人源化之单克隆抗体、其氨基酸序列与核苷酸序列与其用途

摘要

本发明提供一种人源化之单克隆抗体的氨基酸序列，包括：一轻链之可变区的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO：5的序列；以及一重链之可变区的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO：6的序列，其中该单克隆抗体与肿瘤坏死因子α结合。

说明书

【技术领域】

本发明系关于一种抗肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α) 的抗体，且特别关于一种具高度中和肿瘤坏死因子α之能力的人源化单克 隆抗体与及其可变区之序列。

【背景技术】

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)为前发炎细胞激素 (pro-inflammatory cytokine)，其主要由包括巨噬细胞与单核球的免疫系统细 胞所产生。肿瘤坏死因子α呈现为一同源三聚体(homotrimeric)蛋白质，于 其中各次单元最初被转译为一个26kDa之跨膜前驱物蛋白质。在肿瘤坏死 因子α转换酶(TNF-converting enzyme，TACE)于接近跨膜区域之位置进行切 割后，释出肿瘤坏死因子α之可溶三聚体形式，并经由与效应细胞(effector  cell)上之结构区分type I与type II肿瘤坏死因子受器(TNFRI与TNFRII) 结合而发挥其活性。

跨膜形式之肿瘤坏死因子α也以其独特之生物功能而被熟知，例如以 细胞-细胞接触的方式产生生物毒性活性与B细胞的多细胞株活化 (polyclonal B-cell activation)，(Mitoma et al.，2008)。已证明肿瘤坏死因子α 对于自体免疫过程具有特定影响，且已成为许多自体免疫疾病的关键治疗 标的(Feldmann，2001)。到目前为止，一些抗肿瘤坏死因子α之试剂，如 etanercept、adalimumab与infliximab已被美国食品及药物管理局(Food and  Drug Administration，FDA)所核准，且皆具有有效中和可溶形式之肿瘤坏死 因子α为作用之主要生理机制的能力。然而，这些对抗药对于跨膜形式之 肿瘤坏死因子α的结合功效并不同，其可能导致于临床疾病上的不同结果 (Taylor，2010)。例如，etanercept对于其中跨膜形式之肿瘤坏死因子α扮演 一关键角色的肉芽肿病(granulomatous disease)发病在临床上并无功效(2008， Mitoma)。因此，是否抗肿瘤坏死因子α试剂可与跨膜形式之肿瘤坏死因子 α结合对于引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent  cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、补体依赖性细胞毒作用 (complement-dependent cytotoxicity，CDC)、细胞凋亡与外至内讯号传递机制 而言为必要条件。

鼠科动物之单克隆抗体于临床实施上之主要阻碍为其可能在病患中引 起人类抗鼠科动物抗体(human anti-murine antibody，HAMA)反应(Owens and  Young，1994；Sandhu，1992；Schroffet al.，1985)。因此，为改善临床使用的效 能，已使用基因工程技术以将属于鼠科动物之氨基酸残基取代为人类对应 的氨基酸残基，并以减少于病患中之诱发致免疫原性(immunogenicity)的可 能性。

理想的抗体人源化应可维持抗体对抗原的专一性与亲和力，并尽可能 减低致免疫原性。到目前为止，对于抗体人源化已使用许多方式来进行， 例如由鼠科抗原结合可变区基因融合至人类抗体不变区所组成的嵌合抗体 (chimeric antibodies)为最早试图用以减少致免疫原性(Morrison et al.，1984)。 然而，嵌合抗体仍然产生非期望之抗可变区反应(Bruggemann et al.，1989)。 互补决定区段移植法(complementarity determining region gtafting， CDR-gtafting)为另一方式，其包含将啮齿类抗体之互补决定区段转移至人类 抗体的Fv支架(Fv framework，FR)。不幸的是，介于互补决定区段与的Fv 支架之间的接口严重妨碍与抗原的结合。最初的互补决定区段移植抗体倾 向于失去来源抗体所具有的结合亲和力，因此需要回复突变一些对于互补 决定区段结构而言为必须的鼠科支架氨基酸的额外工作。藉由可变区表面 重组(variable domain resurfacing)之人源化为可维持来源抗体之专一性与结 合亲和力的另一方式，经由将于鼠科Fv支架中暴露于表面之残基取代为一 般于人类抗体中发现之暴露于表面的残基，可减少抗体之致免疫原性 (Fontayne et al.，2006；Padlan，1991；Roguska et al.，1994；Staelens et al.，2006； Zhang et al.，2005)。虽然现今之分子生物技术可使改变氨基酸之方法更易实 行，然而，若无抗体之可靠计算机模型时，仍难以确认在溶剂中暴露于表 面上之残基。

【发明内容】

本发明提供一种人源化之单克隆抗体的氨基酸序列，包括：一轻链之 可变区的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO：1的序列；以及一重链之可变区 的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO：2的序列，其中SEQ ID NO：1之序列 与SEQ ID NO：2具有至少一取代，该取代选自下组：SEQ ID NO：1之第 10个氨基酸由异亮氨酸取代为羟丁氨酸、SEQ ID NO：1之第18个氨基酸 由赖氨酸取代为精氨酸、SEQ ID NO：2之第2个氨基酸由赖氨酸取代为谷 氨酰胺、SEQ ID NO：2之第10个氨基酸由色氨酸取代为亮氨酸、SEQ ID NO：2之第18个氨基酸由赖氨酸取代为精氨酸与SEQ ID NO：2之第41 个氨基酸由谷氨酸取代为甘氨酸，且其中该单克隆抗体与肿瘤坏死因子α 结合。

本发明提供另一种人源化之单克隆抗体的氨基酸序列，包括：一轻链 之可变区的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO：5的序列；以及一重链之可变 区的氨基酸序列，其包括SEQ ID NO：6的序列，其中该单克隆抗体与肿瘤 坏死因子α结合。

