总甲状腺素(TT4)定量测定试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种总甲状腺素TT4的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含TT4磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，TT4校准品、TT4质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数，并且大大降低了产品成本。

说明书

技术领域

本发明涉及测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是涉及测定血清中总甲状腺素(Total  Thyroxine，TT4)含量的试剂盒及其测试方法。

背景技术

甲状腺素或3，5，3’，5’-四碘甲腺原氨酸(T4)是一种分子量为777的甲状腺激素，在甲 状腺中由与一种特殊蛋白质(甲状腺球蛋白)结合的酪氨酸碘化合成。甲状腺素(T4)是甲状 腺分泌的主要激素，它本身没有活性。T4在5脱碘酶作用下转化为具有生物活性的三碘甲腺 原氨酸后经过一系列的反应最终合成具有生物功能的蛋白质，从而发挥甲状腺激素的生物效 应。血液循环系统甲状腺激素的水平，常常反映甲状腺的功能。测定血清中总T4含量，是判 断甲状腺功能最常用的检查指标。T4增高见于甲亢、T4型甲亢、亚急性甲状腺炎、高TBG血 症、甲状腺激素不敏感综合症；减低见于甲减、地方性甲状腺肿、慢性淋巴性甲状腺肿、甲 亢治疗期、严重肝病、TBG降低。总T4(Total Thyroxine，TT4)的测定通常作为诊断甲状 腺功能低下最好的单项指标，与TSH联合使用是目前诊断新生儿先天性甲低的唯一方法。从 检测角度上来说，目前临床上用于测定TT4的方法主要有放免法、ELISA法、化学发光法等。

过去以放免为代表的总甲状腺素(TT4)测定试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能 力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免疫检测技术和 化学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪80年代是继酶联免疫技术和放免技术之后发展 起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无 放射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。

磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技 术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法，抗原、抗 体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗 原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统ELISA相比 具有灵敏度高，检测用时少的优点。

发明内容

本发明需要解决的技术问题在于提供一种总甲状腺素(TT4)定量测定试剂盒及其检测方 法，采用该试剂盒进行TT4检测具有较高的灵敏度和特异性，和更短的获得检测结果的时间 和更简便的操作方式。

本发明提供了一种总甲状腺素(TT4)的定量测定试剂盒，其包含的试剂有TT4磁分离 试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，校准品、质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。

所述的磁分离试剂含有标记有抗TT4单克隆抗体的磁性微球。

所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的TT4抗原。

所述的反应增强剂是含有Tris的缓冲液。

所述稀释液是含有BSA溶液。

所述的校准品及质控品是含有一定量的TT4抗原的BSA蛋白溶液。

所述清洗液浓缩液是含有TWEEN-20和Proclin-300的缓冲液。

所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。

本发明总甲状腺素(TT4)的定量测定试剂盒的制备方法，包括下述步骤：

第-步：磁分离试剂的制备过程

一、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制1L：

1、称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96g TWEEN-20于20ml容器中加适量 水使其完全溶解后，倒入上述容器中；

2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容 器中，然后在上述1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；

3、调节PH计测量其PH值，调PH，控制PH在7.95-8.05之间；

4、称取BSA 3g倒入上述1L容器中；

5、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤；过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存。

二、磁分离试剂的制备过程

1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗TT4单克隆抗体溶于PH 9.5 的0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；

2、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1 的抗体溶液中，置室温90min；

3、将步骤2抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g 下浓缩30min至体积为0.5ml；

4、取0.5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；

5、每次加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将步 骤4获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混匀后室温反应4小时；

6、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟；

7、每次加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清， 重复操作3次；

8、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的TT4磁分离试剂；磁珠保存 液配方为0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存。

9、将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1∶1的比例混匀，即得本发明试剂盒中磁 分离试剂。

第二步：酶反应物制备过程

一、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制1L：

1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl₂ 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl₂ 0.05g于烧瓶中， 然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；

