脂肪和肥胖相关基因作为辐射生物剂量计的应用

摘要

本发明属于辐射生物剂量计领域，具体涉及脂肪和肥胖相关基因作为辐射生物标记物的新用途。首先以脂肪和肥胖相关基因作为辐射生物剂量计检测离体细胞所受的辐射量：(1)获得该离体细胞的接受的辐照剂量和脂肪和肥胖相关基因的表达水平的关系的标准曲线；(2)收集接受了待测剂量的辐射照射的离体细胞，测定其中的脂肪和肥胖相关基因的表达水平，根据步骤(1)获得的标准曲线计算得到该离体细胞所受的辐射剂量。因此，在人员或动物受到辐射之后，可通过其离体细胞进行FTO基因表达情况的检测，可以判断机体是否受到照射、估算受照剂量的大小和放射损伤的程度；然后选择针对性的、最优化的治疗方案。

说明书

技术领域

本发明属于辐射生物剂量计领域，具体涉及脂肪和肥胖相关基因(FTO基 因，Fat mass and obesity associated gene)作为预测放射性损伤程度和估算受照 剂量的生物标记物的新用途。

背景技术

因电离辐射或各种放射性同位素引起的组织急性和慢性损伤，称为放射性 损伤，放射性损伤的病因通常包括异常照射、医疗照射和核武器爆炸照射等。 随着核技术的发展，人们在工农业、医学和科学研究领域中广泛地利用X射线， 射线和放射性同位素，如果使用不当或者不注意保护，就会对人体造成损伤， 甚至造成死亡，因此，辐射防护显得尤为重要。在辐射防护工作中，如何及时 准确地估算受照者的吸收剂量是至关重要的，常用的剂量估算方法包括物理测 量和生物剂量计等。人们通常将用来估算受照剂量的生物学体系称为生物剂量 计，该体系在适当的剂量范围内，应具备良好的线性剂量-效应关系，离体和整 体照射的剂量-效应曲线之间在统计学意义上无显著差异。目前常用的生物剂量 计有早熟凝聚染色体片段分析、微核分析、稳定染色体畸变分析、体细胞基因 位点突变分析等。但这些技术相对复杂，需要良好的专业知识和训练后才能够 顺利开展，因此寻找检测方法简单、分析快速、特异性高的生物剂量计一直是 放射生物学和辐射防护学领域的研究热点。

英国牛津大学发布的新闻公报指出，该校研究人员找到了FTO基因会导致 肥胖的有力证据，称FTO基因过度活跃会造成饮食过量，从而导致肥胖。相关 成果发表在最近一期《自然遗传学》杂志上。

FTO基因也称肥胖基因，是一种与肥胖相关的等位基因。早在2007年，一 个包括牛津大学科学家在内的国际研究小组通过大型全基因组研究发现，FTO 基因变异与肥胖有关。携带两个FTO基因变异副本的人，其平均体重比拥有正 常副本的人重3公斤。而在欧洲血统白人中，大约有16％的人携带两个FTO基 因变异副本。

此次牛津大学和英国医学理事会的合作研究中，研究人员希望能确定是否 就是FTO基因本身活动的差异导致了肥胖。在实验中，研究人员培育出具有多 余FTO基因副本的小鼠，他们发现，这些小鼠虽然也很健康，但与其它正常小 鼠相比，它们的食欲更强，更易饮食过量，体型也更肥硕。那些有两个FTO基 因副本的雌性小鼠，即使食谱与其它正常雌性小鼠相同，其在20周后的体重也 比后者重22％；但对于雄性小鼠而言，这种体重差异则大约在10％左右。

该项研究的领导者、牛津大学的弗朗西斯·阿什克劳夫特教授表示，该实验 表明，FTO基因是与肥胖相关的重要基因，正是FTO基因过度活跃，才会造成 小鼠饮食过度，从而导致体重大幅增加。

研究论文作者之一、牛津大学的克里斯·丘奇则称，这是研究人员第一次找 到令人信服的证据证明FTO基因能够导致肥胖。而下一步，他们要致力于研究 相关机制，一旦了解了FTO基因导致肥胖的机制，就可以开发出有效的肥胖治 疗药物。相信这种能够抑制基因活动的药物将具有很好的应用前景。

但是目前未见任何关于FTO基因作为辐射生物剂量计方面的应用的报道。

发明内容

本发明的发明目的是提供脂肪和肥胖相关基因(FTO基因，Fat mass and  obesity associated gene)的新用途，即脂肪和肥胖相关基因作为辐射生物剂量计 的应用。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：脂肪和肥胖相关基因(FTO 基因，Fat mass and obesity associated gene)的新用途，即脂肪和肥胖相关基因 作为辐射生物剂量计的应用。

以FTO基因作为辐射生物剂量计可以检测离体细胞所受的辐射量，因此， 本发明同时要求保护一种以FTO基因作为辐射生物剂量计检测离体细胞所受的 辐射量的方法，具体包括以下步骤：

