一种基于功能化金纳米颗粒的酪氨酸酶活性分析方法

摘要

本发明涉及一种基于功能化金纳米颗粒的酪氨酸酶活性分析方法，属于分析化学技术领域。本发明以两端均为酪氨酸的寡肽作为底物，典型的为酪氨酰酪氨酸（Tyr-Tyr）、或两个酪氨酸中间夹杂其他氨基酸残基的寡肽作为酪氨酸酶的底物，生成两端均带邻位羟基的桥联分子，该分子介导经16-巯基十六烷基酸及3-氨基苯基硼酸修饰的金纳米颗粒（APBA/MHDA/AuNPs）的聚集，根据随之产生的紫外-可见光谱的变化可以对酪氨酸酶的活性进行分析。该方法具有极高的灵敏度和良好的线性关系，为临床诊断和食品工业等领域快速、低成本定量分析酪氨酸酶活性提供有效的手段。

说明书

技术领域

本发明是关于一种基于功能化金纳米颗粒的酪氨酸酶活性分析方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

酪氨酸酶（EC 1. 14. 18. 1，Tyrosinase），又称为多酚氧化酶，是一种含铜的金属酶，广泛分布于微生物、动植物及人体中。酪氨酸酶主要参与两个反应过程：催化L-酪氨酸羟基化转变为L-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌经一系列反应后形成黑色素。酪氨酸酶在生物体中具有重要的生理功能，是黑色素生物合成途径中的关键酶，与人体雀斑、褐斑等黑色素过度沉积等疾病的发生有关，与昆虫的蜕皮和果蔬的褐化也有很大关系。因此对酪氨酸酶的活性水平的检测，不仅能为临床疾病如恶性黑色素瘤等诊断和治疗提供依据，同时在食品工业中果蔬保鲜及环境监测等多个领域有重要的意义。

目前国内外已经有报道的关于酪氨酸酶的活性测定的方法主要包括分光光度法、免疫检测法、放射性同位素检测法、高效液相色谱法、荧光检测法等。但这些方法都存在一些局限性。分光光度法操作相对简单，分析时间较短因而是目前酪氨酸酶活性分析中最为常用的方法，但该方法存在着一些不足之处，包括L-左旋多巴的成本较高，检测灵敏度不够高，如果样品组分复杂则干扰因素较多，对于组织细胞样品中的酶活性进行分析时存在缺陷；免疫检测、放射性同位素、高效液相色谱、荧光检测法等方法操作复杂、分析时间长、分析成本高等，因此很难发展成通用的分析手段。近年来一些基于纳米材料或聚合物的电化学、荧光等方法用于酪氨酸酶的活性分析也得到报道，但是这些方法在检测限、灵敏度或者是检测的线性范围等方面都存在一定的缺陷，尚不能应用于对不同生物来源的样品中酪氨酸酶活性进行定量分析。

发明内容

本发明目的是将纳米生物技术、光谱学检测等诸多技术的优势联合起来，建立一种简便快速、成本低，而又具有极高灵敏度的酪氨酸酶活性分析方法。

本发明的技术方案：一种基于功能化金纳米颗粒的酪氨酸酶活性分析方法，以两端均为酪氨酸的寡肽作为酪氨酸酶的底物，在酪氨酸酶的催化和有氧存在的条件下，生成两端带有邻苯二酚基团的衍生物，并进一步生成邻苯二醌衍生物，加入抗坏血酸后，邻苯二醌衍生物还原重新生成邻苯二酚衍生物，后者能够作为配基与硼酸基团结合，从而当酪氨酸酶的产物两端带有邻苯二酚基团的衍生物存在时，作为桥联分子使得表面修饰有16-巯基十六烷基酸MHDA及3-氨基苯基硼酸APBA修饰的功能化金纳米颗粒APBA/MHDA/AuNPs发生聚集，根据随之产生的紫外-可见光谱的变化对酪氨酸酶的活性进行分析。