2、调PH，控制PH在7.35-7.45范围内；

3、称取BSA 3g倒入上述烧杯中；

4、最后定容至1000ml，用0.2um滤器过滤即得。

二、碱性磷酸酶ALP与TT4抗原的偶联

1、取TT4抗原1mg放置于1ml玻璃管中；

2、取200ul DMSO溶解抗原使抗原的终浓度到达5mg/ml，充分混匀；

3、按照1mol抗原加入5mol的辛二酸二琥珀酰亚胺酯的摩尔比例加辛二酸二琥珀酰亚胺酯 到步骤2的溶液中，37℃恒温箱中反应1.5小时；

4、按照5mol抗原加入1mol的ALP的摩尔比往步骤3溶液中添加ALP，然后加入1ml的PH 为7.4浓度为0.1M的PB缓冲液，置于37度恒温箱中反应3小时；

5、将步骤4的溶液用PD-10柱纯化，收集纯化液，按照1∶5000的体积添加上述步骤一)获 得的酶反应物稀释液，混合均匀，即得酶反应物。

第三步：

反应增强剂配制步骤，配制1L：

1、称取TRIS1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于10ml 纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

2、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解调PH，控制PH在 7.35-7.45之间；

3、称取Mak33 0.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤。

第四步：

稀释液配制步骤，配制1L：

1、称取NaCl9.0g和BSA 60g于1L的容器中；

2、用移液器将Proclin-300量取0.5ml加10ml纯化水溶解，倒入上述1L的容器中；

3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期 为12个月。

第五步：

校准品和质控品的配制：

校准品浓度分别为20，40，80，150，300ng/ml；质控品浓度分别为40，150ng/ml。

第六步：

清洗浓缩液配制步骤，配制1L：

1、称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；

2、称取5g Tween-20于100ml容器中加20ml水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

3、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L容器中；

4、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；

5、调PH，控制其范围在7.35-7.45之间；

6、最后定容1000ml，完全溶解后用0.2um滤器过滤即得。

第七步：

底物溶液配制步骤，配制1L：

1、称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na₂SO₃ 0.002g和Proclin-300 0.2ml于1L烧杯中；

2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解，调PH，控制其范围在 7.95-8.05之间；

3、加入250ml Lumi-Phos 480后，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml， 混匀后即得。

本发明工作原理：本发明为竞争法化学发光免疫分析法与磁性微粒分离技术相结合的 一种检测方法。在标本、校准品和质控品中加入定量的酶标TT4抗原、结合着磁性微粒的TT4 单克隆抗体及稳定增强剂。37℃孵育后，酶标TT4抗原与标本、校准品和质控品中TT4竞争 的与结合着磁性微粒的TT4单克隆抗体发生特异性结合。在外加磁场中直接沉淀，不需离心 即可分离。倒去上清液，清洗沉淀的复合物，然后加入酶促化学发光底物。底物在酶作用下 被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发 光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度。在检测范围内，反应的发光强度与样本中的 TT4浓度成反比。

本发明的主要创新之处在于：

1、本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系， 与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。

2、本发明公开了一种新的专用稳定增强剂以及清洗液浓缩液，使得反应过程更加稳定可 靠，实验数据灵敏有效，在提高产品性能的同时，并且大大降低了产品成本；

3、试剂盒中的磁分离试剂，酶反应物，稳定增强剂，校准品、质控品，清洗液浓缩液、 稀释液以及底物溶液均是该反应体系下的最优配方，给该试剂盒的使用效期及检测性能提供 了有力保障。

具体实施方式

实施例1、

一、磁珠缓冲液配制操作规程：配方见表1，以配制1L为例：

1、称取TRIS 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96g TWEEN-20于20ml容器中加适量 水使其完全溶解后，倒入上述容器中；

2、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容 器中；然后在1L容器中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；

3、调节PH值，测量其PH值；用HCl或NaOH调PH，测量其PH在7.95-8.05之间即符合要 求；

4、称取BSA(牛血清白蛋白)3g倒入上述容器中；

5、最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.95-8.05之间即符合要求，用0.2um滤器过滤； 过滤完后贴好标签于2-8℃冷库贮存，磁珠缓冲液有效期为12个月；

磁珠缓冲液表1

二、磁分离试剂的制备过程

1、将1.0mg DSS(辛二酸二琥珀酰亚胺酯)溶于50ul DMSO中，即浓度为20mg/ml；取2mg 抗TT4单克隆抗体(天健生物制药(天津)有限公司，浓度为1.89mg/ml)溶于PH 9.5的 0.1mol/L PB缓冲液中至总体积为1ml；