本发明也提供一种编码人源化之单克隆抗体的核苷酸序列，包括：一 编码轻链之可变区的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO：7的序列；以及一编 码重链之可变区的核苷酸序列，其包括SEQ ID NO：8的序列，其中该单克 隆抗体与肿瘤坏死因子α结合。

本发明又提供一种人源化之单克隆抗体，包括：一轻链，该轻链之可 变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO：1的序列；以及一重链，该轻链之可变 区的氨基酸序列包括SEQ ID NO：2的序列，其中SEQ ID NO：1之序列与 SEQ ID NO：2之序列具有至少一取代，该取代选自下组：SEQ ID NO：1 之第10个氨基酸由异亮氨酸取代为羟丁氨酸、SEQ ID NO：1之第18个氨 基酸由赖氨酸取代为精氨酸、SEQ ID NO：2之第2个氨基酸由赖氨酸取代 为谷氨酰胺、SEQ ID NO：2之第10个氨基酸由色氨酸取代为亮氨酸、SEQ ID NO：2之第18个氨基酸由赖氨酸取代为精氨酸与SEQ ID NO：2之第 41个氨基酸由谷氨酸取代为甘氨酸，其中该单克隆抗体与肿瘤坏死因子α 结合。

本发明另提供一种人源化之单克隆抗体，包括：一轻链，其中该轻链 之可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO：5的序列；以及一重链，其中该轻 链之可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO：6的序列，其中该单克隆抗体与 肿瘤坏死因子α结合。

本发明还提供一种人源化单克隆抗体用于中和跨膜型肿瘤坏死因子α 的用途，其中该人源化之单克隆抗体，包括：一轻链，其中该轻链之可变 区的氨基酸序列包括SEQ ID NO：5的序列；以及一重链，其中该轻链之可 变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO：6的序列，且其中该人源化单克隆抗体 与跨膜型肿瘤坏死因子α结合。

本发明提供一种人源化单克隆抗体用于引起抗体依赖性细胞介导的细 胞毒作用的用途，其中该人源化之单克隆抗体，包括：一轻链，其中该轻 链之可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO：5的序列；以及一重链，其中该 重链之可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO：6的序列，且其中该人源化单 克隆抗体与跨膜型肿瘤坏死因子α结合。

本发明也提供一种人源化单克隆抗体人源化单克隆抗体用于制备治疗 与跨膜型肿瘤坏死因子α相关之疾病之药物的用途，其中该人源化之单克 隆抗体，包括：一轻链，其中该轻链之可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO： 5的序列；以及一重链，其中该重链之可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO： 6的序列，且其中该人源化单克隆抗体与跨膜型肿瘤坏死因子α结合。

【附图说明】

第1图显示经纯化之m357IgG与h357IgG之SDS-PAGE分析结果。 将m357IgG与h357IgG表达于小鼠NS0细胞中，并且藉由蛋白质A管柱 自培养基中纯化。将样本在非还原状态与还原状态下以MOPS缓冲溶液于 4～12％SDS/聚丙烯酰胺凝胶(Bis-Tris polyacrylamide gel)进行电泳。M为分 子量标准品。

第2图显示m357IgG之轻链与重链cDNA的电泳分析结果。

第3A图显示m357IgG之重链可变区及轻链可变区的最终精确结构。

第3B图显示m357IgG分子表面模拟。

第4图显示m357IgG与PPS4之重链可变区(V_H)(A)及重链可变区(V_L)(B) 的氨基酸序列比对。将PPS4Fv序列显示为PPS4V_L与PPS4V_H以进行比较， 其与用在m357IgG人源化中当作人类表面残基接受者的m357IgG Fv同源 度最高。CDR残基为在括号([])中。保守表面残基以白色方框显示，非保守 表面残基以灰方框显示。根据Kabat’s惯例(Kabat，1991)将氨基酸序列编码。

第5图显示藉由m357-IgG抗体与h357-IgG抗体于L929细胞中之肿瘤 坏死因子α中介细胞毒性的中和。将各种浓度之m357-IgG(·)抗体与 h357-IgG(o)抗体加至L929细胞与100ng/ml之人类肿瘤坏死因子α培养。 将细胞培养于37℃，16小时，并使用比色MTT分析来分析细胞存活。

第6图显示m357-IgG抗体与h357-IgG抗体对在细胞表面上之跨膜肿 瘤坏死因子α的饱和分析。将经跨膜肿瘤坏死因子α转染之NS0细胞以 m357-IgG及h357-IgG的连续指数稀释物于4℃培养1小时。将细胞清洗3 次并分别以对m357-IgG反应之Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)与对 h357-IgG之反应之Alexa Fluor 647山羊抗人类IgG(H+L)在4℃进行培养1 小时。将细胞清洗并藉由FACSCalibur流式细胞仪(flow cytometer)来分析。

第7图显示h357IgG对于中介抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用的能 力。将表达跨膜肿瘤坏死因子α之细胞在不同浓之h357抗体存在下培养1 小时。然后将人外周血单核细胞作为效应细胞(effector cell)，且表达跨膜肿 瘤坏死因子α之细胞作为目标细胞。藉由测量自细胞质中进入上清液中的 LDH量来计算细胞毒性。结果显示将以溶解溶液处理之细胞群组作为100 ％溶解之细胞溶解百分比。

为了让本发明之上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文 特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下：

【具体实施方式】

在本发明一态样中，本发明提供一人源化单克隆抗体之氨基酸序列， 其中此人源化单克隆抗体与肿瘤坏死因子α结合，而肿瘤坏死因子α可为 人类肿瘤坏死因子α。上述人源化单克隆抗体之氨基酸序列可包括一轻链可 变区之氨基酸序列与一重链可变区之氨基酸序列。在一实施例中，上述本 发明人源化单克隆抗体之氨基酸序列为一免疫球蛋白G(IgG)抗体之氨基酸 序列，其可包括一轻链可变区之氨基酸序列、一重链可变区之氨基酸序列 与人类免疫球蛋白G保守区域的氨基酸序列。

