一种环孢素A肺吸入大孔微球及其制备方法

摘要

本发明公开了一种环孢素A肺吸入大孔微球及其制备方法，所述环孢素A肺吸入大孔微球的组成重量份为环孢素A1-3份、壳聚糖衍生物1-10份、β-环糊精或其衍生物0.5-5份、致孔剂0.5-5份，所述的环孢素A肺吸入大孔微球的粒径在1-10μm，制备方法主要是过滤和喷雾干燥；本发明的优点在于：该肺吸入微球具有大孔的结构，可用于肺部给药，粒径在1-10μm之间，载药量为5.28-7.28%，包封率为0.85～1.19%，具有良好的生物相容性，能够减轻气道黏膜的刺激性，使药物缓慢释放，可减少药物用量和副作用，尤其适用于干粉吸入剂以达到肺部给药的目的，制备方法操作简便、工艺稳定、易于工业化生产。

说明书

技术领域

本发明涉及一种肺部缓控释给药制剂，具体地说是一种环孢素A肺吸入大孔微球及其制备方法，属于肺部缓控释给药领域。

背景技术

肺部缓控释给药是近年发展起来的新型给药系统，微球沉积于肺部可以延缓药物的释放，增加药物疗效且可保护药物不受酶的水解；将药物包裹在制剂的内部，增大了药物的稳定性；能有效减少药物对呼吸道及肺部的刺激和毒性，已成为肺部控释给药载体研究的热点。但是，肺吸入给药要有良好的粉雾剂特性、有效的肺部沉积率、载体良好的安全性及降低肺部的清除率等，这些因素成为肺部缓控释给药的主要障碍，也是经历二十多年研究仍没有产品问世的主要原因。

环孢素A（CsA）为第三代选择性免疫抑制剂，主要用于器官或组织移植后排异反应的防治和自身免疫性疾病的治疗。环孢素可以选择性抑制T淋巴细胞，包括γ干扰素的产生、白介素2、6等细胞生长因子的释放均受到抑制，同时环孢菌素A对T细胞的激活作用呈现剂量依赖性，而环孢菌素A的局部应用已成为新的研究热点。研究表明环孢素A能够抑制同种异体肺移植的免疫排斥及闭塞性脉管炎，同时能提高肺功能。环孢素 A还能明显减少嗜酸性粒细胞在肺内和气道粘膜的浸润，减轻组织水肿及上皮损伤等气道炎症，小剂量环孢素A可以使激素抵抗型哮喘患者症状明显改善，同时可明显减少激素依赖型哮喘患者的激素用量，从而大大减少了糖皮质激素的副作用。

然而，环孢素A 口服制剂生物利用度低、个体差异大，全身给药后引起人体较严重的肾毒性及中枢神经系统毒性、肝毒性、消化道反应等严重的副作用而限制了应用。雾化吸入CsA可解决全身用药血中药物分布少，对肝、肾毒副作用大的缺点，但气道黏膜有刺激性而且因其脂溶性吸收不完全，开发长效肺吸入剂型成为克服这一问题的关键。

发明内容

为了解决上述问题，本发明设计了一种环孢素A肺吸入大孔微球及其制备方法，该肺吸入大孔微球具有大孔的结构，粒径在1-10μm之间，能够减轻气道黏膜的刺激性，使药物缓慢释放，减少副作用，尤其适用于干粉吸入剂以达到肺部给药的目的。

微球吸入肺部后呼吸道的纤毛运动可将吸入粒子在几小时内清除，未被纤毛运动清除的粒子可被肺泡内的巨噬细胞吞噬而有效转移，影响药物的肺部吸收。直径5 μm 以上、密度小于0.4 g/cm³ 的大孔微球载体给药系统应用于肺部给药，易在肺部沉积，不易被肺泡清除，且能使药物在肺部缓慢释放。制备载蛋白质和肽类的肺部微球给药系统，应用于肺部起局部或全身治疗的目的。

