一种化学修饰的生麦芽糖淀粉酶

摘要

本发明公开了一种化学修饰的生麦芽糖淀粉酶，属于酶工程领域。通过HNO

说明书

技术领域

本发明涉及一种生麦芽糖淀粉酶的化学修饰，尤其是一种利用HNO2修饰生麦芽糖淀粉酶的化学修饰方法，属于酶工程领域。 

背景技术

麦芽糖(Maltose)是由两分子D-葡萄糖通过小1，4-糖苷键连接的还原性二糖，有α和β两种异构体。麦芽糖是淀粉糖的一种，营养价值高，甜味适口，甜度只有蔗糖的1/3，不参加胰岛素代谢，不易吸潮，耐高温，保湿性好，抗结晶，清凉透明。由于麦芽糖具有以上优良性能，在食品、医药等行业中得到广泛应用。目前国内市场上的麦芽糖产品，以饴糖、高麦芽糖浆为主，也有超高麦芽糖浆产品，但高纯度麦芽糖或结晶麦芽糖产品很少。 

因为在国内依然采用传统方法制备麦芽糖，这种生产方法主要是由液化、糖化、脱色、离子交换、浓缩等独立的单元操作组合而成。采用传统方法得到的麦芽糖浆的浓度最高不超过85％。要获得98％以上的高纯度麦芽糖需要经过多重精制，工艺复杂，生产成本很高。而使用生麦芽糖酶生产麦芽糖浆作为一种成节能降耗的生产技术，已成为新趋势。 

生麦芽糖α-淀粉酶(Maltogenicα-amylase，MAase)，全称1，4-α-D-葡聚糖α-麦芽糖基水解酶[1，4-α-D-glucan α-maltohydrolase，EC 3.2.1.133]，俗称麦芽糖淀粉酶，是一类α-1，4-D-葡萄糖苷键的内切淀粉酶，产物为α-麦芽糖。麦芽糖淀粉酶性质非常独特，不同于典型的淀粉酶，它不但可快速水解利用直链淀粉或环状糊精，也能少量利用支链淀粉，具有多底物特性；而且还具有转糖基作用。另外，麦芽糖淀粉酶还能水解阿卡波糖(Acarbose，一种α-淀粉酶的有效抑制剂)，但这与菌种相关。 

麦芽糖淀粉酶作为一种新型的酶制剂，主要用于淀粉及食品烘焙工业。在淀粉行业，麦芽糖淀粉酶可单独或与一种支链淀粉脱支酶一起使用以生产高麦芽糖浆。在食品行业中，由于其独特的抗老化作用，可用于延长焙烤食品的货架期。目前，随着人们对麦芽糖质量要求的进一步提高，对麦芽糖淀粉酶的研究已成为 热点。国外对麦芽糖淀粉酶进行了大量的研究，几家大型酶制剂公司如诺维信、丹尼斯克等，已有麦芽糖淀粉酶面世，但价格昂贵。国内对麦芽糖淀粉酶的研究还处于初级阶段，因此国内目前使用的麦芽糖淀粉酶基本依赖进口。而且，研制的麦芽糖淀粉酶存在最适pH偏高的明显弊端，严重影响其在淀粉工业低pH环境中的应用。酶的化学修饰可以人为的改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围，并且化学修饰具有简单经济的优点，但是在修饰过程中可能会破坏酶分子的结构，降低酶的活性。所以就非常有必要研究酶化学修饰的条件，包括化学修饰剂、反应温度和反应时间等，使酶的活性不损失或损失很少。 

发明说明 

本发明的目的是提供一种化学修饰的生麦芽糖淀粉酶以降低天然麦芽糖淀粉酶的最适pH，使麦芽糖淀粉酶可以在工业低pH的条件下应用。 

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是：根据Genebank基因登陆号(NC007333)化学全合成或以此基因设计引物，并通过聚合链式反应(PCR)进行扩增，然后克隆到质粒pet20b(+)，将质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)表达，然后用化学试剂进行修饰，并且确定反应体系中修饰剂的最佳浓度。 

具体修饰过程如下： 

将150μL生麦芽糖淀粉酶液加入到170ul的0.1M pH＝6的磷酸缓冲液中，然后加入新鲜制备的0.2M HNO₂至终浓度为10-100mM，将混合好的溶液放在37℃的恒温水浴锅中，反应30min左右。 

其中，所述生麦芽糖淀粉酶的酶液浓度最佳为0.8mg/ml～1.2mg/ml，HNO₂的最佳浓度为45mM。 

通过本方法制备的生麦芽糖淀粉酶的酶，其最适pH从7.0降至5.5，pH稳定范围更宽，最适温度和热稳定性变化不大，更适合工业应用，本发明所述的化学修饰剂价格便宜，用量少，更经济节约。 