(1)按照常规方法培养离体细胞，将离体细胞置于已知辐射强度的环境中接 受辐照，然后在两个以上时间点采集辐射照射后的离体细胞，测定其中的FTO 基因的表达水平，获得该离体细胞的接受的辐照剂量和FTO基因的表达水平的 关系的标准曲线；

(2)收集接受了待测剂量的辐射照射的离体细胞，测定其中的FTO基因的 表达水平，根据步骤(1)获得的标准曲线计算得到该离体细胞所受的辐射剂量。

上述技术方案中，所述离体细胞为：人肺腺癌细胞A549、人肺腺癌细胞 NCI-H406、人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人乳腺癌细胞MCF-7、人外周抗凝全 血细胞、人宫颈癌细胞HeLa、人前列腺癌细胞LNcap、人卵巢癌细胞SK-OV-3 等等。

上述技术方案中，测定FTO基因的表达水平的方法为RT-PCR法或 Western-blot法。

上述技术方案中，所述RT-PCR法包括以下步骤：

(1)提取待测细胞的总RNA，合成cDNA；

(2)RT-PCR反应：以合成的cDNA为模板，使用FTO引物扩增相应基因； 其中FTO的引物为：SEQ ID No.1上游5′-CTG TGA CGA TGT GGA CAA TGA T-3′，SEQ ID No.2下游5′-ACC TCT GAG TTC TGA AAC GAT G-3′。

上述技术方案中，所述PCR反应总体系为：每251反应体系中包括GoTaq Green Master Mix反应缓冲液12.5μl，cDNA模板0.5μl，正向、反向引物均为 0.5μl(10μM)，剩余体积以ddH₂O补足；所述PCR反应条件为：94℃预变性5 分钟；94℃变性50秒，50℃退火40秒，72℃延伸45秒，共30个循环，最后 于72℃延伸8分钟结束反应。

上述技术方案中，所述Western-blot法包括以下步骤：

(1)收集待测细胞并离心，弃上清，加入裂解液，置于冰上；然后离心取上 清液，并采用分光光度计检测样品蛋白含量；

(2)加入蛋白上样缓冲液恒温混匀，蛋白电泳后转至醋酸纤维膜上，采用封 闭液封闭醋酸纤维膜，然后洗涤，并分别加入一抗β-actin、FTO，经封闭液处 理的醋酸纤维膜室温抚育；

(3)T-BST缓冲液洗膜，加入二抗抚育；T-BST缓冲液洗膜，最后加发光剂， 显影、定影，胶片洗涤和干燥后，扫描分析。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.本发明首次发现离体细胞受到辐射后，其中的FTO基因的表达水平与受 到的辐射剂量成正比，存在一定的剂量-效应关系，且可以通过RT-PCR或 westernblot法检测；因此，可以通过检测待测离体细胞中的FTO基因的表达水 平来判断受照射剂量的大小。

2.在放射工作从业者、接收放射治疗的病人或其他可能受到放射损伤的人 员或动物受到辐射之后，例如在放射性事故发生后，可通过对血液或其它离体 细胞进行FTO基因表达情况的检测，可以判断机体是否受到照射、估算受照剂 量的大小和放射损伤的程度；然后选择针对性的、最优化的治疗方案。

附图说明

图1为实施例中不同剂量X射线照射后FTO基因的mRNA变化情况；

图2为实施例中γ-射线(6Gy)照射后不同细胞株中FTO蛋白表达的变化情况。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：

1.1材料：用于实验的人A549、NCI-H406、MDA-MB-231、MCF-7细胞均 购于美国细胞收藏中心(ATCC)，并由本实验室保存和培养；D-MEM培养基干粉， 小牛血清，胰酶粉末购自Gibco公司；标准蛋白质分子量、SDS-PAGE上样缓冲 液、RIPA蛋白裂解液、TAE电泳缓冲液、10×转膜液、30％Acry-Bis、Tris-Hcl、 过硫酸铵(AP)、SDS、四甲基乙二胺(TEMED)、碘化丙啶(PI)购自江苏碧云天生 物技术研究所；二甲基亚砜(DMSO)、琼脂糖和Tween-20来自上海高科技生物 工程有限公司；FTO抗体购买自Novus Biologicals公司(美国)，RNase A和10 μg/mL proteinase K购自美国Sigma Aldrich公司。

1.2细胞培养：A549细胞培养于含10％小牛血清，谷氨酸胺及100万U/L 青霉素和链霉素的D-MEM培养基。细胞置于5％CO₂，37℃培养箱内培养，每 2-3天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.3采用不同剂量X线照射A549细胞后，采用RT-PCR法检测其中FTO基 因的mRNA表达水平：A549细胞接受不同剂量X线照射24h后，用Trizol试 剂收集细胞，提取总RNA，经逆转录后进行PCR。