2、计算DSS的投入量，按照以下公式计算：(抗体质量/16000)×10×368/C_DSS)，其中C_DSS指代DSS的物质的量浓度mol/L；

3、用移液枪吸取相应体积的DSS加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；

4、将步骤3抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到sigma2-16k高速冷冻离心机 中在3000g的离心力下浓缩约30min至体积为0.5ml；

5、取0.5ml磁珠，磁珠浓度为0.5g/ml，所述的磁珠直径在0.9μm之间，加入5ml反应杯 中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；

6、每次加入1.5ml PH9.5 0.1mol/L PB，混匀30秒，上架，去上清，重复操作3次；将 步骤4获得的抗体溶液加入到磁珠中，混匀后室温反应4小时，保持混匀状态；

7、加入0.3ml 1mol/L的TRIS溶液37度15分钟，其中TRIS的加样量为1mg抗体加0.15mlTRIS；

8、每次加入1.5ml PH 7.2 0.1mol/L PB清洗已经标记的磁珠，混匀30秒，上架，去上清， 重复操作3次；

9、用100ml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0.05％的TT4磁分离试剂；磁珠保存 液配方为0.1％BSA，0.05％吐温-20，0.02％NaN3，20％乙醇，4℃保存。

10、将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1∶1的比例混匀；

11、贴好标签于2-8℃冷库贮存，磁分离试剂有效期为12个月；

实施例2

一、酶反应物稀释液配制操作规程：配方见表2，以配制1L为例：

1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl₂ 0.05g、Proclin-300 0.2ml和MgCl₂ 0.05g于烧瓶中； 然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；

2、用HCl或NaOH调PH，测量使PH在7.35-7.45范围内；

3、称取BSA 3g倒入上述容器中；

4、最后定容至1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um滤器过滤；

过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月；

酶反应物稀释液表2

二、碱性磷酸酶ALP与TT4抗原的偶联

1、取TT4抗原1mg放置于1ml玻璃管中；

2、取200ul DMSO溶解抗原使抗原的终浓度到达5mg/ml，充分混匀；

3、按照1mol抗原加入5mol的辛二酸二琥珀酰亚胺酯的摩尔比例加辛二酸二琥珀酰亚胺酯 到步骤2的溶液中，37℃恒温箱中反应1.5小时；

4、按照5mol抗原加入1mol的ALP的摩尔比往步骤3溶液中添加ALP，然后加入1ml的PH 为7.4浓度为0.1M的PB缓冲液，置于37度恒温箱中反应3小时；

5、将步骤4的溶液用PD-10柱纯化，收集纯化液，按照1∶5000的体积添加酶反应物稀释液， 混合均匀，即得酶反应物。

实施例3

反应增强剂配制操作规程：配方见(表3)，以配制1L为例：

1、称取TRIS(三羟甲基氨基甲烷，分子式：(HOCH2)3CNH2)1.56g和NaCl 4.23g于1L容 器中；用移液器将Proclin-300量取0.2ml于少量纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L 容器中；

2、用量筒量取800ml纯化水于1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；用HCL或NaOH调PH， 测量其范围在7.35-7.45之间；

3、称取Mak33 0.9g于上述1L容器中；

4、最后定容1000ml，完全溶解后，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，用0.2um 滤器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月；

反应增强剂的配制(表3)

实施例4

稀释液配方见(表4)，以配制1L为例：

1、称取NaCl9.0g和BSA 60g于1L的容器中；

2、用移液器将Proclin-300量取0.5ml加10ml纯化水溶解，倒入上述1L的容器中；

3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um滤器过滤，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期 为12个月。

稀释液的配制(表4)

实施例5

校准品和质控品的配制：

1、最高点：最高浓度点为X，目标点浓度为A，B，C，D，E，F，配制V体积的溶液时，需加入原 料的体积为分别为：表5

  浓度   加入校准品稀释液体积  加入X体积   A   V-A*V/X   A*V/X   B   V-B*V/X   B*V/X   C   V-C*V/X   C*V/X   D   V-D*V/X   D*V/X   E   V-E*V/X   E*V/X   OF   V-F*V/X   F*V/X

