一种具有原油降解功能的菌及适用于低温和盐碱地区的原油污染土壤的生物修复剂

摘要

一种具有原油降解功能的菌及适用于低温和盐碱地区的原油污染土壤的生物修复剂。属于微生物领域。它解决了目前尚未有适用于低温和盐碱地区的原油污染土壤修复的修复剂的问题。本发明的溶血不动杆菌SJHX-2保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.5458。生物修复剂由细菌培养液和营养液组成，细菌培养液为溶血不动杆菌SJHX-2接种到LB液体培养基中培养的培养液；营养液为含有无机盐的水溶液。本发明的生物修复剂处理原油污染土壤在2年内可将土壤的含油量降至0.3%以下，修复后土壤种植萝卜白菜西瓜长势良好。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，具体涉及一种溶血不动杆菌及一种土壤修复剂。 

背景技术

在油田生产中，钻井采油、井场作业、油气集输等过程都会产生地面溢油或落地原油。这些原油会在自身重力、表面张力及毛细现象的作用下侵蚀土层，进而改变土壤正常的理化性质，影响被污染区域的生态平衡。目前，我国每年产生落地原油约70万吨，单井落地原油污染面积平均可达0.5~2.1m²，经回收处理后仍有7万吨进入土壤。在北方产油地区，被原油污染土壤的面积正在逐年扩大。原油渗入土壤后产生的危害主要表现在以下几个方面：（1）土壤颗粒胶结成团，影响土壤的通透性，降低土壤质量，阻碍植物根系的呼吸与吸收，影响植物的根系生长；（2）使土壤氮、磷的含量相对减少，养分失衡，影响作物的营养吸收；（3）原油中的多环芳烃类（PAHs）有致畸、致癌和致基因突变的“三致”作用；（4）原油中不易被土壤吸附的组分会污染地下水；（5）原油中还可能含有少量重金属元素，也会对植物和微生物的生长造成一定程度的影响。因此，为了保护油田周边环境需要对原油污染土壤进行修复。 

我国松嫩平原的中北部和黄河三角洲地区油气资源丰富，但是油区土地盐碱化严重，且冬季气温很低，原油污染土壤的修复难度大。现有的对原油污染土壤的处理方法主要有两种，一是集中堆放自然降解，二是运至污油回收站、污泥处理站进行热沉降、调质离心等理化处理，处理后残渣的含油量在2%左右。原油污染土壤自然降解到可利用状态的时间长达5~10年，易污染地下水；而以回收原油为主的理化处理的设备投资和运行成本高。目前，尚未有适用于低温和盐碱地区的原油污染土壤修复的修复剂。 

发明内容

本发明的目的是为了解决目前尚未有适用于低温和盐碱地区的原油污染土壤修复的修复剂的问题，而提供一种具有原油降解功能的菌及适用于低温和盐碱地区的原油污染土壤的生物修复剂。 

本发明的具有原油降解功能的菌为溶血不动杆菌SJHX-2（Acinetobacter haemolyticus SJHX-2），该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5458。 

该溶血不动杆菌SJHX-2（Acinetobacter haemolyticus SJHX-2）属于莫拉氏菌科（Moraxellaceae）不动杆菌属（Acinetobacter）。 

该溶血不动杆菌SJHX-2是从被原油污染的普通土壤及盐碱土中分离、纯化、筛选得到，其在LB平板培养基上30~37℃培养18~24h即形成白色不透明圆形菌落，直径2~4mm，为革兰氏阴性菌，菌体形态为较粗的短杆或球状，直径约1.2μm；氧化酶阴性，触酶、明胶水解、溶血性皆为阳性；葡萄糖产酸微弱；可利用中长链烃、乙醇、苹果酸等，不利用甲酸盐、乳酸盐和丙酸盐等。经检测，本发明的溶血不动杆菌SJHX-2的原油降解率可达9.39%，可耐受的温度范围为-30~60℃；该菌种在37℃时最佳培养时间为9~10h，LB培养液的OD₆₀₀=1.5~1.6。 

本发明的溶血不动杆菌SJHX-2保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中科院微生物研究所，保藏日期为2011年11月14日，保藏号为CGMCC No.5458。 