本发明的技术方案为：

一种环孢素A肺吸入大孔微球，由以下重量份的成分组成：

环孢素A：1-3份；

壳聚糖衍生物：1-10份；

β-环糊精或其衍生物：0.5-5份；

致孔剂：0.5-5份；

所述的环孢素A肺吸入大孔微球的粒径在1-10μm；

所述的壳聚糖衍生物为壳聚糖季铵盐；

所述的壳聚糖季铵盐为高、中、低分子量壳聚糖季铵盐中的一种；

所述的高分子量的壳聚糖季铵盐为分子量1360kDa或1100 kDa的壳聚糖季铵盐的一种；

所述的中分子量的壳聚糖季铵盐具为分子量450kDa或350kDa的壳聚糖季铵盐的一种；

所述的低分子量的壳聚糖季铵盐为分子量170kDa或50kDa的壳聚糖季铵盐的一种。

进一步地，所述的壳聚糖季铵盐的取代度为90%。

进一步地，所述的壳聚糖季铵盐的取代度为85%。

进一步地，所述的壳聚糖季铵盐的取代度为80%。

进一步地，所述的壳聚糖季铵盐的取代度为73%。

所述的β-环糊精衍生物为2-羟丙基-β-环糊精；

所述的致孔剂为碳酸氢铵、丙二醇嵌段聚醚、聚乙二醇、氯仿、聚苯乙烯球中的一种。

一种上述环孢素A肺吸入大孔微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）根据上述配比要求配制各组分的混合溶液，

其中：环孢素A 1-3 g/ml、壳聚糖衍生物1-10 g/ml、β-环糊精或其衍生物0.5-5 g/ml、致孔剂0.5-5 g/ml；

（2）将上述步骤（1）的混合溶液经0.45μｍ的微孔滤膜过滤，调节混合滤液质量浓度为0.5-1.5％；

（3）将上述步骤（2）的滤液经蠕动泵导入喷雾干燥器，进行喷雾干燥，制成粉末微球；喷雾干燥条件为：喷雾干燥进口温度为120-170℃，出口温度为80-100℃，喷嘴流速400-800L/H，进样速度5-25ml/min，气流量400-600 L/h；

（4）将上述步骤（3）得到的微球收集于干燥器，备用。

制得的环孢素A肺吸入大孔微球具有适宜的粒径，粒径在1-10μm之间，外观较圆整，粒径分布比较均匀，表面光滑，具有大孔结构，生物相容性良好。

本发明的优点在于：该肺吸入微球具有大孔的结构，可用于肺部给药，粒径在1-10μm之间，载药量为5.28-7.28%，包封率为0.85～1.19%，具有良好的生物相容性，能够减轻气道黏膜的刺激性，使药物缓慢释放，可减少药物用量和副作用，尤其适用于干粉吸入剂以达到肺部给药的目的，制备方法操作简便、工艺稳定、易于工业化生产。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1环孢素A肺吸入微球的形态图；

图2 环孢素A肺部给药的病理图（HE）。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。

实施例1

一种环孢素A肺吸入大孔微球，由以下成分制备而成：

环孢素A 1g；

壳聚糖衍生物1g；

β-环糊精0.5g；

致孔剂0.5g；

所述的壳聚糖季铵盐为分子量为1360kDa的高分子量的壳聚糖季铵盐，取代度为90%。

所述的致孔剂为碳酸氢铵。

上述环孢素A肺吸入大孔微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）根据上述配比要求配制各组分的混合溶液，称取真空干燥的β-环糊精，溶于200 mL的HTCC(分子量130万)蒸溜水，将碳酸氢铵溶于样品液中；

（2）经0.45 μｍ的微孔滤膜过滤，调节混合滤液质量浓度为0.5-1.5％；

（3）将过滤后的溶液经蠕动泵导入Büchi1290小型喷雾干燥器的双流向螺旋式喷嘴(直径0.7 mm)，控制气流量400 L/H，进风温度（进口温度）为120℃，出风温度（出口温度）为80℃，进样速度5ml/min，喷嘴流速400L/H，，喷雾干燥“一步”制成粉末微球；

