用于检测小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的引物、探针及其方法

摘要

本发明公开了一种用于检测小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的引物、探针及其方法，所述引物是由具有序列表中的SEQ ID NO：1的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO：2的下游引物组成的一对寡核苷酸，与所述引物配合使用的探针具有序列表中的SEQ ID NO：3的核苷酸序列。用本发明的方法及试剂盒检测小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒具有快速简单、灵敏度高、特异性强且回收率高的优点，解决了现有检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求的不足，具有很好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种用于检测小鼠淋巴细胞 性脉络丛脑膜炎病毒的引物、探针及其方法。

背景技术

自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为 三类；一类为人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物；二类目前尚 无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制， 对人类有潜在危险性；三类病毒在自然条件下仅感染动物本身，目前尚无 迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。

现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来 源，具有潜在的病毒污染。在《中华人民共和国药典(2010年版)》三部 中，规定了鼠源性生物制品需质检的8种鼠源病毒，其中小鼠淋巴细胞 性脉络丛脑膜炎病毒属于一类，人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类 动物，对人体来说有很大的危险性。

淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic Choriomeningitis  Virus，LCMV)属于嵌沙洋病毒科(Arenavirus)，为双义单链RNA病 毒。有囊膜，病毒粒子近圆形，直径80～300nm之间，病毒粒子内部含有 数量不等，大小在20～25nm的致密颗粒，形似嵌入沙粒。

淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒可引起的人和许多种动物的人畜共患 病——淋巴细胞性脉络丛脑膜炎。小鼠LCMV感染后的临床症状可表现 为三种类型：内脏型、大脑型和迟发型。内脏型LCM小鼠表现被毛粗 乱、结膜炎，有时出现腹水。大脑型LCM由脑内及神经途径感染而产生， 病鼠表现为脑内接种后5～6天，有的小鼠突然死亡，其它小鼠表现被毛 粗乱、懒动、嗜睡、消瘦，常见结膜炎和面部水肿。倒提时小鼠头部震 颤，肢体痉挛，后肢强直性伸展。小鼠于出现上述症状后1～3天死亡。迟 发型LCM常发生于子宫内感染和出生后1～2天感染的小鼠，病毒在体内 增殖，但无症状，直到九个月后，可见病鼠体重减轻、被毛粗乱、蛋白尿、 腹水、弓背等症状。

人类感染LCMV后，表现为流感样疾病，患者感染后1～2周，出现 恶心、厌食、发烧等症状，在恢复期10％患者可出现腮腺炎和睾丸炎。 还可引起无菌性脑膜炎、脑膜脑脊髓炎，表现为双侧乳头水肿、精神错 乱、四肢麻痹、颈部强直、厌食、头痛等症状。

为了客观评价小鼠生物制品的质量，确保人民健康必将起到积极的 作用，药典制定了鼠源病毒检测的标准。其中规定的鼠源病毒检测方法 有：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。这些方法从生物效 应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对 操作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。

而目前发展十分成熟的实时荧光定量PCR技术(Real-time Fluorence  Quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)检测灵敏度 高，简单方便，且对实验室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美 国Applied biosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”， 最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定 量分析的方法。该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着Taqman 荧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman荧光探 针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同时 还加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一 个报告荧光基因和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基因所发射 的荧光信号被淬灭基因吸收，扩增时随着Taq酶在链延伸过程中遇到与 模板结合的探针，其5’-3’外切核酸酶活性将探针酶切降解，报告荧光 基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以监测到荧光信号，模 板每复制一次，就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释放。由于被 释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一关系，所以信号累积与 PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知 浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及 样品中的扩增曲线可对样品进行定量分析。

实时荧光定量PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定量，而且 具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实 时和准确等特点，该已被广泛用于免疫分析、细菌、病毒检测等多个领 域。迄今为止，实时荧光定量PCR技术检测小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜 炎病毒方面还未见有报道，无疑有着很广阔的发展空间。

发明内容

为了解决现有小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒检测方法的不足， 本发明提供了一种实时荧光定量PCR检测小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎 病毒的引物、探针及其方法，该方法简单方便、灵敏度高且检测时间短。

本发明的一个目的是提供一对用于检测小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜 炎病毒的引物。

本发明提供的引物，是由具有序列表中的SEQ ID NO：1的上游引物 与具有序列表中的SEQ ID NO：2的下游引物组成的一对寡核苷酸。

序列表中的SEQ ID NO：1由23个碱基组成；序列表中的SEQ ID  NO：2由19个碱基组成。

本发明人设计了多对PCR引物，经过长期大量的实验从众多引物对 中筛选出了由上述上游引物和下游引物组成的引物对。其扩增片断大小 为154bp。该引物对小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒具有高度的保守 性，且与小鼠基因组不具有显著的同源性，使用该引物进行PCR扩增， 可实现准确定性、定量检测。

