剂分子的结构式和多肽/调节剂共聚集体的示意图。

图3是淀粉样多肽以及调节剂分子与淀粉样多肽共同聚集后形成的聚集体形貌的原子力显微镜图像。a为淀粉样多肽Aβ10-20聚集体的原子力显微镜图像；b为淀粉样多肽Aβ10-20与调节剂分子4，4’-联吡啶共聚集后形成共聚集体的原子力显微镜图像；c为淀粉样多肽Aβ10-20与调节剂分子1，2-二(4-吡啶基)乙烯共聚集后形成共聚集体的原子力显微镜图像；

图4是调节剂分子在溶液中加速淀粉样多肽聚集的光散射结果图。a为4，4’-联吡啶调节剂加速淀粉样多肽Aβ10-20聚集的光散射结果，b为1，2-二(4-吡啶基)乙烯调节剂加速淀粉样多肽Aβ10-20聚集的光散射结果；

图5是淀粉样多肽Aβ10-20的神经细胞毒性以及调节剂分子对淀粉样多肽Aβ10-20神经毒性的抑制效果图。a为淀粉样多肽Aβ10-20不同浓度新鲜溶液和孵育形成成熟聚集体的神经细胞毒性结果；b为在10和50μM的浓度下，调节剂4，4’-联吡啶和1，2-二(4-吡啶基)乙烯抑制淀粉样多肽Aβ10-20神经毒性的结果；c为调节剂分子对神经细胞毒性的测试结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的描述。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。其中：

淀粉样多肽购买于美国多肽公司；

调节剂分子4，4’-联吡啶(4，4’-bipyridyl，DP)购买于阿法埃莎(天津)化学有限公司；

调节剂分子1，2-二(4-吡啶基)乙烯(1，2-di(4pyridyl)ethylene，DPE)购买于美国西格玛奥德里奇公司；

SH-SY5Y神经胶质瘤细胞(以下简称神经细胞)购买于北京协和医院；

CCK-8试剂盒购买于日本同仁化学研究所。

实施例1基于扫描探针显微镜来观察淀粉样多肽聚集结构、聚集体形貌以及调节剂分子对多肽聚集结构的调控和对聚集体形貌的影响

1、所使用物质的化学结构

多肽分子(Aβ10-20)，4，4’-联吡啶分子(DP)和1，2-二(4-吡啶基)乙烯分子(DPE)的化学结构，如下图所示：

β-淀粉样多肽10-20(Aβ10-20)

4，4’-联吡啶(4，4’-bipyridyl，DP)

1，2-二(4-吡啶基)乙烯(1，2-di(4pyridyl)ethylene，DPE)

2、具体方法

1)先将多肽分子(Aβ10-20)分别和吡啶类分子DP、DPE混合于水溶液中，超声1分钟，充分混合之后，取出15微升溶液，滴到新解理的石墨表面，静置10分钟，使混合分子体系在石墨上形成聚集体并沉积在表面上之后，再用高纯氮气吹干。

利用商品化的多模式扫描探针显微镜(SPM，Nanoscope IIIa型，Veeco公司，美国)，实验条件为大气下恒电流模式，对多肽、多肽/DP或多肽/DPE体系分别进行高分辨扫描隧道显微镜(STM)成像(如图1和2所示)；

图1(a)是Aβ10-20在HOPG表面聚集结构的STM图像。我们发现Aβ10-20聚集体的结构特征为片层结构，条陇聚集体，每条多肽链垂直于条陇的中轴。通过测量，我们得到相邻两条多肽链间的距离为0.45±0.01nm，这个距离与形成β折叠结构的多肽链间距相吻合。(a)中的右上角插图为Aβ10-20聚集结构的高分辨STM图像。我们对所观察到的多肽链的长度进行测量，具体的测量结果如图1(b)所示，高斯统计数据给出的信息显示，Aβ10-20的测量长度大概为3.15-3.50nm或3.50-3.85nm，大约为由10或11个氨基酸组成的多肽链的长度。考虑到测量误差和多肽的端基尺寸，我们推断通过STM试验测量得到的Aβ10-20的多肽链长与理论上的长度基本一致。

图2(a)是Aβ10-20/DP聚集结构的STM图像，从图像中我们可以看出Aβ10-20/DP的聚集体依然形成片层结构，Aβ10-20仍以条陇结构存在，而DP分子伴随在Aβ10-20的陇间，与Aβ10-20相互作用。Aβ10-20/DP聚集结构的高分辨图像如图2(a)右上方所示。Aβ10-20与DP分子相互作用的模型示意图如图2(a)下方所示。通过得到的STM试验结果，我们可以得知，多肽羧基端的COOH基团与DP分子中N原子形成的分子间氢键驱动了Aβ10-20/DP聚集体的形成。试验中，我们测量得到的Aβ10-20长度为3.50nm，考虑到端基的羧基和胺基尺寸，此多肽测量的长度基本与理论长度相吻合。

图2(b)为Aβ10-20/DPE聚集结构的STM图像。高分辨的聚集结构图像如图2(b)的右上方所示，多肽与DPE分子相互作用的模型示意图列于图2(b)下方。利用DPE调控多肽聚集时，一个DPE分子与两个Aβ10-20分子相互作用；而利用DP分子调控Aβ10-20聚集时，一个DP分子只与一个Aβ10-20分子相互作用。与DP分子结构相比，DPE多一个乙烯基团，这将导致DPE分子中的两个吡啶基团处于反式构象的位置。这种分子构型上的差别导致了两种调节剂分子对Aβ10-20产生了不同的调节效果。