在一实施例中，本发明人源化单克隆抗体之轻链可变区的氨基酸序列 与重链可变区的氨基酸序列可藉由对与肿瘤坏死因子α结合的非人类单克 隆抗体执行可变区表面重组(variable domain resurfacing)来获得。

首先，取得一与肿瘤坏死因子α结合的非人类单克隆抗体之轻链可变 区氨基酸序列与重链可变区氨基酸序列。在一实施例中，与肿瘤坏死因子α 结合的非人类单克隆抗体可包括一鼠源单克隆抗体。此鼠源单克隆抗体之 轻链可变区氨基酸序列可包括SEQ ID NO：1之序列，而重链可变区氨基酸 序列可包括SEQ ID NO：2之序列。

接着，根据前述与肿瘤坏死因子α结合的非人类单克隆抗体之轻链可 变区氨基酸序列与重链可变区氨基酸序列来建立前述与肿瘤坏死因子α结 合的非人类单克隆抗体之轻链可变区与重链可变区的分子仿真结构，并且 标定出其非保守表面残基。在一实施例中，分子仿真结构可以计算机辅助 同源性仿真方式来进行。

之后，搜寻与肿瘤坏死因子α结合的非人类单克隆抗体之可变区氨基 酸序列相似度最高之人类序列，并将两者进行比对而决定出此与肿瘤坏死 因子α结合的非人类单克隆抗体之可变区氨基酸序列的可取代残基。最后， 将此与肿瘤坏死因子α结合的非人类单克隆抗体之可变区氨基酸序列的可 取代残基取代为对应于此残基位置之前述人类序列的氨基酸残基，以获得 与肿瘤坏死因子α结合的人源化单克隆抗体之轻链可变区的氨基酸序列与 重链可变区的氨基酸序列。

在一实施例中，前述与肿瘤坏死因子α结合的非人类单克隆抗体之轻 链可变区氨基酸序列可包括SEQ ID NO：1之序列且重链可变区氨基酸序列 可包括SEQ ID NO：2之序列，而与前述非人类单克隆抗体之轻链可变区氨 基酸序列及重链可变区氨基酸序列相似度最高之的人类序列为PPS4之轻链 可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：3)与重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO： 4)。在此实施例中，可对前述与肿瘤坏死因子α结合的非人类单克隆抗体 之轻链可变区与重链可变区的氨基酸序列进行的取代则至少包括下列之 一：SEQ ID NO：1之第10个氨基酸由异亮氨酸取代为羟丁氨酸、SEQ ID NO：1之第18个氨基酸由赖氨酸取代为精氨酸、SEQ ID NO：2之第2个 氨基酸由赖氨酸取代为谷氨酰胺、SEQ ID NO：2之第10个氨基酸由色氨 酸取代为亮氨酸、SEQ ID NO：2之第18个氨基酸由赖氨酸取代为精氨酸 与SEQ ID NO：2之第41个氨基酸由谷氨酸取代为甘氨酸。因此，所获得 之与肿瘤坏死因子α结合的人源化单克隆抗体的氨基酸序列可含有包括 SEQ ID NO：l之轻链可变区氨基酸序列及包括SEQ ID NO：2之重链可变 区氨基酸序列，且SEQ ID NO：1之序列与SEQ ID NO：2之序列具有至少 下列取代之一：SEQ ID NO：1之第10个氨基酸由异亮氨酸取代为羟丁氨 酸、SEQ ID NO：1之第18个氨基酸由赖氨酸取代为精氨酸、SEQ ID NO： 2之第2个氨基酸由赖氨酸取代为谷氨酰胺、SEQ ID NO：2之第10个氨基 酸由色氨酸取代为亮氨酸、SEQ ID NO：2之第18个氨基酸由赖氨酸取代 为精氨酸与SEQ ID NO：2之第41个氨基酸由谷氨酸取代为甘氨酸。

在另一实施例中，前述与肿瘤坏死因子α结合的非人类单克隆抗体之 轻链可变区氨基酸序列可包括SEQ ID NO：1之序列而重链可变区氨基酸序 列可包括SEQ ID NO：2之序列，而与前述非人类单克隆抗体之轻链可变区 氨基酸序列及重链可变区氨基酸序列相似度最高之的人类序列为PPS4之轻 链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：3)与重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。而在进行前述序列比对后，所获得之与肿瘤坏死因子α结合的人 源化单克隆抗体之轻链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO：5，而重链可 变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO：6。

因此根据上述，在本发明另一形态中，本发明也可提供编码上述本发 明人源化单克隆抗体之核苷酸序列。上述编码人源化单克隆抗体之核苷酸 序列可包括一编码轻链可变区之核苷酸序列与一编码重链可变区之核苷酸 序列。在一实施例中，上述本发明之编码人源化单克隆抗体之核苷酸序列 为一编码免疫球蛋白G(IgG)抗体之核苷酸序列，其可包括一编码轻链可变 区之核苷酸序列、一编码重链可变区之核苷酸序列与编码人类免疫球蛋白G 保守区域之核苷酸序列。

在一实施例中，上述编码人源化单克隆抗体之轻链可变区核苷酸序列 可包括编码出SEQ ID NO：5之序列的核苷酸序列，而编码重链可变区核苷 酸序列可包括编码出SEQ ID NO：6之序列的核苷酸序列。编码出SEQ ID NO：5之序列的核苷酸序列可为SEQ ID NO：7之序列，而编码出SEQ ID NO：6之序列的核苷酸序列可为SEQ ID NO：8之序列。

