能促进文山红柱兰组培苗生长的轮枝霉属真菌的分离与应用

摘要

本发明涉及一种能促进文山红柱兰组培苗生长的轮枝霉属真菌的分离与应用，属于植物保护和生物技术领域。其生产菌株为轮枝霉属(Verticillium spp.)菌株，保藏号CGMCC No.3927。发明的菌株具有能促进兰花组培苗生长的显著特点。本发明将分离到的共生真菌分两种方法接种到文山红柱兰组培幼苗中，用形态学特征对分离菌株进行初步鉴定，结合分子生物学如：ITS扩增、克隆测序等方法，鉴定出本次筛选到能促进文山红柱兰组培苗生长的共生菌为轮枝霉属(Verticillium spp.)真菌。本发明可以一定程度上解决兰科组培苗移栽成活率低的问题，对今后兰花产业发展有积极的促进作用。

说明书

技术领域：

本发明是关于从兰花根中分离到的菌根菌对文山红柱兰组培苗生长有促进作用，属于植物保护和生物技术领域。 

背景技术：

兰科(Orchidaceae)植物俗称兰花，全世界约有700属20000多种及大量变种，主要分布于热带、亚热带和温带地区，尤其南美洲和亚洲的热带地区为多。兰科植物根据生长环境的不同可分为地生兰、附生兰和腐生兰3类，作为一种重要的观赏花卉和药用植物资源，在花卉和天然药物产业上有着巨大的经济价值和利用潜能。随着中药现代化和兰花产业的快速发展，对兰科植物的需求迅速增长。但兰科植物种子细小，仅具未分化的原胚；根粗大，根毛不发达。在自然条件下种子不能正常萌发，根也不能满足植物体对水分和营养物质的需求，使兰科植物的人工栽培相当困难。近年来，组织快繁技术已应用于兰科植物，实现了兰科植物的工厂化育苗，但组培苗移栽成活率很低，生长缓慢，很难大面积推广，其主要原因在于兰花在短期内无法与相关的真菌形成菌根，菌根真菌对于兰科植物有着重要的意义。研究表明，自然状态下只有真菌与兰科植物种子或根形成共生的菌根关系后，兰科植物才能正常地萌发和生长发育。 

菌根是土壤中的一类真菌与植物根系之间所形成的互惠互利的共生联合体。1885年Frank提出了“菌根(Mycorrhiza)”这一术语来描述植物与真菌的共生联合体，由此菌根研究开始迅速发展。Link首先证实了兰科植物根中存在着真菌，之后，兰科植物与菌根关系得到证实，并进行了广泛研究。1903年Bernard首次报道了真菌和兰科植物种子萌发的关系。Burgeff对真菌和兰科种子研究得出，兰科种子在真菌的侵染下萌发，他分离并命名了许多真菌，发展 了消化真菌作为兰科植物生长营养来源的重要理论，之后国内外相继大量开展了兰科菌根真菌与兰科植物之间的关系的研究。 

我国兰科植物菌根菌研究发展很快，天麻菌根菌已经成功地应用于天麻种子萌发和人工栽培。但尚有很多兰科植物菌根菌需要研究，深入了解共生菌的种类及特点，探讨兰科植物与真菌间的相互作用机制，筛选优良的兰科植物共生真菌，研制兰科菌剂，对于实现兰科植物的工厂化生产具有重要的意义。 

发明内容：

本发明的主要目的是解决兰科组培苗移栽成活率低，筛选出有利于兰科植物生长的共生菌。 

本发明采用的真菌是轮枝霉属(Verticillium tenerum)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2010年06月17日；保藏登记入册的编号CGMCC No.3927。 

本发明的真菌菌株轮枝霉属(Verticillium spp.)菌株，分离自兰花根内组织，经培养性状，形态学和分子鉴定，该菌株为轮枝霉属(Verticillium spp.)。该菌株具有以下特征：(1)该菌株在显微镜下可观察到分生孢子梗轮状分枝，产孢细胞基部略膨大；(2)该菌株能促进兰花组培苗的生长。 

本发明是这样实现的：分离兰花根内真菌，对分离到的真菌进行形态鉴定，并对其进行兰花组培苗的接种筛选有效共生真菌，对有效菌株进行ITS区段克隆测序。 

本发明轮枝霉属(Verticillium spp.)的分离鉴定方法： 

1、菌根菌的分离和纯化 

PDA固体培养基配方为：20％马铃薯，2％葡萄糖，2％琼脂粉。 

从兰花植株上取下健壮根段，冲洗干净，放入烧杯内待用。在进行好灭菌和消毒处理的超净工作台上，将烧杯内的根段用70％酒精消毒30s，再用0.1％升汞溶液浸泡1min，最后用无菌水清洗3-5遍。在无菌条件下，捣碎组织，倒入无菌水，在显微镜下用移液枪吸取菌丝团到PDA培养基中，24℃恒温黑暗培养，菌落长成后，重复取菌落边缘部分进行转接纯化。 