（4）收集微球于盛有氯化钙的干燥器中放置72h，备用，结果见图1。

结果：该肺吸入微球具有大孔的结构，可用于肺部给药，粒径在1-10μm之间，平均粒径为9.2μm，载药量为5.28-7.28%，包封率为0.85～1.19%，具有良好的生物相容性。

实施例2

一种环孢素A肺吸入大孔微球，由以下成分制备而成：

环孢素A 2g；

壳聚糖衍生物5 g；

β-环糊精2.5 g；

致孔剂2.5 g；

所述的壳聚糖衍生物为壳聚糖季铵盐；

所述的壳聚糖季铵盐为分子量为1100kDa的高分子量的壳聚糖季铵盐，取代度为90%。

所述的致孔剂为丙二醇嵌段聚醚（F68）。

上述环孢素A肺吸入大孔微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）根据上述配比要求配制各组分的混合溶液，称取真空干燥的β-环糊精，溶于200 mL的HTCC(分子量130万)蒸溜水，将F68溶于上述配制好的混合溶液中；

（2）经0.45 μｍ的微孔滤膜过滤，调节混合滤液质量浓度为0.5-1.5％；

（3）将过滤后的溶液经蠕动泵导入Büchi290小型喷雾干燥器的双流向螺旋式喷嘴(直径0.7 mm)，控制气流量450 L/H，进风温度为130℃，出风温度为85℃，进样速度10ml/min，喷嘴流速500L/H，喷雾干燥“一步”制成粉末微球；

（4）收集微球于盛有氯化钙的干燥器中放置72h，备用，结果见图1。

结果：该肺吸入微球具有大孔的结构，可用于肺部给药，粒径在1-10μm之间，平均粒径为7.5μm，载药量为5.28-7.28%，包封率为0.85～1.19%，具有良好的生物相容性。

实施例3

一种环孢素A肺吸入大孔微球，由以下成分制备而成：

环孢素A  3g；

壳聚糖衍生物 10g；

β-环糊精衍生物5g；

致孔剂 5g；

所述的壳聚糖衍生物为壳聚糖季铵盐；

所述的壳聚糖季铵盐为分子量为450kDa的中分子量的壳聚糖季铵盐，取代度为85%。

所述的β-环糊精衍生物为2-羟丙基-β-环糊精（Hp-β-CD）；

所述的致孔剂为聚乙二醇。

上述环孢素A肺吸入大孔微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）根据上述配比要求配制各组分的混合溶液，称取真空干燥的Hp-β-CD，溶于200 mL的HTCC(分子量130万)蒸溜水，将聚乙二醇溶于上述配制好的混合溶液中；

（2）经0.45 μｍ的微孔滤膜过滤，调节混合滤液质量浓度为0.5-1.5％；

（3）将过滤后的溶液经蠕动泵导入Büchi290小型喷雾干燥器的双流向螺旋式喷嘴(直径0.7 mm)，控制气流量500 L/H，进风温度为140℃，出风温度为90℃，进样速度15ml/min，喷嘴流速600L/H，喷雾干燥“一步”制成粉末微球；

（4）收集微球于盛有氯化钙的干燥器中放置72 h，备用。

结果：该肺吸入微球具有大孔的结构，可用于肺部给药，粒径在1-10μm之间，平均粒径为5.3μm，载药量为5.28-7.28%，包封率为0.85～1.19%，具有良好的生物相容性。