在本发明另一态样中，本发明还可提供一人源化单克隆抗体，其中此 人源化单克隆抗体与肿瘤坏死因子α结合，而肿瘤坏死因子α可为人类肿 瘤坏死因子α。上述人源化单克隆抗体可包括一轻链与一重链。在一实施例 中，上述本发明人源化单克隆抗体为一免疫球蛋白G(IgG)抗体，其单侧可 包括一轻链可变区、一重链可变区与人类免疫球蛋白G保守区域。

在一实施例中，上述本发明人源化单克隆抗体可藉由下述步骤来获得。

首先，取得一与肿瘤坏死因子α结合的非人类单克隆抗体之轻链可变 区核苷酸片段及其序列与重链可变区核苷酸片段及其序列。在一实施例中， 可藉由抽取一产生上述非人类单克隆抗体杂交瘤的总RNA，并对此总RNA 以分别对于轻链可变区与重链可变区之两对引物进行反转录聚合酶链锁反 应以获得非人类单克隆抗体之轻链可变区与重链可变区的核苷酸片段 (cDNA)，且之后将轻链可变区与重链可变区的核苷酸片段进行定序以分别 获得轻链可变区与重链可变区的核苷酸序列。在一实施例中，与肿瘤坏死 因子α结合的非人类单克隆抗体可包括一鼠源单克隆抗体。此鼠源单克隆 抗体之轻链可变区核苷酸序列可包括SEQ ID NO：9之序列，而重链可变区 核苷酸序列可包括SEQ ID NO：10之序列。

接着，根据非人类单克隆抗体之轻链可变区与重链可变区的核苷酸序 列分别推知此非人类单克隆抗体之轻链可变区氨基酸序列与重链可变区氨 基酸序列。在一实施例中，轻链可变区氨基酸序列可包括SEQ ID NO：1 之序列，而重链可变区氨基酸序列可包括SEQ ID NO：2之序列。

然后，根据前述与肿瘤坏死因子α结合的非人类单克隆抗体之轻链可 变区氨基酸序列与重链可变区氨基酸序列来建立前述与肿瘤坏死因子α结 合的非人类单克隆抗体之轻链可变区与重链可变区的分子仿真结构，并且 标定出其非保守表面残基。在一实施例中，分子仿真结构可以计算机辅助 同源性仿真方式来进行。

再来，搜寻与前述本发明与肿瘤坏死因子α结合的单克隆抗体之可变 区氨基酸序列相似度最高之人类序列，并将两者进行比对而决定出此与肿 瘤坏死因子α结合的非人类单克隆抗体之可变区氨基酸序列的可取代残基。 最后，将编码出前述与肿瘤坏死因子α结合的非人类单克隆抗体之可变区 氨基酸序列的核苷酸序列于上述可取代残基的对应位置以定点突变方式取 代为编码出对应于此残基位置之前述人类序列的氨基酸残基的核苷酸，以 获得本发明与肿瘤坏死因子α结合的人源化单克隆抗体之轻链可变区核苷 酸片段与重链可变区的核苷酸片段。

之后，藉由本技术领域熟知的方法，将前述本发明与肿瘤坏死因子α 结合的人源化单克隆抗体之轻链可变区核苷酸片段与重链可变区的核苷酸 片段与一已知人类保守区域核苷酸片段分别克隆进入合适的表达载体，并 将此表达载体转染进合适的宿主细胞，以使宿主细胞表达本发明与肿瘤坏 死因子α结合的人源化单克隆抗体。

在一实施例中，前述与肿瘤坏死因子α结合的非人类单克隆抗体之轻 链可变区氨基酸序列可包括SEQ ID NO：1之序列且重链可变区氨基酸序列 可包括SEQ ID NO：2之序列，而与前述非人类单克隆抗体之轻链可变区氨 基酸序列及重链可变区氨基酸序列相似度最高之的人类序列为PPS4之轻链 可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：3)与重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO： 4)。在此实施例中，可对前述与肿瘤坏死因子α结合的非人类单克隆抗体 之轻链可变区与重链可变区的氨基酸序列进行的取代则至少包括下列之 一：SEQ ID NO：1之第10个氨基酸由异亮氨酸取代为羟丁氨酸、SEQ ID NO：1之第18个氨基酸由赖氨酸取代为精氨酸、SEQ ID NO：2之第2个 氨基酸由赖氨酸取代为谷氨酰胺、SEQ ID NO：2之第10个氨基酸由色氨 酸取代为亮氨酸、SEQ ID NO：2之第18个氨基酸由赖氨酸取代为精氨酸 与SEQ ID NO：2之第41个氨基酸由谷氨酸取代为甘氨酸。因此，本发明 与肿瘤坏死因子α结合的人源化单克隆抗体的氨基酸序列可含有包括SEQ IDNO：1之轻链可变区氨基酸序列及包括SEQ ID NO：2之重链可变区氨 基酸序列，且SEQ ID NO：1之序列与SEQ ID NO：2之序列具有至少下列 取代之一：具有至少下列取代之一：SEQ ID NO：1之第10个氨基酸由异 亮氨酸取代为羟丁氨酸、SEQ ID NO：1之第18个氨基酸由赖氨酸取代为 精氨酸、SEQ ID NO：2之第2个氨基酸由赖氨酸取代为谷氨酰胺、SEQ ID NO：2之第10个氨基酸由色氨酸取代为亮氨酸、SEQ ID NO：2之第18个 氨基酸由赖氨酸取代为精氨酸与SEQ ID NO：2之第41个氨基酸由谷氨酸 取代为甘氨酸。

在另一实施例中，前述本发明与肿瘤坏死因子α结合的单克隆抗体之 轻链可变区氨基酸序列可包括SEQ ID NO：1之序列而重链可变区氨基酸序 列可包括SEQ ID NO：2之序列，且前述本发明与肿瘤坏死因子α结合的单 克隆抗体之可变区氨基酸序列相似度最高之人类序列为PPS4之轻链可变区 序列(SEQ ID NO：3)与重链可变区序列(SEQ ID NO：4)，而在进行前 述序列比对后，所获得之与肿瘤坏死因子α结合的人源化单克隆抗体之轻 链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO：5而重链可变区的氨基酸序列包括 SEQ ID NO：6。因此，本发明与肿瘤坏死因子α结合的人源化单克隆抗体 可含有包括SEQ ID NO：5之轻链可变区氨基酸序列及包括SEQ ID NO：6 之重链可变区氨基酸序列。

