16个基因座快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种检测人类基因组DNA16个基因座的快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒，该试剂盒包括扩增前试剂和扩增后试剂；所述扩增前试剂包括：PCR缓冲液、MgCl

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测人类基因组DNA中多个STR基因座的试剂盒，具体涉及一种检测15个STR基因座和1个性别鉴定基因座的快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒，属于生物检测技术领域。

 

背景技术

短串联重复序列基因座（STR）是目前普遍应用的遗传标记。90年代初STR基因座多态性的发现，特别是由于STR基因座的片段小、容易扩增，适宜于检验微量和降解检材，而且各基因座的扩增条件相似而能够复合扩增，因而具有灵敏、准确、快速、信息量大等优点。尤其是在建立DNA数据库方面，STR复合扩增技术具有极大的优越性，因此法医学界以及一些大的公司均投入大量的资金对其进行了开发性的研究。90年代中后期以美国ABI公司为代表的研发商建立起了荧光复合扩增体系。目前最具代表性的是ABI（Applied Biosystems, USA）公司的Identifiler^TM和Promega（USA）公司的PowerPlex-16荧光检测试剂盒。

法医DNA分析就是利用DNA分型技术，确定现场法医物证的DNA基因型，并应用同样技术确定犯罪嫌疑人的DNA基因型，通过两者的比对，从而认定犯罪事实或排除犯罪嫌疑。随着法医DNA分型技术的发展，目前已经能对类似血痕、精斑、唾液斑、毛发、骨骼等进行DNA分型，达到认定水平，成为刑事技术中科技含量最高、实用性最强的方法之一，检验结果得到了司法机关特别是审判机关的普遍采信，DNA分型技术成为刑事侦查和法庭审判的最重要依据之一。

目前的STR分型技术，往往包括样本检材的DNA提取、PCR扩增和分型检测三项主要操作步骤，获得一个样本的最终分型结果往往需要8个小时以上。缩短样本DNA检验时间，在实际检案中将有利于快速锁定犯罪嫌疑人，或排除无辜人员，在案件侦破过程中具有重要意义，已经成为科研攻关的一个新的重点，是法庭科学DNA分型技术发展的必然方向。

 

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种能够缩短获得样本最终分型结果时间的16基因座快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒。

为了实现上述目，采取的技术方案：

一种16个基因座快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs和牛血清蛋白的混合物，热启动快速Taq酶，16对引物混合物以及超纯水；

其中16对引物混合物为：

，上述16对引物中每对中至少有一个5’端被荧光标记。

所述的16个基因座分为4组，并其对应的引物对分别用4种不同的颜色的荧光染料进行标记，所述的四种荧光染料为蓝色荧光染料6-FAM、绿色荧光染料HEX；黄色荧光染料TAMRA、红色荧光染料标记 ROX；内标选用橙色荧光SIZ。

所述的16个基因座分为4组，并其对应的引物分别用4中不同的颜色的荧光染料进行标记，分组方式为： Amelogenin、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539和D6S1043为一组，采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM；TPOX、TH01、D2S1338和CSF1PO为一组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX；vWA、D5S818和FGA为一组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA；D8S1179、D21S11和D18S51为一组，采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。

使用所述的试剂盒为PCR缓冲液的pH值为8.0-9.0，镁离子浓度为1.5-3.5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300μM，牛血清蛋白在所述PCR扩增体系中的终浓度为0.1-1mg/ml，以及热启动快速Taq酶的用量为0.1-0.4U/μL，16对引物混合物中的单对引物终浓度为

一种16个基因座快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒的应用，其特征在于其用于DNA分型。

具体来说：

所述的16个基因座为： Amelogenin、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、D13S317、D16S539、D18S51、D21S11、TPOX、TH01、CSF1PO、vWA、FGA。本发明提供了荧光标记复合扩增体系的基因座组合设计方案。本发明分别选用了蓝、绿、黄、红、橙5色荧光组合方案。这种基因座组合方式使得仅需标记四种荧光就可实现这16个基因座在同一反应中扩增，同时将全部基因座扩增产物控制在400bp以内而实现高灵敏度。