方法包括以下步骤：金纳米颗粒（AuNPs）的制备及浓缩、功能化金纳米颗粒APBA/MHDA/AuNPs的制备、酪氨酸酶的酶促反应和反应产物的还原、酶活性的紫外-可见光谱检测。

（1）金纳米颗粒（AuNPs）的制备及浓缩

所用玻璃器皿均经王水浸泡，纯水冲洗后晾干备用。将100 mL 0.01%的氯金酸水溶液加入250 mL圆底烧瓶，搅拌并加热至沸腾，剧烈搅拌下快速加入3.5 mL 1%的柠檬酸三钠水溶液，继续加热搅拌15 min后溶液变成酒红色，停止加热，继续搅拌30 min，室温自然冷却。所得AuNPs粒径为13 nm，浓度为3.5 nM。  

取20 mL 3.5 nM的AuNPs溶液放入50 mL圆底离心管中，于4℃下13000 rpm离心20 min，弃去上清液，沉淀重新悬浮于4 mL 1mM、pH 7.0的磷酸盐缓冲液（PBS）中，得到浓度为17.5 nM的浓缩AuNPs溶液。

（2）功能化金纳米颗粒APBA/MHDA/AuNPs的制备

经五倍浓缩的AuNPs溶液（17.5 nM）使用前通氮气5 min用于除去溶液中的氧。将AuNPs溶液与吐温20在1mM pH 7.0的磷酸盐缓冲液（PBS）中混合并放置20 min，使吐温20充分吸附至AuNPs表面，然后加入MHDA溶液（用无水乙醇配制），使得混合物中各物质的终浓度分别为：AuNPs 1.5 nM，吐温20  2.0 mg/mL，MHDA 0.17 mM，在黑暗中静置4 h，使MHDA自组装到AuNPs表面。于4℃下13000 rpm离心20 min除去未反应的吐温20和MHDA，用10 mM pH7.2的4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）缓冲液将得到的MHDA/AuNPs重新悬浮。往MHDA/AuNPs悬浮液中加入APBA，偶联剂1-[3-(二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）至混合溶液中各物质的终浓度分别为MHDA/AuNPs 2.5 nM，APBA 0.1 mM，EDC 0.8 mM，NHS 2.0 mM，在pH5.0的环境下搅拌反应3.5 h。于4℃下13000 rpm离心20 min除去未反应的化合物，修饰好的APBA/MHDA/AuNPs悬浮于10 mM pH 7.2的HEPES缓冲液中，4℃保存。

（3）酪氨酸酶的酶促反应和反应产物的还原

以两端均为酪氨酸的寡肽作为酪氨酸酶的底物，取10 μL浓度为5 mM的底物溶液，加入80 μL 50mM，pH 6.5的PBS缓冲液，再加入10 μL具有合适稀释倍数的酪氨酸酶溶液，使得反应体系的体积为100 μL。于25℃有氧条件下反应30 min，然后将反应液加热至80℃使酪氨酸酶失活以终止反应。往反应后的混合液中加入5 mM的抗坏血酸50 μL，在室温下反应15 min，使产生的邻苯二醌衍生物完全还原生成邻苯二酚衍生物。

（4）紫外-可见光谱检测

往上述产物溶液中加入100 μL浓度为9.5 nM的APBA/MHDA/AuNPs，混合均匀后静置15 min，然后测定紫外-可见光谱，以530 nm处的吸光度对酪氨酸酶进行定量分析，在酪氨酸酶活性为1×10^-10 U/mL~1×10^-8 U/mL范围，吸光度的数值（A_530nm）与酪氨酸酶活性的对数值（lg[Tyrosinase]）之间存在线性关系，见附图1、附图2。根据公式y = -0.0359x + 0.6518可以计算出待测样品的酶活力，式中y为A_530nm，x为酪氨酸酶活性的对数值（lg[Tyrosinase]）。