可与本发明之人源化单克隆抗体结合之肿瘤坏死因子α包括分泌型肿 瘤坏死因子α或跨膜型肿瘤坏死因子α。本发明之人源化单克隆抗体对分泌 型肿瘤坏死因子α的亲和力可为约20-40nM，较佳为约10-20nM。

又，本发明之人源化单克隆抗体对跨膜型肿瘤坏死因子α的亲和力可 为约20-40nM，较佳为约10-20nM。在一实施例中，本发明之人源化单克 隆抗体对跨膜型肿瘤坏死因子α的亲和力可为约16.8nM。

又，在一实施例中，本发明之人源化单克隆抗体可藉由与表达于细胞 上之跨膜型肿瘤坏死因子α结合，而引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒作 用。

目前已知，跨膜型肿瘤坏死因子α与许多疾病相关。例如偏好细胞表 面表达之跨膜型肿瘤坏死因子α的巨噬细胞与单核球细胞在肉芽肿性疾病 (granulomatous disease)，例如克罗恩症(Crohn’s disease)与韦格纳肉芽肿 (Wegener’s granulomatosis)中扮演一非常重要的角色，且藉由抗体依赖性细 胞介导的细胞毒作用可将细胞直接杀死(Beenhouwer et al.，2004)。

而根据上述，由于本发明之人源化单克隆抗体具有与跨膜型肿瘤坏死 因子α结合之能力且具有引起抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用的能力， 因此，在本发明又另一形态中，本发明可提供本发明之人源化单克隆抗体 用于中和跨膜型肿瘤坏死因子α的用途以及用于引起抗体依赖性细胞介导 的细胞毒作用的用途。

此外，本发明之人源化单克隆抗体也可应用于制备治疗与跨膜型肿瘤 坏死因子α相关之疾病之药物的用途。

【实施例】

材料与方法

A.与人类肿瘤坏死因子α结合之鼠源单克隆抗体

1.与人类肿瘤坏死因子α结合之鼠源单克隆抗体的获得与纯化

将产生与人类肿瘤坏死因子α结合之鼠源单克隆抗体的杂交瘤 (hybridoma)细胞株357-104-4(ECACC No.92030603)(购自European  Collection of Cell Cultures)注射进入小鼠腹腔，使小鼠产生肿瘤与腹水。小 鼠腹水中含有高量之与人类肿瘤坏死因子结合之鼠源单克隆抗体(m357 IgG)。上述步骤为委托台湾醣联生技医药股份有限公司(GlycoNEX Inc.) (http://www.glyconex.com.tw/)进行。

接着将腹水自小鼠取出并将腹水通过蛋白质A(protein A)管柱(GE Helth-care)来进行纯化以获得与人类肿瘤坏死因子结合之鼠源单克隆抗体 (m357IgG)。

2.与人类肿瘤坏死因子α结合之鼠源单克隆抗体(m357IgG)cDNA序 列的获得

(1)抽取杂交瘤细胞株357-104-4(ECACC No.92030603)总RNA (QIAGEN RNeasy Mini Kit)。

(2)以Amersham公司所生产之Light Primer Mix与Heavy Primers两组 引物对总RNA(total RNA)进行反转录聚合酶链锁反应(RT-PCR)以获得鼠源 357IgG之轻链与重链的cDNA。

(3)将此轻链与重链的cDNA分别克隆进入TOPO载体上，可以得到两 个克隆(clones)。

(4)经由DNA定序后，可设计具有酶切位之引物。

(5)合成两对具有酶切位之引物。

用于轻链之引物对为：

357V_L’Asc primer：

5’-CAGGCGCGCCGAAATTGTGCTGACCCAGTC-3’(SEQ ID NO：11)

357V_L3’Glink primer：

5’-CCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCCAATTTCCAGC

TTGC-3’(SEQ ID NO：12)

用于重链之引物对为：

357V_H5’Glink primer

5’-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGTGAAACTGC

AGGA-3’(SEQ ID NO：13)

357V_H3’Not

5’-CAGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT-3’(SEQ ID NO： 14)

之后，对步骤(3)中所完成的克隆中以此两引物对进行聚合酶链锁反应 以获得m357IgG的轻链与重链之cDNA。

B.与人类肿瘤坏死因子α结合之鼠源单克隆抗体(m357IgG)的计算机 仿真

使用Discovery Studio Modeling 2.1(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)来执 行与人类肿瘤坏死因子α结合之鼠源单克隆抗体(m357IgG)的同源仿真程 序(homology modeling process)。对m357IgG之轻链可变区(V_L)与重链可变 区(V_H)执行两个分开之BLASTP搜寻。经由在蛋白质资料银行(Protein Data  Bank，PDB)(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中搜寻来分析序列以确 认m357蛋白质序列的同源性。藉由根据鼠源抗乳癌抗体Fab片段之重链可 变区SM-3[PDB entry：1SM3](Dokurno et al.，1998)与抗thermus aquaticus  DNA polymerase I单克隆抗体之轻链可变区结构[PDB entry：1AY1]结构的 同源仿真来建构m357Fv片段的三维(three-dimensional，3D)结构。最终的三 维模型为藉由MODELLER模块(Sali et al.，1995)来产生，其藉由满足空间限 制(satisfaction of spatial restraints)来执行来一比较蛋白质结构仿真 (comparative protein structure modeling)的自动方法。其自动对m357IgG执行 蛋白质同源仿真与环仿真(loop modeling)。藉由使用Model antibody Loops 模块以最高序列鉴别度自PDB数据库选择模板结构来执行CDR环(CDR  loop)的模拟建构，且使用Loop Refinement模块来使CDR环的模拟建构完 善以将空间碰撞(steric clash)最小化并确认正确键长度与键角。之后，藉由 在Discovery Studio Modeling 2.1中之CHARMm(B.R.Brooks，1983)程序并 以Accelrys CHARMm forcefield来进行结构的能量最小化，可使此整个模拟 更加完善。将结构进行能量最小化于两个步骤中，首先执行受限之最陡坡 降最小化(restrained steepest descent minimization)的5000个步骤，接着，执 行共轭梯度最小化(conjugated gradient minimization)的5000个步骤，直到当 支架(framework)之α碳(alpha carbon)被维持固定于适当位置中。以 AREAIMOL程序(CCP4，1994)在三维模拟上计算m357IgG残基的溶剂可接 近表面积(solvent-accessible surface areas)。将相对之可接近度大于30％之残 基定义为可接近的。

