一种检测农作物化学杂交剂有效含量及稳定性的方法

摘要

本发明公开了一种检测农作物化学杂交剂有效含量和稳定性的方法，即采用高效液相色谱，对小麦化学杂交剂SQ-1的主成分杀雄嗪酸的含量和稳定性进行检测、回收率与精密度测试，结果准确可靠。本发明方法的优点是：采用了常规的C18色谱柱和紫外检测器，色谱条件比较简单，容易实现；在该色谱条件下，分析结果的重现性好，具有良好的线性范围、灵敏度、检出限以及回收率；是一种快速、准确、灵敏、操作简便的分析与检测农作物化学杂交剂广泛可借鉴的方法，适合在化学杂交剂工业化生产中监控产品的质量以及作为农作物化学杂交剂储藏与施用效果中质量检测的重要技术支撑。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测农作物化学杂交剂有效含量及稳定性的方法，属于化学物质检测分析 技术领域。

背景技术

小麦是我国主要粮食作物之一，种植面积和总产量仅次于水稻，居第二位，常年种植 面积约在2667万公顷左右，是我国最重要的商品粮和战略性的主要粮食储藏品种。许多 研究和生产实践表明，小麦也具有明显的杂种优势，深入研究与开发利用是大幅度提高小麦产 量和品质的一种经济实效新途径，特别是杂交小麦品种比起常规小麦品种具有明显的难能替代 的优点：(1)选育周期短，即能够在较短的选育周期内，不仅可选育出比常规小麦品种增产15％ 以上的优良杂交小麦新品种，同时能够以优于常规育种的选育方法，将高产与优质通过组配强 优势F1有机地结合在一起，以选育出优质与高产并举的专用小麦强优势新组合，可克服目前在 常规品种中所存在的高产与优质呈负相关的矛盾；(2)由于杂交小麦提供给生产种植的是杂交 种，完全可以利用强大的配组优势，通过特定亲本选配，以培育超高产的超级杂交小麦提供生 产应用；(3)明显的产业化特点，由于杂交小麦生产的是杂交种子，有着明显的高科技含量与 知识产权，不但有利于拉动农业产业链的完整形成，同时很有利于市场经营；(4)提高单产是 杂种优势利用的主攻目标，将高产与优质有机融为一体又正是杂种优势利用所独具的捷径，因 而充分发挥农作物杂种优势的增产和抗逆作用，利用杂种优势途径来培育超高产、优质、多抗 专用小麦强优势新组合，即超级杂交小麦新品种，这无论是对我国率先将杂交小麦应用于大面 积生产，并推动全国杂交小麦整体研究水平的提高，还是为二十一世纪在小麦研究与生产中掀 起一场新的技术革命和确保我国粮食安全都将起到举足轻重的作用。

纵观大量文献报道，目前在我国进行杂交小麦的研究与利用，主要有4种途径，即CMS (Cytoplasm-nucleus Male Sterility，质核互作型雄性不育)、CHA(Chemical Hybridizing Agents， 化学杂交剂诱导雄性不育或者称其为化控二系)、GMS(Genomic Male Sterility.核型不育)与 PMS(Photo-thermo-sensitive Male Sterility，光温敏不育，包括光敏、温敏和光温互作型不育)。 除此，亦有将GMS和CHA或PMS和CHA结合，采用两种途径互补的方式进行杂交小麦的 选育和利用。

但现阶段在我国小麦杂种优势利用研究中，已较大规模进行杂交种制种、大面积进行生产 示范和大面积生产应用的主要CHA途径。

CHA途径与其它途径相比，突出的特点是，可按照杂交小麦组配强优势组合的规律，通过 科学选择直接利用小麦常规品种(系)作为杂交小麦的特定亲本，大量地配制杂种组合，无须 培育专门的不育系、保持系和恢复系，只要筛选出强优势组合，用适宜化学杂交剂喷施母本， 即可达到生产杂交种的目的。国内近年来在CHA途径研究与利用方面已取得长足的发展，由西 北农林科技大学(即本专利申请者)主持选育出的一批“西杂”系列杂交小麦强优势新组合，其 中西杂一号将高产与优质有机融为一体，2000年8月提前通过陕西省审定，为我国黄淮麦区第 一个通过正式审定的杂交小麦新品种，被评为陕西省2000年十大科技新闻之一。西杂五号亦已大 面积进行生产示范和走向推广应用。现“西杂”系列杂交小麦新品种已在国内外成为特色品牌。

但CHA途径关键技术之一，必需有一种高效无毒的小麦化学杂交剂，并对化学杂交剂的质 量检测、杀雄效果、使用技术和制种技术要进行系统研究，成为熟化成果后方能推广，进而亦 才能真正地突破杂交小麦的生产应用关。

