一种大通量鉴定苏云金芽孢杆菌毒力基因的方法

摘要

本发明提供了一种基于生物信息学的方法挖掘苏云金芽孢杆菌毒性基因的方法。本发明通过对Bt混合基因组进行测序、数据组装，获得ORFs，与现有功能基因进行比对，鉴定具有同源性的ORFs，再通过基因克隆的方法获得该功能基因，实现了大规模、高通量、经济的新型模式基因的鉴定和挖掘。本方法可以对Bt菌株中所含的基因包括毒性或者毒性相关以及一些功能基因进行挖掘，还可用于对一个地区基因的类型分布的评价。本方法确定的Bt毒力基因可应用于转基因农作物中，使其具备相应抗性，具有重要的应用和经济价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种鉴定苏云金芽孢杆菌毒 性基因的方法及其应用。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏 阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活 性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白(Insectididal crystal  proteins，简称ICPs)，ICPs是由cry基因编码的，对敏感昆虫有强烈 毒性，而对高等动物和人无毒性。近几十年来，Bt已广泛应用于控 制多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目等害虫。此外，Bt还对膜翅目、同 翅目、直翅目、食毛目等多种害虫及植物病原线虫、螨类、原生动物 有控害作用。目前在农田害虫、森林害虫及卫生害虫的防治中Bt已 成为化学合成农药的有力替代品，Bt还是转基因抗虫工程植物重要 的基因来源。

自1981年Schnepf从菌株HD-1Dipel中克隆了第一个能表达杀 虫活性的基因以来，人们已经分离克隆了390多种编码杀虫晶体蛋白 的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、 亚群、类和亚类。一般而言，Cry1，Cry2和Cry9等毒蛋白对鳞翅目害 虫有效；其中研究的最多的是Cry1和Cry9类蛋白，它们编码的杀虫 晶体蛋白分子量为130-140kD，许多基因目前已被广泛应用于植物的 鳞翅目害虫的防治。苏云金芽胞杆菌以色列亚种(B.thuringiensis subsp. israelensis，简称Bti)产生的毒素蛋白对蚊虫具有很好杀虫活性，被广 泛运用于蚊虫的防治。同时，Cyt蛋白具有溶细胞性，对某些Cry蛋 白具有增效作用及延缓昆虫的抗性。

由于大规模和反复使用苏云金芽胞杆菌，许多昆虫种群已相继在 不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。上世纪80年中期开始，抗 性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(M cGaughey，W.H.1985. Science.229：193-195)，原因主要是持续使用单品种的Bt以及Bt转基 因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。1985 年，McGaughey报道仓库谷物害虫印度谷螟(Plodia interpunctella) 在Dipel(Bt subsp.kurstaik HD-1的商品制剂)的选择压力下，繁殖15 代后，抗性增加97倍；在高剂量选择压力下，抗性可增加250倍。 1990年，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显 的抗性(Tabashnik，B E，et al.1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91： 4120-4124)，上世纪90年代以来，在我国应用Bt杀虫剂时间较长的 深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降， 意味着抗性已经形成。目前发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对 Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在 Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性。

为避免抗性昆虫所造成的损失，寻找新的高毒力基因资源是解决 这个问题的有效途径，这对我国的生物防治有着十分重要的意义。而 传统的寻找新基因的方法几乎都是基于PCR，常用的方法有多重 PCR，PCR-RFLP，Exclusive PCR，随机扩增多态性DNA(RAPD)鉴定， 核酸分子杂交，基因芯片，蛋白鉴定。这些方法都有其缺点以及不足， 例如采用PCR相关方法需要合成大量的引物，对于不同的基因类型 需要进行多次的PCR，十分耗时。核酸分子杂交，则需要合成大量的 DNA探针等，这些方法对于一些与已发现的基因同源性低，很新的 基因不能有效的识别，因此会失去大量的新模式基因。

发明内容

本发明的目的在于针对传统鉴定新基因方法的不足提供一种新 的鉴定Bt毒力基因资源的方法。

本发明的目的还在于提供一种大规模、高通量的获得Bt毒力基 因的方法。

本发明的技术方案如图1所示。本发明是混合多株Bt菌株的基 因组，进行测序，通过测序结果的组装，结合与数据库PFAM，GO， KEGG，Trimble的比对结果，提取毒力基因相关的CDS序列，通过 NCBI的比对结果对所选的毒力基因相关CDS进行分类，可鉴定出总 基因组中所含的基因类型。再根据比对结果设计相应的引物，提取所 选菌株的基因组，使用所设计的引物对待测菌株的基因组进行PCR 扩增，克隆得到大量的Bt毒力基因。