C.IgG之建构、表达与纯化

藉由overlapping PCR来获得编码出m357IgG之人源化可变区的cDNA 片段。接着将来自人类IgG之保守区序列与藉由overlapping PCR合成之可 变区序列亚克隆(sub-cloning)于哺乳动物表达载体pSecTag2/Hygro(重链) (Invitrogen)与pcDNA3.3-TOPO TA(轻链)(Invitrogen)中。之后利用EcoRV 限制切点(restriction site)将两个构建体(construct)融合，产生 pSec-pcDNA-h357-IgG。根据厂商之操作指南，使用Effectene(Qiagen)将含 重链与轻链之基因的质体转染(transfect)进入小鼠骨髓瘤(myeloma)NS0细 胞(European Collection of Animal Cell cultures，Salisbury，Wiltshire，UK)。在以 Hygromycin(400μg/ml)筛选4周后，将稳定的克隆(clone)以在一无血清化学 定义培养基(chemically-defined medium)HyQNS0(Hyclone)中5x10⁵个细胞 /ml的起始接种密度培养于摇瓶中。于37℃收取培养基5天且藉由蛋白质A (GE Health-care)层析自上清液纯化抗体。

D.抗肿瘤坏死因子α中和效力分析

根据先前文献(Matthews N，1987)所叙述之方法以经放线菌素D处理之 鼠源成纤维细胞(fibroblast)L929细胞(ATCC Cat.No.CCL-1)来测量m357 IgG与人类肿瘤坏死因子α结合之人源化单克隆抗体(h35IgG)对于人类肿瘤 坏死因子α的中和活性。简单而言，将L929细胞以3×10⁵个细胞/well三 重复接种于一96孔盘中并将其培养于添加10％(v/v)胎牛血清之RPMI 1640 培养基中，16小时。之后，将抗体的一些稀释制备于含放线菌素D(2μg/ml) 与肿瘤坏死因子α(TNF-α)(100ng/ml)的培养基中，且培养于37℃，16小 时。在移除表层悬浮物后，加入3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮 唑嗅盐(3-4，5-dimethylthiazol-2-yl-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT)(5 mg/ml)(Sigma-Aldrich)并培养于37℃，4小时。之后将SDS溶液(10％)加至 孔洞中。于室温培养24小时后，藉由色度计(colorimeter)记录于各孔洞中之 任何颜色改变成紫色。于570nm测定洗提物之光学密度(optical density， OD)，其与存活细胞之数目具有正相关。也于实验中设计空白对照组(仅有 培养物)、肿瘤坏死因子α对照组(仅有肿瘤坏死因子α)与抗体对照组(仅 有抗体)。使用Sigma plot软件(Systat software，Inc.Richmond，CA)藉由复杂 弯曲非线性回归(complex sigmoid non-linear regression)分析来计算ED₅₀值。

E.于NS0细胞上之跨膜肿瘤坏死因子α的稳定表达

如先前技术(Perez et al.，1990)所述，以定点突变(site-directed  mutagenesis)产生抵抗肿瘤坏死因子α转换酶(TNF-αconverting enzyme， FACE)居间裂解之删除型突变的跨膜肿瘤坏死因子α。于此非裂解形式之跨 膜肿瘤坏死因子α中，删除了天然跨膜肿瘤坏死因子α之氨基酸+1至+12。 将不裂解形式之跨膜肿瘤坏死因子α基因克隆入pSecTag2/Hygro哺乳动物 表达载体(Invitrogen)并以Effectene将其转染进入小鼠骨髓瘤NS0细胞以在 细胞表面上表达跨膜肿瘤坏死因子α。

F.m357-IgG与h357-IgG对跨膜肿瘤坏死因子α之饱和结合分析

将经跨膜肿瘤坏死因子α转染之NS0细胞以m357-IgG及h357-IgG的 连续指数稀释物在含2％胎牛血清之磷酸盐缓冲溶液(荧光活化细胞储存缓 冲溶液(fluorescence-activated cell sorting[FACS]buffer))中于4℃培养1小 时。将细胞以荧光活化细胞储存缓冲溶液清洗3次，之后分别以对m357-IgG 反应之Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(H+L)对h357-IgG之反应之Alexa Fluor 647山羊抗人类IgG(H+L)来将细胞在4℃进行染色1小时。使用 FACSCalibur流式细胞仪(flow cytometer)(Becton Dickinson，San Jose，CA)来 测量荧光强度。