附图说明

图1被修饰的酶与未被修饰酶的最适温度曲线。 

□：修饰酶的最适温度曲线；▲：天然酶的最适温度曲线 

图2被修饰的酶与未被修饰酶的最适pH曲线。 

□：修饰酶的最适pH曲线；▲：天然酶的最适pH曲线 

具体实施方式

实施例1修饰的生麦芽糖淀粉酶的制备 

1、生麦芽糖淀粉酶的制备 

根据Genebank基因登陆号(NC007333)化学全合成或以此基因设计引物，并通过聚合链式反应(PCR)进行扩增，然后克隆到质粒pet20b(+)，质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑选验证后进行发酵培养。培养基各组分和培养条件如下(g/L)：甘油5，蛋白胨12，酵母膏24，磷酸氢二钾·3H₂O 16.43，磷酸二氢钾2.31，终浓度100μg/mL的氨苄青霉素。在25℃恒温培养4h后加入终浓度为0.5mmol的IPTG诱导，再恒温培养60h，对发酵液进行离心，然后将上清液进行硫酸铵沉淀、离子交换柱纯化生麦芽糖淀粉酶，最后得到0.8mg/ml～1.2mg/ml的生麦芽糖淀粉酶液。 

2：化学修饰剂亚硝酸(HNO₂)溶液的制备。 

具体过程和步骤如下：称取27.6g NaNO₂，溶于少量的水中，最后用容量瓶定容至1L，即可得到0.4M NaNO₂溶液；用量筒量取36mL浓盐酸，溶于少量的水中，最后用容量瓶定容至1L，即可的到0.4M HCl溶液；将NaNO₂溶液和HCl溶液在有盖子的棕色玻璃容器中等体积混合，用振荡器或搅拌器使之混合均匀，反应后生成浓度为0.2M HNO₂溶液。将反应后生成的0.2M HNO₂溶液放在4℃冰箱中，待用。 

3：生麦芽糖淀粉酶的化学修饰。 

在通风厨中进行化学修饰，将150μL生麦芽糖淀粉酶液加入到170μL的0.1M pH＝6的磷酸缓冲液中，然后加入HNO₂溶液， 使溶液中的HNO₂浓度最终为45mM，将混合好的溶液放在37℃的恒温水浴锅中，反应30min左右。 

4：测定酶的活性。 

测定酶活前，应该绘制葡萄糖-吸光光度值的标准曲线，葡萄糖的标准液的浓度是1mg/mL。 

具体操作如下：取9支大试管，每支均加入450μL 0.1M磷酸缓冲液，然后分别按下表顺序加入各种试剂： 

将上述各管溶液混匀后，分光光度计测OD540nm用空白管溶液调零点，记录光密度值。以葡萄糖浓度为纵坐标，光密度值为横坐标绘制标准曲线。 

酶的活性的测定采用3.5-二硝基水杨酸比色定糖法，具体原理是通过分光光度计检测酶水解淀粉产生的还原糖与DNS(3，5一二硝基水杨酸)溶液显色程度的深浅。具体方法如下：取1mL 1％(w/v)可溶性淀粉溶液，往里加900μL 0.1M磷酸缓冲液，加入100μL的酶液；而空白对照管中加入100μL失活的酶液，60℃反应10min，加入1.5mL DNS溶液以终止酶反应，然后沸水浴5min，置冰上冷却后，加入去离子水10.5mL混匀，用分光光度计测OD540nm值，由于分光光度计的有效测量值的范围是0.2至0.8测得的值应该也在这个范围。测定酶活前，应该绘制葡萄糖-吸光光度值的标准曲线，葡萄糖的标准液的浓度是1mg/ml。酶活单位(u)的定义是每毫升酶液与淀粉反应每分钟产生1μM的还原糖(本实验中用葡萄糖做标准)的量。测定淀粉酶活力的计算公式如下： 

酶活力活力单位(u/mL)＝葡萄糖*1000/(180*10*0.1) 

其中，180-葡萄糖的相对分子质量；10-反应时间；0.1-酶液体积 

5：修饰酶的酶学性质研究 

A.最适温度的测定：测定范围从35℃到80℃，按照步骤4所述方法，分别测定不同温度下的酶活。将酶活最高的作为100％，然后计算其它温度下的相对酶活，结果如图1。 

B.最适pH的测定：测定范围从pH3到pH 12，按照步骤4所述方法，分别测定不同pH条件下的酶活，将酶活最高的作为100％，然后计算其它pH下的相对酶活，结果如图2。 

实施例2修饰的生麦芽糖淀粉酶的制备 

除化学修饰步骤中HNO₂的用量不一样外，其HNO₂用量为终浓度为10mM，其它均同实施例1。修饰后的酶，其酶学性质同图1图2所示。 

实施例3修饰的生麦芽糖淀粉酶的制备 

除化学修饰步骤中HNO₂的用量不一样外，其HNO₂用量为终浓度为100mM，其它均同实施例1。修饰后的酶，其酶学性质同图1图2所示。 

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。