结果如图1所示，随着照射剂量的增加，FTO的mRNA表达水平逐渐增加， 且FTO的变化存在着剂量依赖性，采用直线回归模型拟合后关系为 y＝2.5x-1.9667，R²＝0.9872(y：FTO的mRNA表达相对含量、x：照射剂量，p＜0.05)。

所述照射条件为：辐射照射在室温下进行，高能6MV德国西门子PRIMUS 医用电子直线加速器X射线照射，机头转180°后从培养皿下方照射，剂量率 200cGy/min，固定源皮距100cm，照射野为10cm×10cm。

所述RT-PCR的方法具体如下：

1)提取总RNA：采用1ml Trizol试剂裂解待测细胞。加入200μl氯仿， 剧烈振摇15秒后室温静置15分钟。离心收集上清，加入500μl异丙醇并混匀， 室温静置10分钟后离心获取RNA沉淀。以70％乙醇洗涤2次，真空干燥RNA 沉淀，最后溶于20μl DEPC H₂O。紫外分光光度计测定OD₂₆₀值并计算RNA浓 度。

2)合成cDNA：进行cDNA合成的反应条件为：总RNA 5μg、oligo dT引 物1μl、逆转录酶1μl、dNTP混合物2μl，RNaseA抑制剂1μl，总反应体系为 20μl，剩余体积由无RNA酶的ddH₂O补足；上述混合物于37℃反应60分钟， 然后以70℃作用10分钟结束反应，置于冰上待用。

3)RT-PCR反应：以合成的cDNA为模板，使用FTO引物和作为阳性对照 的GAPDH引物扩增相应基因。其中FTO的引物为：SEQ ID No.1上游5′-CTG TGA CGA TGT GGA CAA TGA T-3′，SEQ ID No.2下游5′-ACC TCT GAG TTC TGA AAC GAT G-3′，共460bp。GAPDH的引物为：SEQ ID No.3上游引物5′-CAA CTA CAT GGT CTA CAT GTT CC-3′，SEQ ID No.4下游引物为5′-CAA CCT GGT CCT CAG TGT AG-3′，共724bp。PCR反应总体系为：25μl反应体系中，GoTaq Green Master Mix反应缓冲液12.5μl，cDNA模板0.5μl，正向、反向引物均为 0.5μl(10μM)，剩余体积以ddH₂O补足。

4)PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；94℃变性50秒，50℃退火40秒， 72℃延伸45秒，共30个循环，最后于72℃延伸8分钟结束反应。将扩增产物 进行1％琼脂糖凝胶电泳，经0.5μg/ml溴乙锭染色后在凝胶成像分析仪上进行 观察。

1.4采用γ-射线照射各细胞株后，检测其中FTO蛋白表达水平：取对指数 生长的MCF-7、MDA-MB-231、A549、NCI-H409细胞，给予6Gy剂量的-射 线照射24h后，收集细胞并制备细胞蛋白样品，应用Western blot检测照射后 FTO蛋白的变化情况。结果如图2所示，从图中可发现，四种细胞株照射后FTO 的表达均显著增多，这些实验研究说明无论在mRNA还是在蛋白水平，照射后 FTO的表达确实会随着照射剂量的增加，而发生变化。

所述Western-blot法具体包括以下步骤：收集细胞并转至于1.5ml的 Eppendorf管中离心(2500转/分)5分钟，弃上清，并加入100μl IP裂解液，置于 冰上2小时。4℃离心5分钟(2,500转/分钟)，转移上清液至新的Eppendorf管， 并采用分光光度计检测样品蛋白含量。加入蛋白上样缓冲液(5×)混匀，置于恒温 混匀器上，100℃5分钟，蛋白电泳后转至醋酸纤维膜上。膜采用封闭液(5％ 脱脂奶粉，1×T-BST缓冲液)封闭1h。洗涤，并分别加入一抗β-actin(1∶2000 稀释)、FTO(1∶1000稀释)，经封闭液处理的醋酸纤维膜室温抚育1小时。T-BST 缓冲液洗膜3次，分别加入对应二抗Mouse(1∶1000稀释)、Rabbit(1∶1000稀释) 抚育1小时。T-BST缓冲液洗膜3次，最后加ECL发光剂，显影、定影，胶片 洗涤和干燥后，扫描分析。

本实施例得到统计学处理：所有实验均重复3次，取平均值，结果用表示。灰度值采用Bandscan 5.0计算，每个条带重复3次。所有数据分析采用 SAS 8.0统计软件，两组均数比较应用t检验，多组均数比较应用方差分析，p ＜0.05认为差异有统计学意义，相关分析采用直线回归模型计算。

核苷酸和/或氨基酸序列表

 

<110> 苏州大学

<120> 脂肪和肥胖相关基因作为辐射生物剂量计的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

 

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

 

<400> 1

ctgtgacgat gtggacaatg at                                                 22

 

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

 

<400> 2

acctctgagt tctgaaacga tg                                                 22

 

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

 

<400> 3

caactacatg gtctacatgt tcc                                                23

 

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

 

<400> 4

caacctggtc ctcagtgtag                                                    20