本发明的另一个目的是提供一种用于检测小鼠淋巴细胞性脉络丛脑 膜炎病毒的探针，所述探针具有序列表中的SEQ ID NO：3的核苷酸序列， 所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

所述探针中荧光报告基团可选自包括但不限于FAM、VIC、JOE、 HEX中的任意一种，优选为FAM；所述荧光淬灭基团选自TAMRA或 Eclipse，优选为TAMRA。

所述序列表中的SEQ ID NO：3由20个碱基组成。

本发明的再一个目的是提供一种用于检测小鼠淋巴细胞性脉络丛脑 膜炎病毒的方法，所述方法使用上述提及引物及探针进行实时荧光定量 PCR检测。

优选地，所述实时荧光定量PCR的反应体系还包括RT-PCR扩增试 剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。

优选地，所述实时荧光定量PCR的退火温度为60℃。

优选地，所述实时荧光定量PCR的反应条件为：48℃，15min；95 ℃，10min；95℃，15sec，60℃，40sec，共40个循环。

优选地，所述方法还包括标准曲线的建立，方法为：扩增含序列表 中SEQ ID NO：4所示的碱基同源序列的pMD18-T载体，得到560bp的 DNA片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得的RNA作为阳性RNA 标准品，将其十倍稀释成不同浓度的阳性定量标准品，以所述阳性定量 标准品作为模板进行实时荧光定量PCR检测，得到用于检测小鼠淋巴细 胞性脉络丛脑膜炎病毒的标准曲线。

本发明的又一个目的是提供一种用于检测小鼠淋巴细胞性脉络丛脑 膜炎病毒的试剂盒，所述试剂盒含上述提及的引物探针。

优选地，所述试剂盒的反应体系还包括RT-PCR扩增试剂、阳性RNA 标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。

优选地，所述RT-PCR扩增试剂为2×Taqman PCR Mix、40×Taqman RT-Enzyme MIX，也可直接使用Taqman RNA-Ct 1-Step kit。

优选地，所述阳性RNA标准品通过下述方法获得：扩增含序列表中 SEQ ID NO：4所示的碱基同源序列的pMD18-T载体，得到560bp的DNA 片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得RNA即标准品。

本发明的还一个目的是提供上述提及的引物或探针在检测鼠源生物 制品中淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒残留时的应用。

与现有检测方法相比，本发明提供的荧光定量PCR方法检测小鼠淋 巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒具有以下优点：

1、简单快速：现有的药典小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒检测方 法为：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验，从生物学效应角 度检测生物制品中小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的潜在感染，需时 长(1～4周时间)，而本发明从核酸角度对淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒 进行检测，从样品RNA提取开始到获得结果只需要6小时左右，其中本 发明荧光定量PCR使用的是一步法反应体系，操作更为简便快速，只需 1小时45分钟的时间。并且，本发明对操作实验室环境要求不高，规避 了以前抽检产品可能产生的漏洞，可在企业实现批批检测，进一步提高 了生物制品质控质量；

2、灵敏度高：现有检测方法是从生物学效应角度检测生物制品中 小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的潜在感染，其中因制剂在制备过程 中经过了多个工艺步骤的处理，残留鼠源病毒的活病毒抗原及病毒抗体 存在的可能性极小，而本发明从病毒核酸角度进行检测，相对前述药典 规定方法而言，提高了检测的灵敏度。利用本发明中的实时荧光定量PCR 检测鼠源生物制品中淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒时，可以准确定量， 目标RNA在10²～10⁷浓度范围内，都有很好的线性关系，灵敏度高可达 到20copies/μl(100copies/reaction)；

3、重复性、准确性和特异性：本发明中的引物和探针根据小鼠 LCMV基因组中Segment S序列设计，且与小鼠基因组无同源性，检测 特异性强，重复性好；

4、准确性更高：本发明使用的是RNA标准品，更贴近病毒的天然 状态；同时，在进行检测时标准品和样品都是RNA，在提取和扩增体系 上具有一致性；

5、回收率高：本发明从提取步骤开始(而不只是荧光定量PCR过 程)衡量了整个方法的可行性。行业内通用标准要求检测方法的回收率 要达到50％以上，本发明实时荧光定量PCR方法回收率均达到了80％以 上，是一种理想的可替代现有药典规定的检测方法。

附图说明

1、图1为实时荧光定量PCR定量曲线；

2、图2为实时荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

以下所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范 围。

下述实施例中所述试剂原料除特别注明来源外，均为市售的常见原 料，试剂的配制采用常规方法。实施例中未详述的方法均为本领域常规 操作，详见《分子克隆》第三版。

实施例1小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒专用引物和探针的设计

LCMV基因组分为两条单链RNA，分别是7.1kb左右的Segment L 和3.3kb左右的Segment S，两条RNA均为双义链。Segment L编码Z蛋 白和L蛋白：Segment S编码蛋白CPC和NP。