杀雄嗪酸是我国自行研制的具有自主知识产权的一种新型小麦化学杂交剂，商品名为SQ-1。 化学名称：2-(4-氯苯基)-3-乙基-2，5-二氢-5-氧哒嗪-4-羧酸，熔点为269℃；蒸气压：＜10 mmHg(25℃)；溶解度(W/V)：水中＞69.6％(23℃，pH7)，丙酮中＜0.05％(24℃)，正己烷中＜0.06 ％(25℃)，甲苯中＜0.04％(24℃)。具有杀雄效果彻底，对小麦无明显不良影响，与品种之间互作 小和施药期较长等优点.已在生产制种中得到大面积应用。但对其质量检测与分析方法，一直 以来却未见有文献报道，故难以对该产品进行质量监控和提供技术指导。本发明正是基于上述 问题，利用本专利申请者们首先在国内筛选与合成出的具有自主知识产权的新型小麦杂交剂SQ-1，研究与创制出“一种检测农作物化学杂交剂有效含量和稳定性的方法”，旨在通过这一技 术体系来更好地完善与优化杂交小麦中以化控二系途径来研制小麦杂交种，为提高化学杂交剂 的使用效果急需对化学杂交剂的质量检测体系的需求，进而促使杂交小麦真正能更大范围逐步 走向大面积生产，以实现在我国南方能以杂交水稻，北方能以杂交小麦为主体的粮食增产生产 格局。

发明内容

本发明公开了一种检测农作物化学杂交剂有效含量及稳定性的方法。

本发明的技术方案为：小麦化学杂交剂杀雄嗪酸的高效液相色谱检测方法，经本方法所得 回收率与精密度试验测试，该分析结果准确可靠。

本发明的技术解决方案可通过下列方法得以实现：

(1)标品溶液的配制：准确移取1.0ml化学杂交剂杀雄嗪酸溶液至15ml容量瓶中，用超 纯水定容，摇匀；配成标样储备液，于冰箱中储存。

(2)分别准确移取不同体积的上述化学杂交剂杀雄嗪酸标准储备液，并以超纯水定容至 10mL，配制成浓度分别为1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、75.0mg/L的化学杂交剂杀雄嗪酸标准溶 液，用于标准工作曲线试验；分别准确移取不同体积的上述化学杂交剂杀雄嗪酸标准储备液， 并以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为10.0、25.0、50.0mg/L的化学杂交剂杀雄嗪酸标准 溶液，用于精密度和加标回收率试验。

(3)样品溶液的配制：准确移取某批次合成的小麦化学杂交剂杀雄嗪酸样品溶液1.0mL于 15mL离心管中，稀释15倍，然后再用超纯水稀释200倍，用于样品测定。取样品溶液 10mL(50mg/L)置于15mL离心管中，共5份，分别加入氢氧化钠溶液(1mol/L)调溶液pH为 13、盐酸溶液(1mol/L)调溶液pH为1、30％过氧化氢溶液调其浓度为3％(上述四份样品均 室温保存)以及高温100℃，放置5天，取样进行测定和记录色谱图，用于分析其稳定性。

(4)化学杂交剂杀雄嗪酸标准品和样品进样：采用手动进样针在一定的色谱操作条件下对 化学杂交剂杀雄嗪酸标准品和样品分别进样，以峰面积对标样溶液的质量浓度作图，绘制标准 工作曲线，或者进行线性回归，拟合出线性方程式，从而测定出化学杂交剂杀雄嗪酸样品的有 效含量。

色谱柱：C18柱，250mm×4.6mm，5μm。

检测器：紫外检测器，波长：280nm。

柱温：30℃。

进样量：10μL。

流速：1.0ml/min

由于化学杂交剂杀雄嗪酸是一种酸性有机化合物，因此需要选择合适pH值的缓冲液作为 流动相，以抑制样品的解离。本发明采用H₃PO₄-(NH₄)₂HPO₄缓冲溶液-甲醇体系作为流动相， 调节缓冲溶液的pH值为3。

缓冲溶液与甲醇的体积比：40/60。

本发明的方法与技术带来的技术效果和进步在于：

(1)本发明专门针对申请者首先在国内筛选与工厂化合成出的具有自主知识产权的新型小 麦杀雄剂SQ-1，提供了一种分析检测小麦化学杂交剂杀雄嗪酸有效含量和稳定性的方法，可填 补小麦化学杂交剂杀雄嗪酸分析与检测技术方面的空白，为其合成或在生产上的使用提供了检 测小麦化学杂交剂方法的依据。