本发明提供了一种高通量鉴定细菌功能基因的方法，包括以下步 骤：

(1)选取在光学显微镜或者扫描电镜下具有伴胞晶体的菌株作 为目标菌株，提取质粒和基因组后，混合；

(2)对混合后的质粒和基因组进行小片段文库测序，将测序数 据进行组装，得到测序短序列(reads)组装为长的片段重 叠群(contigs)进而组装为一定长度的片段(scaffolds)；

(3)利用软件分析步骤(2)中片段(scaffolds)中的开放阅读 框ORFs，与生物信息数据库比对进行注释得到与功能基因 具有同源性的ORF-1；

(4)将步骤(3)获得的ORFs-1与现有菌种的功能基因比对， 鉴定出与功能基因具有同源性的ORFs-2，即鉴定出总基因 组中所含的基因类型。

进一步，可根据上述步骤(4)中同源性的ORFs-2设计引物， 进行PCR扩增，克隆获得细菌的功能基因。

优选地，所述细菌为苏云金芽孢杆菌。

优选地，所述功能基因可以为cry、cyt、vip毒力基因、毒力因 子调控基因和/或转录基因。

其中，步骤(2)中所述的数据组装，其参数为kmer 63。

其中，步骤(3)中所述的与生物信息数据库为KEGG、PFAM、 GO、NR、Swiss-Prot和/或TrEMBL。

其中，NR、KEGG、Swiss-Prot和TrEMBL采用的是Blast，其 参数为e-value 1e^-5；PFAM的注释采用的是InterProScan，GO的注释 基于NR注释结果的Blast2GO比对。

本发明提供了上述方法在细菌毒力资源鉴定中的应用。

本发明还提供了一种大规模获得苏云金芽孢杆菌毒力基因的方 法，包括以下步骤：

(1)选取具有伴胞晶体的晶体类型丰富的Bt菌株，提取质粒和 基因组后，混合；

(2)对混合基因组进行小片段文库测序，将测序数据进行组装， 得到测序短序列(reads)组装为长的片段重叠群(contigs) 进而组装为一定长度的片段(scaffolds)；

(3)利用软件分析步骤(2)中scaffolds中的开放阅读框ORFs， 与生物信息数据库KEGG、PFAM、GO、Swiss-Prot和/或 TrEMBL比对，抽提出与功能基因相关的ORFs-1；

(4)将步骤(3)获得的ORFs-1与现有Bt cry/cyt/vip基因比对， 鉴定出与cry/cyt/vip基因具有同源性的ORFs-2；

(5)根据cry/cyt/vip基因具有同源性的ORFs-2序列设计引物， 以所属菌株的基因组为模板进行PCR扩增，将扩增产物进 行克隆，获得Bt毒力基因。

由于Bt毒力基因往往具有抗虫性或溶细胞活性，本领域技术人 员能够预见，将本发明方法中鉴定并克隆的Bt毒力基因与表达载体 可操作地连接，得到能够表达的蛋白重组载体，进而可以通过诸如农 杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等转基因方法，将所述表达载 体导入宿主，得到转相应抗性基因的转化体，例如农作物或者果树等 植物，使其具备抗虫活性。因此本发明方法可应用于制备植物杀虫剂， 进一步可应用于制备转Bt基因的植物。

本发明从基因组出发，通过生物信息学的方法实现了大规模、高 通量、经济、适用的新型模式基因的鉴定和挖掘。本领域技术人员可 根据本发明公开的方法，混合数株Bt基因组或者质粒，可以采用不同 覆盖度的测序方法，对Bt中所含的基因包括毒性或者毒性相关以及一 些功能基因进行挖掘，同时可以用于对一个地区Bt基因的类型分布 的评价。

本领域技术人员还可以根据本发明公开的方法从ORF比对结果 提取出其他研究方向的相关基因。例如可以从KEGG通路的比对结 果中选择与Bt菌毒力代谢相关的调控基因(图2)。这对于扩宽Bt 模式基因的基因谱以及杀虫谱是至关重要的。传统的Bt毒力基因是 不能得到这些额外的相关数据的，因此本发明具有重要的经济价值和 应用前景。

附图说明

图1是本发明方法的技术路线；

图2显示的是KEGG种各类基因的分类，其中调控毒素基因的调 控因子如箭头所示；

图3是菌株扫描电镜观察图；其中图3a表示的是菌株BTMC28 的晶体，晶体如箭头所示呈圆形；图3b表示的是菌株E65-3的晶体， 晶体如箭头所示呈现菱形和正方形；图3c表示的是菌株YWC2-8的 晶体，晶体如箭头所示圆形；图3d表示的是菌株Bm59-2的晶体，晶 体形状如箭头所示呈现出圆形；图3e表示的是菌株hs18-1的晶体 类型，晶体如箭头所示呈现出圆形。