通过比对GenBank内不同株系LCMV的基因组，发现Segment S同 源性92.3％，选取Segment S中保守的同源序列：即SEQ ID NO：4所示核 苷酸序列。

针对找出的保守的同源序列区域设计实时荧光定量PCR检测专用引 物和探针序列，扩增出的目的片段大小为154碱基。其中优选的引物、 探针序列为：

上游引物QLCMV-154bp-F：

5’-GGTCAATCCCTCCCATAAGATCT-3’，即SEQ ID NO：1所示核苷酸序 列；

下游引物QLCMV-154bp-R：5’-GGAAGGGCATGGGAGAACA-3’， 即SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；

所述探针QLCMV-154bp-P：

5’-CCACTTGAGGTGGGCCCGCC-3’，即SEQ ID NO：3所示核苷酸 序列；

所述探针的5’端用荧光报告基团FAM标记，3’端用荧光淬灭基团 TAMRA标记。

用设计的引物、探针进行同源性比对后发现其只对小鼠淋巴细胞性 脉络丛脑膜炎病毒具有高度保守型，与小鼠基因组/EST、及其他近缘病 毒不同源，其特异性较高。

实施例2阳性RNA标准品的制备

首先制备含有同源序列SEQ ID NO：4所示核苷酸序列的pMD18-T载 体，以其为载体扩增得560bp的DNA片段，回收进行体外转录反应，反 应结束后消化DNA模板并纯化RNA，定量后作为阳性RNA标准品。

1、体外转录模板的制备

合成SEQ ID NO：4所示核苷酸序列，并将其插入pMD18-T载体中制 备而成(由Invitrogen公司合成)，命名为pMD18T-LCMV。以 pMD18T-LCMV为模板，用上游引物LCMV-560bp-F：5’-TAATACGACT CACTATAGGG-3’和下游引物LCMV-560bp-R  ： 5’-CTCAGACTTCGGGAG-3’进行扩增，扩增出560bp的DNA片段，琼 脂糖凝胶电泳回收后，作为体外转录的模板。

2、体外转录制备大量RNA

在RNase free的EP管中配制反应体系，具体配制比例如下所示：

37℃反应4小时。

3、RNA标准品中DNA的去除

1)上述反应体系中加入10μl DNaseI，37℃继续反应30min；

2)加DEPC-H₂O 50μl/酚仿100μl，Vortex混匀，4℃离心， 12000rpm，10min，转移上清，并重复该步骤一次；

3)加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，-20 ℃，30～60min；

4)4℃离心，12000rpm，10min，去上清。加1ml预冷的70％乙醇 (RNase free)洗一次；

5)沉淀干燥后，溶于100μl RNase free的水；

6)以纯化后的RNA为模板，用引物LCMV-560bp-F、 LCMV-560bp-R进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，若无扩 增条带则说明DNA消化完全，若有扩增条带则需从步骤1)开 始重复。

4、RNA的定量分装

体外转录的LCMV RNA标准品全长560nt，分子量1.9×10⁵Da，即1 μg纯化的RNA＝3.17×10¹³copies。紫外定量后，将LCMV RNA标准品 用20ng/μl的酵母tRNA稀释至2×10⁷copies/μl，分装成30～40μl每管， -80℃冻存。

实施例3实时荧光定量PCR扩增方法的建立

1、实时荧光定量PCR模板制备——总RNA提取：

根据使用说明，分别用Trizol/Trizol LS试剂盒(Invitrogen公司提供) 提取样品RNA，具体方法如下：

1)向样品(如为组织需研磨匀浆)中加入适量TRIzol//Trizol LS， 混匀，室温静置5min；

2)加入氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液200μl，用vortex剧烈混匀10s， 室温放置5min，4℃15000prm离心15min；

3)取上清，加等体积异丙醇沉淀，4℃15000prm离心15min；

4)去除上清，加入预冷的75％乙醇(体积比1∶1)洗RNA沉淀，4 ℃15000prm离心10min；

5)去除上清，真空干燥，用50μl RNase-free水溶解沉淀；

6)加DNase I消化液，37℃孵育30min；

7)加300μl RNase-free水，加苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液 400μl，用vortex剧烈混匀30s，4℃15000prm离心4min；

8)取水相，加入氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液400μl，vortex剧烈混匀 30s，4℃15000prm离心4min；