G.抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated  cytotoxicity，ADCC)分析

h357-IgG之抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用的活性为藉由LDH Cytotoxicity Detection Kit(Clontech)来测量，其根据制造商操作指南之来测 量释放自受损细胞之胞质溶胶(cytosol)的活性。简单而言，将可高度表达跨 膜肿瘤坏死因子α之细胞在不同浓之h357抗体存在的分析培养基中培养1 小时于5％CO₂培养箱，37℃，然后加入人外周血单核细胞(peripheral blood  mononuclear cells，PBMC)为效应细胞(effector cell)(效应细胞比目标细胞， 20∶1)。在额外于37℃培养16小时后，每孔洞获得100μl之上清液并将其 转移至一新的96-孔平底盘中。将LDH基质(100μl)加至各孔洞且以避光于 室温培养30分钟。样本之吸光值以ELISA reader于490nm下测量。藉由 分解溶液(lysis buffer)测定最大释放。根据下列公式来计算特定分解(specific  lysis)之百分比：％细胞毒性＝[实验释放-自然释放]/[最大释放-自然释放] ×100。

结果

A.与人类肿瘤坏死因子α结合之鼠源单克隆抗体(m357IgG)

1.人类肿瘤坏死因子α结合之鼠源单克隆抗体之分析

将经纯化之m357IgG进行SDS-PAGE分析，结果如第1图之lane 1与 lane 2所示。lane 1为非还原状态，lane 2为还原状态。

2.鼠源357IgG的轻链与重链之cDNA

将前述藉由聚合酶链锁反应获得之鼠源357IgG的轻链与重链之cDNA 进行电泳分析，结果如第2图所示，其中lane 1为轻链之cDNA(SEQ ID NO： 9)，lane 2为重链之cDNA(SEQ ID NO：10)。

B.m357变异片段之分子模拟

藉由RT-PCR来获得编码出源自杂交瘤细胞株357-101-4(ECACC No. 92030603)之抗肿瘤坏死因子α单克隆抗体m357IgG的重链可变区及轻链可 变区之cDNA(资料未显示)。藉由如“材料与方法”中所述之同源模拟 (program MODELLER)来分别建构m357IgG的重链可变区及轻链可变区之 推演之氨基酸序列的三维结构。之后，以来自PDB之1SM3(享有序列相 同度与相似度分别为87％与93％)模板结构以1.95分辨率与来自PDB 之1AY1(享有序列相同度与相似度分别为85％与91％)模板结构以2.20分辨率分别仿真出m357IgG的重链可变区及轻链可变区。经由Discovery  Studio modeling 2.1program获得m357IgG之重链可变区及轻链可变区的最 终精确结构，如第3A图中所示。

第3A图显示m357IgG的可变区。藉由分别与对应于重链可变区之 1SM3与对应于轻链可变区之1AY1的结晶结构进行比较的同源模拟来产生 m357IgG的三维结构。CDR环以粗黑线显示。第3B图为m357IgG分子表 面模拟，其显示非类人类(non-humn like)表面残基与CDR环相关。以箭号 指出之17个相对溶剂接近度大于30％的残基，为非类人类表面残基。CDR 环以粗黑线显示。接近CDR环于内(虚线圆圈)之残基以虚线箭号显 示。较佳突变为“人类”氨基酸的6个残基以实线箭号显示。于重链可变区支 架中应有4个残基被人源化，而于轻链可变区支架中仅有2个残基应被人 源化。

C.m357IgG可变区片段之人源化

藉由可变区重组之人源化首先由Padlan于1991年提出，于此方法中排 除了在抗体之支架区中之潜在抗原位(antigenic site)，而不影响抗原亲和力 (Padlan，1991)。此方法系根据人类抗小鼠抗体仅对于来自表面残基之可变区 反应的前提，并且已被其它研究者(Fontayne et al.，2006；O′Connor et al.，1998； Staelens et al.，2006)采用与修饰。于本实施例中，以下列三个步骤来执行 m357IgG之可变区重组：首先，分别建构m357IgG之重链可变区与轻链可 变区；第二，使用AREAIMOL程序来计算溶剂可接近残基以鉴定非类人类 支架表面残基，且最后根据人类支架之序列排列结果将这些表面残基突变 为人类之对应表面残基。为了于可变区上取代鼠源m357IgG的非类人类支 架表面残基，自人类目标序列选择一组高度同源之表面残基。搜寻IMGT 数据库(http://imgt.cines.fr/)，同时自搜寻结果排除噬菌体呈现(phage-display) 或人源化抗体的序列，以鉴定出与m357IgG之对应可变区具最高同源性之 人类重链可变区与轻链可变区序列对。自人类序列所发现之最相同之表面 残基为PPS4之可变区(于价区中序列相似度分别为重链可变区；76％与轻 链可变区：73％)(第4图)。根据AREAIMOL程序之计算结果，于重链 可变区中之20个表面残基有8个为在人类与小鼠序列间为非保守的，而于 轻链可变区中之16个表面残基有9个为非保守的。这17个表面残基为要 被取代之候选者。然而，于CDR区中之重链52BQ、重链52CS、重链54N、 重链61E、轻链31F、轻链55S、轻链90W、轻链92D、轻链93Y与轻链 96R的取代可能潜在改变CDR的结构，且V59，于轻链中接近CDR2于内之一额外非保守表面残基也可能潜在影响结合亲和力(第3B图)。如结 果所示，保留这11个鼠源残基以维持抗原亲和力。最后，选择剩余之6个 残基来取代为人类保守残基：与PPS4比对，轻链可变区之第10个比对位 置由异亮氨酸取代为羟丁氨酸(m357轻链可变区之第10个氨基酸由异亮 氨酸取代为羟丁氨酸)、第18个比对位置由赖氨酸取代为精氨酸(m357 轻链可变区之第18个氨基酸由赖氨酸取代为精氨酸)；与PPS4比对，重 链可变区第3个比对位置由赖氨酸取代为谷氨酰胺(m357重链可变区之第 2个氨基酸由赖氨酸取代为谷氨酰胺)、第11个比对位置由色氨酸取代为 亮氨酸(m357重链可变区之第10个氨基酸由色氨酸取代为亮氨酸)、第 19个比对位置赖氨酸取代为精氨酸(重链可变区之第18个氨基酸由赖氨酸 取代为精氨酸)与第42个比对位置氨基酸由谷氨酸取代为甘氨酸(重链可 变区之第41个氨基酸由谷氨酸取代为甘氨酸)(第4图)。