本发明的适用于低温和盐碱地区的原油污染土壤的生物修复剂由细菌培养液和营养液组成，所述的细菌培养液为溶血不动杆菌SJHX-2接种到LB液体培养基中培养的培养液；所述的营养液为含有无机盐的水溶液，该营养液按摩尔百分比含有N40~45%、P20~24%、K23~30%、Na6~10%的、Mg0.03~0.07%、Ca0.01~0.03%，营养液pH值为6.6±0.3。该营养液是针对低温气候条件及盐碱地区的土质配制而成的，能够调节土壤的pH值和碳氮磷比例、促进菌株生长代谢的作用。溶血不动杆菌SJHX-2能够在添加有2g/l葡萄糖的该营养液中正常生长。细菌培养液和营养液联合使用，细菌培养液的添加量为每次每千克土10~20ml， 营养液的添加量为每次每千克土35~45ml。北方产油区自然环境的温度范围在-25~35℃之间，盐碱土pH值一般不高于9。实验表明，利用本发明的生物修复剂处理原油污染土壤在2年内可将土壤的含油量降至0.3%以下，修复后土壤种植萝卜白菜西瓜长势良好。 

附图说明

 图1为本发明溶血不动杆菌SJHX-2（Acinetobacter haemolyticus SJHX-2）的形态图； 

图2为具体实施方式三的原油污染土壤含油量变化图。

具体实施方式

 具体实施方式一：本实施方式的具有原油降解功能的菌为溶血不动杆菌SJHX-2（Acinetobacter haemolyticus SJHX-2），该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5458。 

该溶血不动杆菌SJHX-2是从被原油污染的普通土壤及盐碱土中分离、纯化、筛选得到的。具体步骤如下：（一）菌种的分离纯化：在秋季室外温度5℃左右时取自大庆油田井场或污油回收站附近被落地污油和溢油所污染的浅层土壤，将菌源土壤混合、粉碎后在室温下用喷壶补充蒸馏水进行3~4天的活化；取2~3g土壤添加到装有15ml LB培养基的100ml三角瓶中，在37℃、200rpm的条件下，摇床震荡过夜培养。取初级培养液，用移液器以1%~2%的接种量接种至装有100ml LB培养基的摇瓶中传代培养，培养至指数生长末期的培养液作为接种体，以1%~2%的接种量进行转接培养；按上述方法连续富集培养5代，取最后一次培养液100μl涂布到固体LB平板培养基上，连续涂布5~6块平板；将平板置于培养箱中，在37℃下培养，待平板上形成高度分散的单菌落，根据菌落外观形态挑取单菌落至LB斜面培养基上，将斜面置于培养箱内在37℃下培养至形成菌苔；将斜面置于4℃冰箱中保藏；所得到的斜面菌种经染色镜检为纯菌后进行筛选； 

（二）菌种的初筛：从斜面上挑取菌接种到LB液体培养基中培养1代，将培养液划线涂布于选择性平板培养基上，30~33℃培养2~3d，观察平板培养基上是否出现明显的、生长良好的菌落；另从斜面中挑取菌接种到LB液体培养基中培养1代，培养液接入稀释四倍的LB液体培养基中培养，将2代培养液（OD₆₀₀=1.1~1.2）接入选择性液体培养基中在35~37.5℃、180~200r/min的条件下培养144h，将选择性液体培养基用溶剂汽油萃取，用分光光度计检测含油量，计算原油降解率，原油降解率（%）=（起始油量－加菌处理后油含量）/起始油量×100%；所述的选择性液体培养基为向无菌蒸馏水中加入MgSO_4。7H₂O 0.2%，KH₂PO₄ 0.07~0.12%，K₂HPO₄ 0~0.05%，NH₄NO₃ 0.25%，外输油0.3~1%；选择性平板培养基为向选择性液体培养基中添加琼脂1.8%，煮沸灭菌后倒入无菌培养皿室温冷却；

（三）菌种的复筛：经初筛后得到4支降解原油能力强的菌株，经镜检染色确认是纯菌后，进行菌种适应性评价：最佳培养温度测试：将菌种分别接种到LB培养基中培养9h，测量在10~50℃范围内的不同培养温度下菌种的OD₆₀₀值，测定菌种最佳培养温度为35~40℃；菌种生长曲线测试：将菌种分别接种到LB培养基中，分别测定第三代单菌培养液的生长曲线，测试温度分别为33℃、35℃、37℃，摇床转速180r/min；耐温性能测试：将菌种分别置于-40~60℃的环境中7d，然后接种至LB液体培养基中测试不同培养时间的OD₆₀₀值。对上述测试结果进行综合评价后，从4支菌株中挑选出一支粗杆菌制备细菌培养液，经测定，该菌株的原油降解率为9.39%，高于其他三支菌株；该菌株的最佳培养温度为37~40℃；该菌种可耐受的温度范围为-30~60℃；该菌株在37℃时最佳培养时间为9~10h，LB培养液的OD₆₀₀=1.5~1.6。