2、总甲状腺素(TT4)定量测定试剂盒TT4校准品原料(购于AMG公司，浓度为10mg/ml) 用稀释液(具体配方见实施例4)配制成浓度点为20，40，80，150，300ng/ml；质控品用稀 释液配制的浓度点为40，150ng/ml。

3、完全溶解后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。

实施例6：

清洗浓缩液配制操作规程：配方见(表6)，以配制1L为例：

1、称取TRIS 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；

2、称取5g Tween-20于100ml容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；

3、用移液器将Proclin-300量取0.2ml于盛有10ml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述 1L容器中；

4、用量筒量取800ml纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；

5、用HCL或NaOH调PH，测量其范围在7.35-7.45之间；

6、最后定容1000ml，测PH值，范围在7.35-7.45之间即符合要求，完全溶解后用0.2um滤 器过滤；过滤完后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月；

清洗浓缩液的配制(表6)

实施例7

底物溶液配制操作规程：配方见(表7)，以配制1L为例：

1、称取TRIS 2.35g、NaCl 6.41g、Na₂SO₃ 0.002g和Proclin-300 0.2ml于1L烧杯中；

2、用量筒量取600ml纯化水于1L烧杯中，充分搅拌，直至完全溶解；用HCl或NaOH调PH， 测量其范围在7.95-8.05之间；

3、加入250ml Lumi-Phos 480后，用0.2um滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000ml， 混匀后，贴好标签于2-8℃冷库贮存，有效期为12个月。

化学发光底物的配制(表7)

本发明的测试方法如下

1、加15μl TT4校准品、质控品、待测标本至对应试管底部。

2、加30μl酶反应物至每一试管中。

3、加30μl反应增强剂至每一试管中。

4、加30μl磁分离试剂至每一试管中。

5、用塑料薄膜覆盖试管，多管混匀器轻轻振荡试管架30s后，置37℃水浴30分钟。

6、试管连架放至磁分离器上，确保每支试管都与分离器表面接触，沉淀2分钟。缓慢的倒转 分离器倒出上清液，把倒转的试管连同分离器一起放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去 粘在管壁上的所有液滴。

7、清洗液浓缩液用纯化水稀释20倍后，加200μl稀释后的清洗液至每一试管中，置多管混 匀器上轻轻振荡混匀30s。加样时应避免加样力度过大而导致磁珠溅出。混匀要彻底。

8、重复步骤6、7、6一遍。

9、加200μl底物溶液至试管中混匀3秒，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。

10、如遇到高值HOOK样本，为了避免出现高值HOOK效应，建议临床医师根据其余测试指标 选择合适的稀释倍数对样品进行稀释。

临床试验：

1、检测数据

标本采自1200例正常体检、供血者。样本体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾病，半年内无 输血和大手术史，妇女不在妊娠期和哺乳期。将测值进行统计学分析，得出正常血清参考范 围：49-129ng/ml。与国外知名公司生产的试剂盒的检测结果相比，本发明试剂盒更加精确， 精确到小数点后两位。

本数据仅供参考，不同地区、不同个体以及采用不同方法进行检测，所测得的TT4水平也会 有所不同，建议各实验室建立自己的正常值范围。不可仅凭本方法得出的TT4值作出诊断， 仅作为中间数据参考作用，应结合临床其他资料分析结果，包括病人的具体情况和治疗状况。 通过其他方法得到的样品中的TT4浓度值与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。超出试 剂盒测定范围的样本，系统将无法给出确切的数值。如欲测定其确切的结果，建议稀释后再 进行测定。本试剂盒的检测结果仅供临床参考，不能单独作为确诊或排除病例的依据，为达 到诊断目的，此检测结果要与临床检查、病史和其它的检查结合使用。本品可用于血清样本 的测定，用于其他体液样本中TT4浓度测定的可靠性未得到充分确认。

2、本发明试剂盒性能指标

分析灵敏度定义为：对20次零校准品的测定，取其2倍的平均偏差，其在标准曲线上所对应 的浓度即为分析灵敏度；分析灵敏度：5ng/mL；精密性：CV％≤15.0％；线性范围：5-300ng/ml； 线性系数：r≥0.9900；特异性：

与主要类似物的交叉反应情况：