D.人源化357(h357)IgG₁之构建与表达

分别将m357IgG之人源化重链可变区与轻链可变区的氨基酸序列读框 内(in-frame)融合至人类IgG₁之重链与kappa轻链保守区。为了表达一完整 之人源化357(h357)IgG₁分子，使用两种哺乳动物表达载体， pSecTag2/Hygro与pcDNA3.3-TOPO TA，以分别接受h357IgG之人源化重 链与轻链。之后将轻链表达框架(expression cassette)连接至重链表达 pSecTag2/Hygro载体。重组h357IgG之表达程度为～14mg/L。藉由蛋白质 A层析来分别纯化含m357IgG与h357IgG两者之培养基，并藉由 SDS-PAGE来确认蛋白质纯化物(第1图)。如于第1图中所示，在非还 原环境下，两抗体皆显示具有155kDa分子量之单一条带(lanes 1与3)。 在还原环境下，两抗体分别产生具有55kDa(重链)与26kDa(轻链)之 分子量的两蛋白质条带(lanes 2与4)。

E.藉由m357IgG与h357IgG之肿瘤坏死因子α中介细胞毒性的中和

为了试验抗肿瘤坏死因子α抗体之功能活性，执行抗体抑制可溶性肿 瘤坏死因子α的能力的测试。肿瘤坏死因子α引起对鼠源L929细胞之细胞 毒性。藉由将抗体与重组之人类肿瘤坏死因子α及细胞共培养，于L929分 析中评估m357IgG与h357IgG两者。如于第5图中所示，于以100ng/ml 之人类肿瘤坏死因子α处理之L929细胞中的肿瘤坏死因子α中介细胞毒性 被m357IgG与h357IgG两者以剂量依赖方式(dose dependent manner)有效中 和，分别具有3.07nM与2.30nM之ED₅₀值。结果指出人源化357IgG在相 似于鼠源357IgG之浓度维持肿瘤坏死因子α中和活性。

F.h357IgG抗体对跨膜肿瘤坏死因子α的结合活性

肿瘤坏死因子α存在与膜连接之前驱物(跨膜肿瘤坏死因子α)，藉由 肿瘤坏死因子α转换酶(TNF-converting enzyme，TACE)之蛋白酶切割 (proteolytic cleavage)，自跨膜肿瘤坏死因子α释放成熟的可溶形式。已有许 多研究指出具与跨膜肿瘤坏死因子α结合能力肿瘤坏死因子α对抗药 (antagonist)可导致由细胞凋亡、抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用 (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC)、补体依赖细胞毒毒杀 作用(complement-dependent cytotoxicity，CDC)与外至内讯号传递机制引起 之细胞溶解(Arora et al.，2009；Caron et al.，1999；Mitoma et al.，2008；Scallon  et al.，1995)。为了分析h357IgG对跨膜肿瘤坏死因子α的结合能力，将跨 膜肿瘤坏死因子α之未裂解形式的cDNA转染进NS0细胞以将其表达于细 胞膜上，并使用流式细胞仪以评估m357IgG与h357IgG两者之结合活性。 于第6图中之数据指出m357IgG与h357IgG两者皆可以一浓度依赖方式与 跨膜肿瘤坏死因子α结合，其K_D值分别为12.0nM与16.8nM。相似之K_D值指出人源化过程并没有改变对跨膜TNF-α之结合亲和力。于奈米级穆尔 浓度(nanomolar)范围中之结合亲和力指出h357IgG可潜在引起更多经由跨 膜肿瘤坏死因子α的作用功能(effector function)或细胞凋亡机制。

G.h357IgG对于中介抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用的能力

先前文献已报导，Infliximab与Adalimumab对于跨膜肿瘤坏死因子α 的结合亲和力较佳于Etanercept，其可藉由抗体依赖性细胞介导的细胞毒作 用、补体依赖细胞毒毒杀作用或细胞凋亡机制影响细胞表面表达跨膜肿瘤 坏死因子α的细胞杀死作用，且此可为在临床疾病上导致不同功效的原因 之一(Taylor，2010)。偏好细胞表面表达肿瘤坏死因子α的巨嗜细胞与单核球 于肉芽肿性疾病(granulomatous disease)，例如克罗恩症(Crohn’s disease)与韦 格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)中扮演一非常重要的角色，且藉由抗 体依赖性细胞介导的细胞毒作用可将细胞直接杀死(Beenhouwer et al.， 2004)。当肿瘤坏死因子α对抗药与表达跨膜型肿瘤坏死因子α结合时，这 些细胞可被自然杀伤细胞(natural killer cell)作为目标。具有来自人类IgG_l之Fc区域的h357IgG，其可于肿瘤坏死因子α产生细胞中潜在引起细胞分 解。因此，为了评估h357IgG对于中介对表达跨膜肿瘤坏死因子α目标细 胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用的能力，于抗体依赖性细胞介导的 细胞毒作用分析中，以效应细胞对目标细胞为(effector to target，E∶T)20∶1之 比例使用经分离之人外周血单核细胞。大于20％之肿瘤坏死因子α携带目 标细胞在h357IgG浓度为6.25ug/ml时被分解(第7图)。这些资料指出 经由与表达于细胞表面之跨膜肿瘤坏死因子α结合，h357IgG可中介抗体 依赖性细胞介导的细胞毒作用，因此，相似于那些具ADCC能力的治疗抗 体，h357IgG具有被发展为一更有效之肿瘤坏死因子α中和抗体的潜力。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，任 何本领域技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作 些许之更动与润饰，因此本发明之保护范围当视后附之申请专 利范围所界定者为准。