实施例4

一种环孢素A肺吸入大孔微球，由以下成分制备而成：

环孢素A 2g/ml；

壳聚糖衍生物7 g/ml；

β-环糊精4 g/ml；

致孔剂3 g/ml；

所述的壳聚糖衍生物为壳聚糖季铵盐；

所述的壳聚糖季铵盐为分子量为170kDa的中分子量的壳聚糖季铵盐，取代度为80%。

所述的致孔剂为聚苯乙烯球。

上述环孢素A肺吸入大孔微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）根据上述配比要求配制各组分的混合溶液，称取真空干燥的β-环糊精，溶于200 mL的HTCC(分子量130万)蒸溜水，将聚苯乙烯球溶于上述配制好的混合溶液中；

（2）经0.45 μｍ的微孔滤膜过滤，调节混合滤液质量浓度为0.5-1.5％；

（3）将过滤后的溶液经蠕动泵导入Büchi290小型喷雾干燥器的双流向螺旋式喷嘴(直径0.7 mm)，控制气流量550 L/H，进风温度为160℃，出风温度为95℃，进样速度20ml/min，喷嘴流速700L/H，喷雾干燥“一步”制成粉末微球；

（4）收集微球于盛有氯化钙的干燥器中放置72 h，备用。

二、结果分析：

该肺吸入微球具有大孔的结构，可用于肺部给药，粒径在1-10μm之间，平均粒径为3.4μm，载药量为5.28-7.28%，包封率为0.85～1.19%，具有良好的生物相容性。

实施例5

一种环孢素A肺吸入大孔微球，由以下成分制备而成：

环孢素A  2g/ml；

壳聚糖衍生物 4g/ml；

β-环糊精衍生物 2g/ml；

致孔剂 2g/ml；

所述的壳聚糖衍生物为壳聚糖季铵盐；

所述的壳聚糖季铵盐为分子量为170kDa的中分子量的壳聚糖季铵盐，取代度为73%。

所述的β-环糊精衍生物为2-羟丙基-β-环糊精；

所述的致孔剂为氯仿。

上述环孢素A肺吸入大孔微球的制备方法，包括以下步骤：

（1）根据上述配比要求配制各组分的混合溶液，称取真空干燥的Hp-β-CD，溶于200 mL的HTCC(分子量130万)蒸溜水，将氯仿溶于上述配制好的混合溶液中；

（2）经0.45 μｍ的微孔滤膜过滤，调节混合滤液质量浓度为0.5-1.5％；

（3）将过滤后的溶液经蠕动泵导入Büchi290小型喷雾干燥器的双流向螺旋式喷嘴(直径0.7 mm)，控制气流量600 L/H，进风温度为170℃，出风温度为100℃，进样速度25ml/min，喷嘴流速800L/H，喷雾干燥“一步”制成粉末微球；

（4）收集微球于盛有氯化钙的干燥器中放置72 h，备用。

结果：该肺吸入微球具有大孔的结构，可用于肺部给药，粒径在1-10μm之间，平均粒径为1.2μm，载药量为5.28-7.28%，包封率为0.85～1.19%，具有良好的生物相容性。

实施例6

红细胞溶血试验

一、材料与方法

试验仪器：

台式离心机：上海安亭仪器制造厂；SHA-B恒温振荡器：国华企业；电子天平：Mettler-Toledo instr. (Shanghai) Ltd.；

二、试验方法

新鲜兔全血迅速与0.2%草酸钠以4:1的比例混合制备抗凝血液，用10 ml生理盐水稀释8 ml抗凝血备用。取1 ml上述血液加入1.25 ml 0.9%生理盐水，稀释备用。试验组、阴性对照、阳性对照各设三个平行样，其中阳性对照用2.5 ml蒸馏水，阴性对照用2.5 ml 0.9%生理盐水。取CsA/HTCC/Hp-β-CD大孔微球（MS B）的浸提液样品25 mg置于离心管中，加入2.5 ml 0.9%生理盐水（1%），37℃水浴中放置60 min，加入预热兔血50 μl，轻轻混匀，在37℃水浴中振动60 min，2000 r/min离心5 min，取上清移入比色杯中，用分光光度计在545 nm波长处测吸光度。溶血率（HR）用如下公式计算：