将上述优选出的菌株送交天津科技大学生物工程学院进行菌种鉴定及DNA测序。经鉴定，该菌株在LB平板培养基上30~37℃培养18~24h即形成白色不透明圆形菌落，直径2~4mm，为革兰氏阴性菌，菌体形态为较粗的短杆或球状，直径约1.2μm；氧化酶阴性，触酶、明胶水解、溶血性皆为阳性；葡萄糖产酸微弱；可利用中长链烃、乙醇、苹果酸等，不利用甲酸盐、乳酸盐和丙酸盐等。菌株的的形态图如图1所示。鉴定结果为，该菌株为溶血不动杆菌（Acinetobacter haemolyticus），本发明将该溶血不动杆菌（Acinetobacter haemolyticus）命名为溶血不动杆菌SJHX-2（Acinetobacter haemolyticus SJHX-2）。溶血不动杆菌SJHX-2 16S rDNA如SEQ ID NO：1所示。对溶血不动杆菌SJHX-2同源进行比对，此序列经GenBank中的BLAST比对为Acinetobacter haemolyticus（溶血不动杆菌），相近菌种有Accession No：NR_026207.1，同源度：99%。读取Biolog微生物分析系统检测结果数据，结果显示溶血不动杆菌SJHX-2与Acinetobacter haemolyticus（溶血不动杆菌）的可能性为100%，相似性为0.837（在该鉴定系统中，相似率若大于0.5，结果较为可信）。 

经测试，本实施方式溶血不动杆菌SJHX-2的原油降解率可达9.39%，具有良好的原油降解能力；其可耐受的温度范围为-30~60℃，能够适应北方寒冷气候，适合用于寒冷地区油田被原油污染土壤的修复。 

具体实施方式二：本实施方式的适用于低温和盐碱地区的原油污染土壤的生物修复剂由细菌培养液和营养液组成，所述的细菌培养液为溶血不动杆菌SJHX-2（Acinetobacter haemolyticus SJHX-2）接种到LB液体培养基中培养的培养液，培养方式为1、2代各菌株单独培养，第3代接入同一批摇瓶或发酵罐中大规模培养。最佳培养温度为35~37℃，最佳培养时间为10h。 

所述的营养液为含有无机盐的水溶液，该营养液按摩尔百分比含有N40~45%、P20~24%、K23~30%、Na6~10%的、Mg0.03~0.07%、Ca0.01~0.03%，营养液pH值为6.6±0.3。该营养液是针对低温气候条件及盐碱地区的土质配制而成的，能够调节土壤的pH值和碳氮磷比例、促进菌株生长代谢的作用。溶血不动杆菌能够在添加有2g/l葡萄糖的该营养液中正常生长。细菌培养液和营养液联合使用，细菌培养液的添加量为每次每千克土10~20ml， 营养液的添加量为每次每千克土35~45ml。北方产油区自然环境的温度范围在-25~35℃之间，盐碱土pH值一般不高于9。具体使用方法如下： 

（1） 室外日最低气温介于0~5℃时：按10~15ml/kg开始投加的细菌培养液，少量补水，翻土；3~4d后，按40ml/kg投加营养液，翻土，补水至土壤湿度约为50%；细菌培养液每30d投加一次，营养液每30d投加一次；

（2） 室外日最低气温介于5~15℃时：细菌培养液每30d投加一次，营养液每20~25d投加一次；

（3） 室外日最低气温大于15℃时：细菌培养液每30d投加一次，营养液每15~20d投加一次；

（4） 室外日最高气温低于0℃时：停止投加生物修复剂，次年春季恢复投加；

（5）日常需要翻土浇水维护，以保持土壤湿度在40~60%左右及足够的透气性。

实验表明，利用本发明的生物修复剂处理原油污染土壤在2年内可将土壤的含油量降至0.3%以下，修复后土壤种植萝卜白菜西瓜长势良好。 

具体实施方式三：本实施方式的的适用于低温和盐碱地区的原油污染土壤的生物修复剂与具体实施方式二的生物修复剂相同。将该生物修复剂应用于大庆油田采油九厂某井口附近的被原油污染的盐碱土壤，土壤面积为2×2m，土壤厚度0.25m，含油量9.81%，pH8.4。修复从2009年9月开始，修复期间共投加营养液14次共1480 L，投加细菌培养液次共517L，到2011年6月该地块土壤含油量为0.29%，土壤中含油量变化如图2所示。由上述实验数据可以看出，本实施方式的生物修复剂能够有效分解土壤中的原油，降低土壤中原油含量，从而修复被原油污染的土壤。