图4插入片段分配频率；

图5显示的是所有引物在各个菌株所扩增出的片段的凝胶电泳 图的总和。其中M，marker；1，cry52Ba1(Bm59-2)；2，cry39ORF2 (hs18-1)；3，Binary(E65-3)；4，cyt2Aa(BtMC28)；5，cyt1Da (BtMC28)；6，cry2Aa(YWC2-8)；7，cry53Aa(BtMC28)；8，cry54Aa (BtMC28)；9，cry30Fa(BtMC28)；10，crylAc(YWC2-8)；11，cry40Ba (BtMC28)；12，cry8Ca(YWC2-8)。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的 限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。

实施例1

1、采用本实验室于四川省沐川原始森林地区土壤中分离得到的 5株苏云金芽孢杆菌BtMC28(保藏编号为CGMCC No.2719，已在中 国专利CN101503666B中公开；Bm59-2保藏编号为CGMCC No.2871，已在专利号为ZL 200910081598的发明专利申请中公开； E65-3保藏编号为CGMCC No.5337；hs18-1保藏编号为CGMCC No.2718，已在专利号为ZL200910081594.2的发明专利申请中公开； YWC2-8保藏编号为CGMCC No.2860，已在专利号为 ZL200910081599的发明专利申请中公开。扫描电镜(5000×)观察 上述5株菌株，其晶体类型丰富，见图3。

根据参照文献【ArArturo Reyes-Ramirez，Jorge E.Ibarra.2008. Plasmid patterns of Bacillus thuringiensis type strains. Appl.Environ.Microbiol.74：125-129.】中的方法分别提取这5株菌株的 基因组。然后将基因组混合。

2、混合基因组送至华大基因公司采用Illumina HiSeq paire-End 小片段文库测序。整体测序深度在50倍以上。

3、采用Velvet 1.1.05对测序结果进行整理以及组装，参数为kmer 63，将测序所得的Reads拼接为一些contigs进而将这些contigs组装 为一定长度的scaffolds。共得到了12.25Mb的组装数据量和12696个 平均长度为756bp的开放阅读框，其GC含量为35.64％。测序数据 以及组装结果如表1所示，插入片段分配频率见图4。

表1数据组装结果

4、采用GLIMMER 3.02软件分析出这些组装的scaffolds中的开 放阅读框ORFs，将这些ORFs比对锚定到数据库KEGG，PFAM，NR， GO，Swiss-Prot，TrEMBL，数据库KEGG，NR，Swiss-Prot，TrEMBL 参数e-value 1e-5进行比对，数据库GO注释是根据NR数据库比对采 用的是Blast2GO，PFAM采用的是InterProScan.抽提出与毒力基因具 有同源性的ORFs，本实施例中称为ORFs-1.

5、将4中得到的与毒力基因相关的ORFs-1与所有的cry，cyt，vip 基因进行比对，最终得到与这些毒力基因具有同源性的ORFs-2，将 ORFs-2在NCBI中的BlastX中进行比对，最终鉴定出这些混合菌株 中所含的所有毒力基因类型。

其中，Bt MC28中鉴定出了cry30Aa，cry54Fa，cry53Aa，cytlDa， cyt2A，cry40Ba类基因(其中cry30Aa，cry54Fa，cytlDa，cyt2Aa这些基因 组装的ORFs与NCBI BlastX比对结果显示它们直接是全长基因)；

YWC2-8中得到了cry8Ca，crylAc，cry2Aa全长基因；

E65-3中鉴定出了binary基因；

Bm59-2中鉴定出了cry52Bal；

hs18-1鉴定出了Cry39ORF2。

6、根据BlastX比对结果，设计相应的引物(表2)分别对5株菌 株所含的基因进行扩增。

7、基因的克隆，使用Trans1-T1(购自全式金公司)克隆载体， 克隆扩增片段，测序(华大基因)得到所有的基因并确定出基因所在 的菌株。

表2注释基因的相关引物

PCR反应体系：

热循环反应：94℃预变性5min；94℃变性50s，退火温度根据引 物而定，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min；4℃停止反应。 扩增反应产物在0.7％琼脂糖凝胶上电泳，置凝胶成像系统中观察 PCR扩增结果。结果如图5所示，通过扩增得到了相应大小的的序列， 将该序列进行测序与预测序列一致。

预测在所有的ORF-2中，包括了cry30Aa，cry54Fa，cytlDa， cyt2Aa，cry53Aa，cry40Ba，cry8Ca，crylAc，cry2Aa，binary，cry52Bal 和Cry39ORF2基因片段，通过PCR以及基因克隆测序表明，这些片 段所代表的基因均能在菌株中扩增出来，并且预测结果中cry30Aa， cry54Fa，cytlDa，cyt2Aa片段和扩增得到的基因长度完全相同，这表 明通过本方法可以从大量菌种资源中简便的直接得到苏云金芽孢杆 菌毒力基因及其全长基因。