9)加入3M醋酸钠(pH5.2)20μl，vortex混匀。加入预冷的无水乙 醇1000μl，vortex混匀10s，4℃15000prm离心15min；

10)去除上清，加入预冷的75％乙醇500μl，4℃15000prm离心10min；

11)真空干燥，加RNase-free水100μl溶解，-80℃备用。

2、实时荧光定量PCR反应体系

本发明人以LCMV RNA标准品为模板，对探针、引物的不同组合进 行摸索，最终确定了探针和引物的最佳组合：20μl反应体系中10μM探 针0.5μl、10μM实时荧光定量PCR上下游引物各0.5μl。

具体地，进行样品测定时，以总RNA为模板，进行实时荧光定量 PCR，其中反应体系为：

反应体系(20μl)：

上述反应体系中所用试剂可购自AB公司，也可直接使用其试剂盒 Taqman RNA to C_T 1-step kit(cat#4392938)。

3、实时荧光定量PCR反应条件

以上述反应体系进行实时荧光定量PCR，对反应程序中的退火温度 进行摸索，确定最佳退火温度为60℃。

具体反应条件为：

48℃，15min；95℃，10min；95℃，15sec，60℃，40sec，共40个 循环。每个循环结束后采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

实施例4方法学验证

1、标准曲线的建立及实时荧光定量PCR的灵敏度

将实施例2备用的LCMV RNA标准品稀释至10、10²、10³、10⁴、 10⁵、10⁶、10⁷copies/μl为模板，按照实施例3中的反应体系和反应条件 进行实时荧光定量PCR反应，随着PCR体系的每一个循环结束后测定吸 光值，就得到了以循环数为横坐标，吸光值为纵坐标的定量曲线和以标 准品浓度的对数值为横坐标，Ct为纵坐标的标准曲线。其中，Ct值的含 义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

本发明实时荧光定量PCR的检测低限：在40个循环内出现可信Ct 值的稀释低限，当每差10倍模板量，Ct值相差3.3的Ct值被认为是可 信的Ct值，由图1所示的定量曲线可得出，该实时荧光定量PCR的灵敏 度可达到20copies/μl(100copies/reaction)。

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性 关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的阳性定量标 准品作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。 因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起 始拷贝数。

标准曲线如图2所示，标准曲线R²＝0.997，线性相关性良好。

2、实时荧光定量PCR的重复性、准确性和特异性

将LCMV RNA标准品分别稀释至浓度为10⁶、10⁴、10²copies/μl 作为高、中、低值质控，以无病小鼠RNA为阴性对照即阴性质控品，以 RNase-free H₂O为空白对照，进行实时荧光定量PCR，测量结果如下表1：

表1

由上述结果可知，

1)空白对照成立，实验结果有效；无病小鼠RNA检测结果为阴性； 高中低值质控检测结果为阳性，故说明本检测方法具有很强的特异 性；

2)3次实验标准偏差在15％以内，说明本发明重复性好，精密度符合 要求；

3)准确度符合要求。

3、回收率实验

取4份小鼠肝脏组织(编号1～4)和4份市售苏肽生(编号4～8，溶 解后的注射液)，将LCMV RNA标准品稀释至浓度10⁸、10⁶、10⁴copies/ μl，按下表2配比配制供试样品(模拟阳性样品)。

表2供试样品配制

按实施例3中的提取方法提取RNA，作为PCR反应的模板，然后 按实施例3的反应体系和条件进行实时荧光定量PCR反应，其中空白对 照以RNase-free H₂O为模板，三次重复结果如表3所示，计算该方法的 回收率。

表3

由上述结果可知，

空白对照成立，阴性对照无信号，阳性样品均为阳性，本实验成立， 同时本检测方法回收率均在80％以上，比行业标准50％要高。

实施例5小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的实时荧光检测试剂盒

将上述用于对小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒进行实时荧光定 量PCR检测的上下游引物探针混合液500μl，2×Taqman RT-PCR Mix 10ml，40×Taqman RT-Enzyme MIX 0.5ml，阳性RNA标准品(1× 10⁷copies/μl)50μl及稀释液10ml，阴性对照品25μl，RNase-free H₂O10ml共同包装，得到小鼠淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的实时荧光 检测试剂盒。

该试剂盒使用方法：

以按实施例3-1中提取的样品总RNA作为模板，阳性RNA标准品1 ×10⁷copies/μl作为阳性对照模板，同时使用阴性对照、RNase-free H₂O 空白对照，按照实施例3-2的反应体系和实施例3-3的反应条件进行实时 荧光定量PCR，同时参照实施例4-1的方法将阳性RNA标准品稀释为不 同浓度进行实时荧光定量PCR制作标准曲线。

结果分析，当阳性对照、阴性对照、空白对照都正常时，只要获得 未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本 发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包 含在本发明的保护范围之内。