      （4-1）

其中Dt代表样品吸光值，Dnc代表阴性对照吸光值，Dpc代表阳性对照吸光值。

表1环孢素A肺吸入大孔微球的溶血率

三、结果与讨论

红细胞溶血试验反映了材料对血红细胞膜的损伤，被广泛认为是一种简单且可靠的评价生物材料相容性的手段，一般认为低于5%是安全的，也有认为低于10% 。环孢素A肺吸入大孔微球，在浓度为1%时溶血率皆低于5%，符合生物医用材料评定标准。 

实施例7

环孢素A肺吸入大孔微球的药效研究

一、材料及试剂

     选用6-8周BALB/C级小鼠40只，购置山东大学动物研究所，体重18-20g，同步饲养）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（美国R＆D公司），鸡卵蛋白GradeV级（Sigma公司），日本奥林巴斯BX51-32000显微镜，布地奈德混悬液（商品名：普米克令舒）。

二、试验方法

1、分组、致敏、激发及干预：按随机数字表法将小鼠分为阴性对照组、模型组、布地奈德组、环孢素A肺吸入大孔微球吸入组。模型组、布地奈德、环孢素A组于0，7，14天分别给予致敏液 0.2 mL（卵蛋白80 ug和Al (OH) 3 1mg），致敏后21天后雾化吸入1%卵蛋白10 mL激发，共计7天，引用30 min/d。每组激发前30分钟给予相应药物干预，分别给予2 mg布地奈德雾化吸入，环孢素A肺吸入大孔微球50 mg （相当于环孢素A 5 mg/kg）。

2、布地奈德、环孢素A肺吸入大孔微球吸入组用药方法：将2 mg布地奈德混悬液加生理盐水至10 mL后有雾化吸入器雾化吸入，约需30 min。环孢素A肺吸入大孔微球组用药参考改进Jatinder Kaur的干粉雾化吸入装置，用药量根据人和动物的体重来计算。

3、支气管肺泡灌洗液收集：最后1 次雾化吸入OVA 的24 h 后，0c 的生理盐水灌洗双肺3 次并收集支气管肺泡灌洗液（BALF），每次0. 8 ml，将BALF 离心并取上清，沉淀物加入20μL生理盐水，全自动血液分析仪计白细胞总数，剩余涂片染色，进行细胞分类计数。上清液-70℃冻存备用，测IL-4，TNF-α。肺组织置于10%中性甲醛溶液固定，待行HE 染色常规病理学检查。

4、IL-4，TNF-α细胞因子测定

  采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定BALF中的IL-4，TNF-α。其敏感度分别为5-200ng/L，20-800ng/L。

5、统计学处理

采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，组内比较采t检验。

三、结果与讨论

1、小鼠肺组织病理学变化：试验结束后，模型组小支气管及伴行小血管周围大量炎症细胞浸润，以中性粒细胞和淋巴细胞为主，气道粘膜水肿甚至上皮脱落，杯状细胞增生。铵茶碱壳聚糖微球及布地奈德组可见支气管及肺组织结构基本正常，支气管管壁周围炎症细胞浸润明显减少，见图2。

2、BALF中细胞因子、细胞及总蛋白变化：模型组中的IL-4、TNF-α显著高于对照组，布地奈德组和环孢素A肺吸入大孔微球可显著降低模型组IL-4，TNF-α的升高，与正常组没有差别。模型组中的总蛋白、白细胞、嗜酸性粒细胞等显著高于对照组，布地奈德组上述指标较模型组均明显降低。环孢素A肺吸入大孔微球组单核巨噬细胞较其余各组升高(P<0.05)，嗜酸性细胞、总蛋白等与布地奈德组没有差别（表2、3）。

表2 BALF 中细胞分类计数比较（×107/L，±S）

表3  BALF 中细胞因子浓度（±S）

除非另有说明，本发明中所采用的百分数均为重量百分数。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。