确定5色荧光组合方案的基础上，通过大量反复实验，自行设计出基因座组合方式，以下为其中三种产品组合方式，第一种：Amelogenin、D3S1358、D13S317、D7S820和D16S539一组，采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM；TPOX、TH01、D2S1338、CSF1PO为一组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX；vWA、D5S818、FGA、D6S1043为一组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA；D8S1179、D21S11和D18S51为一组，采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。第二种：Amelogenin、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539和D6S1043为一组，采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM；TPOX、TH01、D2S1338和CSF1PO为一组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX；vWA、D5S818和FGA为一组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA；D8S1179、D21S11和D18S51为一组，采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX。第三种：Amelogenin、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539和CSF1PO一组，采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM；TPOX、TH01、D2S1338和D6S1043为一组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX；vWA、D5S818和FGA为一组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA；D8S1179、D21S11和D18S51为一组，采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。

进一步使用所述的试剂盒进行PCR复合扩增反应的条件：PCR扩增体系的pH值为8.0-9.0，镁离子浓度为1.5-3.5mM，4种dNTP的终浓度各为200-300μM，牛血清蛋白在所述PCR扩增体系中的终浓度为0.1-1mg/ml，以及热启动快速Taq酶（宝生物工程 (大连) 有限公司）的用量为0.1-0.4U/μL。 

进一步，使用所述试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在一个复合扩增反应体系中同时扩增15个STR基因座和1个性别鉴定基因座。

所述的16对引物为分别位于所述16个基因座两侧并用于扩增该基因座的引物，其中每对引物中有一条引物的5’端进行荧光染料标记，引物序列与引物浓度见下表，按表中引物浓度配置成5X的引物混合物。

所述16个基因座的复合扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用多道或单道毛细管电泳进行检测。

进一步地，其中所检测的人基因组DNA为：使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA；所述的来源样本为：来源于人类的：滤纸片血液/口腔拭子样本、FTA卡血液/口腔拭子样本、口腔拭子样本、血液/痕、组织、精斑、唾液斑、毛发或骨骼检材。

进一步地，使用所述的试剂盒进行PCR扩增时，扩增阶段反应在任何型号的PCR仪上进行,扩增程序：94-98℃ 30-120s；26-32个循环的94-98℃ 1-15s，55-65℃ 5-30s，72℃ 5-30s；72℃ 1-5min，扩增约需时40-50min。

本发明实施例的有益效果是：使用现常用商品化试剂盒进行PCR扩增常需要3h左右的时间；而使用本发明的试剂盒，进行40-50min的PCR扩增，即可进一步进行遗传分析仪检测，完成STR分型检测，大大缩短了获得样本最终分型结果的时间。

 

附图说明

图1是本发明的试剂盒基因座排布1对血斑来源DNA扩增后的分型结果；

图2是本发明的试剂盒基因座排布1对精斑来源DNA扩增后的分型结果；

图3是本发明的试剂盒基因座排布1对唾液来源DNA扩增后的分型结果；

图4是本发明的试剂盒基因座排布1对脱落细胞来源DNA扩增后的分型结果；

图5是本发明的试剂盒基因座排布1对肌肉组织来源DNA扩增后的分型结果；

图6是本发明的试剂盒基因座排布1对毛发来源DNA扩增后的分型结果；

图7是对照-常规荧光标记STR复合扩增检测系统对血斑来源DNA扩增后的分型结果；

图8是对照-常规荧光标记STR复合扩增检测系统对精斑来源DNA扩增后的分型结果；

图9实施例3对肌肉来源DNA扩增后的分型结果；

图10实施例4对毛发来源DNA扩增后的分型结果；

图11实施例5亲子鉴定分型结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1 

16个基因座快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒检测提取纯化的DNA样本，基因座排布按第一种排布。即排布方式为：Amelogenin、D3S1358、D13S317、D7S820和D16S539一组，采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM；TPOX、TH01、D2S1338和CSF1PO为一组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX；vWA、D5S818、FGA和D6S1043为一组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA；D8S1179、D21S11和D18S51为一组，采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。