(2)本发明提供的方法是一种快速、准确、灵敏、操作简便、线性范围广的分析化学杂交 剂杀雄嗪酸的方法，在该色谱条件下，样品的稳定性强，分析结果的重现性好，适合在工业化 生产中监控产品的质量。

(3)本发明的实施可以使目前我国通过化控二系已选育出的杂交小麦，特别是西杂系列杂 交小麦在本发明方法和技术支撑下，进一步提高化学杂交剂的质量，优化杂交小麦制种技术和 效能，尽快使杂交小麦产业化同时进一步扩大面积走向生产。

(4)采用本发明将杂交小麦应用于大面积生产，可推动全国杂交小麦整体研究水平的提高， 为二十一世纪在小麦研究与生产中掀起一场新的技术革命，尤其在确保我国粮食安全方面将起 到举足轻重的作用。

附图说明

图1为化学杂交剂杀雄嗪酸样品色谱图；

图2为化学杂交剂杀雄嗪酸样品酸性条件下降解色谱图；

图3为化学杂交剂杀雄嗪酸样品碱降解色谱图；

图4为化学杂交剂杀雄嗪酸样品高温降解色谱图；

图5为化学杂交剂杀雄嗪酸样品氧化降解色谱图。

具体实施方式

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围 或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识， 本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围 的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也 包含在本发明的范围内。

结合说明书附图(见说明书附图)可完全阐述本发明的技术操作过程与特点。

色谱条件如下：

1.色谱柱：Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm，)；

2.流动相：V_甲醇/V_缓冲液＝60/40；

3.缓冲溶液的组成为：配制质量浓度为0.5％(NH₄)₂HPO₄水溶液，小心滴加浓磷酸，调节至 缓冲溶液的pH值为3；

4.流动相流速：1.0mL/min；

5.紫外检测器，检测波长：280nm；

6.Waters高效液相色谱仪，具2487双通道紫外检测器；

7.进样量：10μL。

溶液配制

1.化学杂交剂杀雄嗪酸标准品储备液(现配现用)

准确移取1.0ml化学杂交剂杀雄嗪酸标准溶液至15ml容量瓶中，用超纯水定容，摇匀。配 成标样储备液，于冰箱中储存。

2.化学杂交剂杀雄嗪酸标准品溶液(现配现用)

分别准确移取不同体积的上述化学杂交剂杀雄嗪酸标准储备液，并以超纯水定容10mL，配 制成浓度分别为1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、75.0mg/L的化学杂交剂杀雄嗪酸标准溶液，用于 标准工作曲线试验。

分别准确移取不同体积的上述化学杂交剂杀雄嗪酸标准储备液，并以流动相定容至10mL， 配制成浓度分别为10.0、25.0、50.0mg/L的化学杂交剂杀雄嗪酸标准溶液，用于精密度和加标 回收率试验。

3.化学杂交剂杀雄嗪酸样品储备液(现配现用)

准确移取某批次合成的小麦化学杂交剂杀雄嗪酸样品溶液1.0mL于15mL离心管中，稀释 15倍，配成样品储备液。

4.化学杂交剂杀雄嗪酸样品溶液(现配现用)

准确移取上述化学杂交剂杀雄嗪酸标准储备液1.0mL，然后再用超纯水稀释200倍，用于 样品测定。

化学杂交剂杀雄嗪酸标品和样品进样

在本发明的色谱操作条件下，采用手动进样器对化学杂交剂杀雄嗪酸的标品和样品(见图1) 进行进样，进样量为10μL。

分析方法考察

1.线性关系

在本发明的色谱操作条件下，采用手动进样针对化学杂交剂杀雄嗪酸标准品和样品分别进 样，以峰面积对标样溶液的质量浓度作图，进行回归分析，拟合出线性方程式为： y＝68698x+1260.2，相关系数r＝0.9999，线性范围为1.0～75.0mg/L。

2.精密度和加标回收试验

在样品溶液中分别添加10.0、25.0、50.0mg/L 3个水平的化学杂交剂杀雄嗪酸标准品，进行 添加回收率实验。每个添加浓度平行6次，进行测定精密度。测定样品的添加回收率在 98.97％～102.28％之间，变异系数在0.88％～3.21％之间。结果如表1所示：

表1 化学杂交剂SQ-1的回收率及精确度

对化学杂交剂杀雄嗪酸样品进样检测，平行进行5次测定，由表2可见其平均含量为 14.70％，相对平均偏差(n＝5)为3.85％。

表2 样品含量测定

由图2、图3、图4、图5色谱图可知，在本发明的色谱操作条件下，化学杂交剂杀雄嗪酸 与各杂质在较短的分析时间内得到了基线分离，并在酸、碱、高温环境下比较稳定，而在氧化 剂条件下容易降解。