本发明的有益效果：①方法简便快速，灵敏度极高，利用不同底物进行分析时，还能获得不同的检测范围，从而适合对不同生物来源的酪氨酸酶活性进行分析，对于研究酪氨酸酶的反应动力学、活性调节、相关药物开发、疾病的临床诊断、食品工业应用都是非常有意义的；②该方法作为基于功能化金纳米颗粒的酶活性分析的典型实例，在方法学上具有普遍借鉴意义，通过恰当的底物设计和在金纳米颗粒表面修饰适当的基团，这种产物诱导AuNPs聚集的方法可以设计应用于多种酶活性的高灵敏度、高选择性分析。

附图说明

图1 加入0, 1×10^-10, 1×10^-9, 1×10^-8 U/mL的酪氨酸酶催化底物反应后的产物与功能化金纳米颗粒作用后的紫外-可见光谱曲线。

图2 在酪氨酸酶活性为1×10^-10~1×10^-8 U/mL范围内，紫外-可见光谱中A_530nm与酪氨酸酶活性的对数值（lg[Tyrosinase]）之间的线性关系曲线。

图3 以酪氨酰甘氨酰酪氨酸（Tyr-Gly-Tyr）为底物，紫外-可见光谱中A_530nm与酪氨酸酶活性的对数值（lg[Tyrosinase]）之间响应范围为1×10^-8~1×10^-5 U/mL，其中在1×10^-8~1×10^-6 U/mL范围内为线性关系。

具体实施方式

实施例1：以酪氨酰酪氨酸（Tyr-Tyr）为底物，在酪氨酸酶活性为1×10^-10~1×10^-8 U/mL范围内获得A_530nm与lg[Tyrosinase]的线性关系曲线

按表1加入各种溶液构成酶促反应体系：

表1

反应完毕加入100 μL浓度为9.5 nM的APBA/MHDA/AuNPs，混合均匀后静置15 min，然后测定紫外-可见光谱，并得到A_530nm。以A_530nm对酪氨酸酶活性的对数值lg[Tyrosinase]作图，得到图2所示线性关系图。

实施例2：以酪氨酰酪氨酸（Tyr-Tyr）为底物，测定未知样品中酪氨酸酶的活力

样品在测定前需要进行适当的稀释，使稀释后的样品中酪氨酸酶活力在1×10^-10~1×10^-8 U/mL范围内，以满足A_530nm和lg[Tyrosinase]之间的线性关系范围。取5 mM Tyr-Tyr 10 μL，加入50 mM pH6.5 PBS 80 μL，再加入稀释后的样品10 μL，混合均匀于25℃有氧条件下反应30 min，然后将反应液加热至80℃终止反应，加入5 mM抗坏血酸50 μL，室温下反应15 min后加入100 μL浓度为9.5 nM的APBA/MHDA/AuNPs，混合均匀后静置15 min，然后测定紫外-可见光谱并得到A_530nm。将吸光度数值代入公式y = -0.0359x + 0.6518可以计算出稀释后样品的酶活力，式中y为A_530nm，x为稀释后样品中酪氨酸酶活性的对数值（lg[Tyrosinase]），再乘以稀释倍数后得到样品中酪氨酸酶的活力。

实施例3：以酪氨酰甘氨酰酪氨酸（Tyr-Gly-Tyr）为底物测定样品中酪氨酸酶的活力

以5 mM Tyr-Gly-Tyr溶液替代5 mM Tyr-Tyr，即使得反应体系中底物Tyr-Gly-Tyr的浓度为0.5 mM，其余试剂的添加和操作与表1相同，在完全等同的条件下，以Tyr-Gly-Tyr的反应产物作为桥联分子诱导APBA/MHDA/AuNPs发生聚集，造成紫外-可见光谱中A_530nm对lg[Tyrosinase]变化的酪氨酸酶的活力范围为1×10^-8~1×10^-5 U/mL，其中在1×10^-8~1×10^-6 U/mL范围内为线性关系，见图3。