1、各种检材样品由××公安局提供。

2、各种检材的基因组DNA提取

各种检材基因组DNA的提取参考《GA/T 383-2002 法庭科学DNA实验室检验规范》进行。

3、扩增和扩增产物的检测分析

3.1 16基因座快速PCR荧光检测试剂盒

3.1.1 PCR扩增体系：

3.1.2 PCR扩增程序：

3.2 对照技术/常规技术：

本实施例中，常规技术试剂使用AGCU 17+1 STR荧光检测试剂盒（专利公开号：CN 101440410A）。

3.2.1 PCR扩增体系：

组分体积模板经步骤2处理得到 Reaction Mix10.0 μLPrimers 17+1 5.0 μL热启动Taq酶（5U/ μL）0.5 μLsdH₂O补足至25.0μL

3.2.2 PCR扩增程序：

   4、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测

由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物〔（0.5μL分子量内标）×（进样数）＋（12μL去离子甲酰胺）×（进样数）〕。将12.5μL上样混合物与1μL扩增产物或等位基因分析标准物混合，避免产生气泡。95℃变性3min，冰浴3min，并尽快电泳。用遗传分析仪检测分析。

5、结论

本发明对以上各种常规检材抽提得到的DNA均能获得完整分型，结果如图1-8所示，其中血斑和精斑来源的DNA分别同时用本发明和常规试剂盒进行检测，结果表明，两种试剂盒对同一来源的样本的相同基因座分型结果是一致的。

以上实施例中所用的不同pH的2.5×PCR缓冲液，用不同pH值的Tris-HCl缓冲液配制，1×PCR缓冲液中的Tris-HCl浓度为10mM，KCl浓度为50mM；本发明中所用的牛血清蛋白、Taq DNA聚合酶以及其他试剂及材料均为市售产品。

注：实施例使用的PCR仪均为博日科技Lifepro型PCR扩增仪。

实施例2 

16个基因座快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒在不同型号的PCR仪上的应用

使用采集于同一个体的滤纸片血斑作为检测对象，样本及具体实施过程与实施例1完全一致，在扩增步骤使用多台PCR仪进行平行实验，考察在不同PCR仪使用16基因座快速PCR荧光检测试剂盒试剂进行PCR扩增的时间。扩增结果同图1。

结果如下表：

PCR仪名称/型号PCR仪厂家扩增时间Veriti美国ABI35min9700美国ABI50minLife Express TC-96/T/H(a)杭州博日41minLifepro杭州博日40minDNA Engine美国Bio-Rad41minPiko? Thermal Cycler芬兰Finnzymes Instruments41minT-Grandient德国Biometra50 min

结果与实施例1血滤纸扩增结果相同，16个基因座均得到完整的分型结果并一致。

实施例3

16个基因座快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒检测提取纯化的DNA样本，基因座排布按第二种排布。即排布方式为： Amelogenin、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539和D6S1043为一组，采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM；TPOX、TH01、D2S1338和CSF1PO为一组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX；vWA、D5S818和FGA为一组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA；D8S1179、D21S11和D18S51为一组，采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。

以实施例1中的毛发肌肉DNA为模版，进行检测。

具体实施过程同实施例1.检测结果如图9.结果与实施例1中肌肉检测结果一致。

实施例4

16个基因座快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒检测提取纯化的DNA样本，基因座排布按第三种排布。 即排布方式为：Amelogenin、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539和CSF1PO为一组，采用蓝色荧光染料标记，荧光标记物为6-FAM；TPOX、TH01、D2S1338和D6S1043为一组，采用绿色荧光染料标记，荧光标记物为HEX；vWA、D5S818和FGA为一组，采用黄色荧光染料标记，荧光标记物为TAMRA；D8S1179、D21S11和D18S51为一组，采用红色荧光染料标记，荧光标记物为ROX；内标选用橙色荧光标记，荧光标记物为SIZ。