利用商品化的多模式扫描探针显微镜(SPM，Nanoscope IIIa型，Veeco公司，美国)，实验条件为室温大气下的轻敲模式，对多肽、多肽/DP或多肽/DPE体系分别进行原子力显微镜(AFM)成像(如图3所示)；

图3(a)为Aβ10-20的聚集体形貌，此多肽形成纤维结构。当调节剂分子被引入后，我们发现Aβ10-20原本成熟的纤维结构消失，取而代之形成的是一些短棒和短纤维。具体如图3(b)和(c)所示。图(b)为DP分子调节的多肽聚集体形貌，图(c)为DPE分子调节的多肽聚集体形貌。由于多肽聚集结构的改变，势必会影响其进一步的聚集。此结果证明，调节剂分子可以影响多肽聚集体形貌。

2)利用光散射技术测试调节剂加速淀粉样多肽聚集的效果。

利用PerkinElmer LS55荧光光谱仪。在室温下，测试石英池长度为1cm，试验中的激发光和检测的发射光波长均为400nm。使用时间驱动模式，光谱的带宽设置为1nm，狭缝宽度为2.5nm。光散射的强度值为测试15s中强度的平均值。整体测试使用衰减模式。得到的光散射结果(如图4所示)；

图4(a)和(b)中黑色曲线为Aβ10-20在溶液中的聚集动力学行为。当DP和DPE分子被引入后，它们明显地加速了多肽Aβ10-20的聚集，如图(a-b)红色曲线所示，调节剂有效地调控了多肽的聚集动力学行为。这种调控源于多肽的聚集结构被调制，调节剂通过与多肽的C端形成分子间氢键，改变了多肽的聚集结构，这将加速多肽的聚集。

实施例2利用神经细胞毒性测试方法检测淀粉样多肽Aβ10-20神经毒性和调节剂对淀粉样多肽神经毒性的抑制

将SH-SY5Y细胞接种于96孔板中(购于Greiner Bio-One Inc.，Longwood，FL，USA)，每孔100μL细胞培养液，放于孵箱中37℃下培养。待细胞大约有40％贴壁，且状态良好时，可向细胞培养液内加入淀粉样多肽、调节剂分子及其混合体系，进行细胞毒性测试。细胞浓度约为10000个/孔。

首先制备Aβ10-20、Aβ10-20/DP、Aβ10-20/DPE、DP、DPE等溶液，其最终浓度分别为：

Aβ10-20：10μM，50μM，100μM和200μM；

Aβ10-20/DP和Aβ10-20/DPE：各为10μM和50μM，多肽和调节剂分子的浓度比为1∶1；

DP和DPE：各为10μM，50μM，100μM和200μM。

然后将Aβ10-20、Aβ10-20/DP、Aβ10-20/DPE、DP、DPE等溶液分别加入细胞培养液内，作用48小时后，测试细胞存活率。我们采用WST-8细胞存活试验(Morita，Y.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，5405；Takeda，K.等，J.Biol.Chem.2000，275，9805)，检验多肽的毒性以及多肽调节剂分子对多肽毒性的抑制效果。WST-8细胞存活试验中，主要应用CCK-8试剂进行简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8(其化学名称为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料(Formazan dye)。生成的甲瓒产物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。细胞存活率利用酶标仪进行吸光度值(OD值)的测试，OD值越高，细胞存活越多。加入CCK-8后，3-4小时内进行测试，测试波长为450nm，参比波长为600nm。

数据分析方法：每次试验平行测试三次，试验结果为三次试验的平均值，数据记录为平均值±误差值。数据统计分析使用SPSS专业统计分析软件(SPSS，Chicago)，利用配对样品t-检验。当P＜0.05时，视为有差异，P＜0.01时视为有显著差异。

图5(a)为不同浓度的淀粉样多肽Aβ10-20的新配制溶液(以下简称新鲜溶液)对神经细胞的毒害，通过比较不同浓度时神经细胞存活率来反映淀粉样多肽Aβ10-20的神经毒性。结果显示，随浓度的增加，淀粉样多肽新鲜溶液的细胞毒性逐渐增强。而孵育120小时后形成聚集体的淀粉样多肽Aβ10-20(以下简称聚集体溶液)的细胞毒性一定程度上得到抑制。将淀粉样多肽聚集体溶液加入细胞培养液中，随后进行细胞存活率的检测，检测结果发现：与对照组实验相比，含有聚集体溶液的体系中，细胞存活率依然很高；而在相同浓度的淀粉样多肽新鲜溶液存在下，细胞存活率相对较低。此实验结果说明：淀粉样多肽的新鲜溶液对神经细胞具有较强的损伤，而以大量聚集体形式存在的淀粉样多肽对细胞的损伤相对较小。

图5(b)为在10μM和50μM的浓度下，调节剂DP和DPE对淀粉样多肽Aβ10-20神经毒性的抑制结果。结果证明调节剂可以有效地抑制淀粉样多肽的神经毒性，并且DPE的效果优于DP。

图5(c)为调节剂分子对神经细胞损伤的测试结果。结果显示，DP的神经毒性要强于DPE分子。因此，DPE可能成为较好的淀粉样多肽神经毒性抑制剂。

通过对细胞神经毒性的测试，我们得到调节剂可以有效抑制淀粉样多肽的神经毒性。