以实施例1中的毛发来源DNA为模版，进行检测。

具体实施过程同实施例1，检测结果如图10所示，结果与实施例1中毛发检测结果一致。

实施例5

应用16个基因座快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒进行亲子鉴定

1、收集亲子鉴定案件中的血斑：亲子鉴定样本由××公安局提供。

2、各种检材的基因组DNA提取

各种检材基因组DNA的提取参考《GA/T 383-2002 法庭科学DNA实验室检验规范》进行。

3、扩增检测

按照实施例1进行PCR扩增、遗传分析仪检测并最终获得分型结果。

亲子鉴定的基本原理为：根据孟德尔遗传定律，亲代基因型决定子代基因型。在没有基因突变、分型差错的前提下：① 孩子的一对等位基因必定是一个来自父亲，一个来自母亲；② 孩子不可能带有双亲均没有的等位基因。

用实施例1方法检测一例父—女—母三联体亲子关系，其结果见附图11。

在附图11中，各色图中各行依次为孩子、父亲、母亲的相应检测结果。

由附图11得到本实验的亲子鉴定父—子—母基因分型如下表1：

表1：

PI为父权指数，又称亲子关系指数，是指假设父提供生父基因的可能性（X）与随机男人提供生父基因的可能性（Y）的比值，表示假设父为孩子生父比随机男子为孩子生父的可能性大多少倍，即PI=X/Y。

    PI=X/Y＝∑f×c/∑f×p

    f 表示生母给孩子必需等位基因机会；

    c表示被控父亲给孩子必需等位基因机会；

    p 表示随机男人给孩子必需等位基因机会，等于必需等位基因频率；

联合父权指数CPI，为各个不连锁基因座PI的乘积；

相对亲权概率（RCP）＝（CPI/（CPI+1））×100％；

根据上述计算，本实验中父—子—母三联体亲子鉴定RCP值为0.99999999936 %，认定亲子关系。

本发明的检测系统同时适用于经过提取过程所得DNA样本的扩增，如血液/痕、口腔拭子、组织、精斑、唾液斑、毛发、骨骼等检材来源DNA样本的扩增。

本发明实施例可利用提取得到的人基因组DNA为起始材料，只需进行约40-50min的核酸扩增，即可进行STR分型检测，大大缩短了获得样本最终分型结果的时间。

以上所述的实施例，只是本发明较优选的具体实施方式的一种，本领域的技术人员在本发明技术方案范围内进行的通常变化和替换都应包含在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110>  无锡中德美联生物技术有限公司，上海市公安局物证鉴定中心

 <120>  16个基因座快速复合PCR扩增荧光检测试剂盒及其应用

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<160>  32   

<170>  PatentIn version 3.3

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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gttctcctgc tcttgaacat aag                                             23

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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agaagcaatg tgtgcatgga gg                                              22

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<212>  DNA

<213>  人工序列

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gggtcaagag cttgtaaag                                                  19

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<212>  DNA

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ttgtgtgtgc atctgtaag                                                  19

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<212>  DNA

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taacgattcc acatttatct cat                                             23

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tcagctgact atggattatt tt                                              22

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acagaagtct gggatgtgga tg                                              22

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gcccaaaaga cagaaagac                                                  19

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gccccactgc agtccaatct g                                               21

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atgaaatcaa cagaggcttg c                                               21

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acccctgggc tctgtaaaga tag                                             23

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gtaagcttaa actgggaagc tg                                              22

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aacctgagtc tccaaggact agc                                             23

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ttccacacac cctggccatc ttc                                             23

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tgctacatcc ctacctaggt a                                               21

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gaaatggaat tcctactggc taa                                             23

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aacaggactt agggaccctc ca                                              22

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ggctgtggct ggtcttaacc tc                                              22

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tcacggtctg aaatcgaaat                                                 20

 

 

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tgtgacaagg tgattttcca t                                               21

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gctgaggcag gaggagttcg g                                               21

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cccaagtgaa tgccttctat                                                 20

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tgtagattat ttttgtggga a                                               21