2、分离菌株的形态学鉴定 

将纯化后的菌株在25℃的恒温下培养5-7天，用镊子或解剖针在菌落边缘取少量菌丝放在载玻片上，用3％的KOH溶液和0.05％番红染液染色做成玻片，通过显微镜观察其形态特征，初步鉴定分离菌株所属。 

3、分离菌株的分子鉴定 

3.1DNA的提取 

将菌丝接种于液体PDA中，在25℃条件放置于摇床上培养10天，用吸水纸吸干菌丝水分称取重量，转入预冷的研钵内，用液氮将其充分研磨至粉末状，加入1mlDAN提取缓冲液(100mM Tris-HCL PH8.0；100mM EDTA；250mMNaCl)、20％SDS、5M NaCl、10％CTAB，充分混匀，在60℃条件下保温60分钟，10,000rpm离心5分钟取上清液，加入等体积的饱和酚，离心取上清液，加入等体积的25∶24∶1的饱和酚∶氯仿∶异戊醇，离心取上清液，加入等体积的24∶1的氯仿∶异戊醇震荡混合，离心取上清液，加2倍体积的冰无水乙醇置于-20℃冰箱，沉淀DAN，离心，保留沉淀，并用70％冰乙醇漂洗2次，自然风干或真空干燥，加入TE缓冲液溶解DAN，置于-30℃待用。 

3.2分离菌株的5.8S rDNA-ITS克隆与测序 

用ITS1和ITS4引物进行DNA扩增。扩增反应在PCR仪Perkin Elmer上进行，PCR反应体系为50uL。如下PCR循环：94℃预变性3min，循环1次；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，30次循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物用大连宝生物提供的试剂盒进行纯化，纯化产物可直接测序、备用。质粒载体pGEM-T-easy与PCR纯化产物连接反应、转化，经红-白斑筛选后经重组质粒PCR，最后选取阳性的重组子送上海生工进行DNA测序。 

3.3序列分析 

利用Bioxm、DNAMAN和BLAST等软件分析，与GenBank中登陆的已知序列进行同源性比较。 

本发明轮枝霉属(Verticillium spp.)真菌促进文山红柱兰组培苗生长试验 

1、试验材料准备 

取土质较好的土壤，灭菌；选择文山红竹兰组培苗为供试材料，与兰花根材料中分离的真菌进行接种实验。 

2、试验方法 

2.1拌土接种，把培养好的菌株接种到种有文山红柱兰组培苗的土中，进行共生培养，并以不接菌的土所种的兰花作为对照，重复接种3次，2个月后观察兰花苗的叶色，长势，根系生长情况，筛选出有效菌。 

2.2用分离的菌株侵染文山红柱兰组培苗根，保湿接种后一周后把兰花苗种于灭菌土中，进行共生培养，并以不接菌的土所种的兰花作为对照，重复接种3次，2个月后观察兰花苗的叶色，长势，根系生长情况，筛选出有效菌。 

3、试验结果 

表1轮枝霉属(Verticillium spp.)菌株与文山红柱兰组培苗共生培养情况 

从表1可以看出轮枝霉属(Verticillium spp.)菌株接种的文山红柱兰组培苗成活率较高，拌土接种和菌株侵根的平均成活率达到了85.00％和86.11％。对组培苗移栽成活率起比较明显的促进作用。 

2个月后，经筛选，发现轮枝霉属(Verticillium spp.)菌株接种的文山红柱兰组培苗的叶色和长势都明显要比对照的好，兰苗叶色较绿，根系发达，长势良好，筛选出有利于兰科植物生长的共生菌。 

附图说明

图1是轮枝霉属(Verticillium spp.)菌株在PDA培养基上的培养性状图； 

图2是轮枝霉属(Verticillium spp.)菌株接种到种有文山红柱兰组培苗土中的接种效果与对照图； 

图3是轮枝霉属(Verticillium spp.)菌株侵染文山红柱兰组培苗根的接种效果图； 

图4是轮枝霉属(Verticillium spp.)菌株侵染文山红柱兰组培苗根的接种对照图。 

具体实施方式：

共生菌的分离： 

PDA固体培养基配方为：20％马铃薯，2％葡萄糖，2％琼脂粉。 

从兰花植株上取下健壮根段，冲洗干净，放入烧杯内待用。在进行好灭菌和消毒处理的超净工作台上，将烧杯内的根段用70％酒精消毒30s，再用0.1％升汞溶液浸泡1min，最后用无菌水清洗3-5遍，在无菌条件下，捣碎组织，倒入无菌水，在显微镜下用移液枪吸取菌丝团到PDA培养基中，24℃恒温黑暗培养，菌落长成后，重复取菌落边缘部分进行转接纯化。 

分离菌株的形态鉴定：将纯化后的菌株在25℃的恒温下培养5-7天，用镊子或解剖针在菌落边缘取少量菌丝放在载玻片上，用3％的KOH溶液和0.05％番红染液染色做成玻片，通过显微镜观察其形态特征，初步鉴定分离菌株所属。 

有效菌株的筛选： 

把培养好的菌株接种到种有文山红柱兰组培苗的土中，进行共生培养，并以不接菌的土所种的兰花作为对照，2个月后观察兰花苗的叶色，长势，根系生长情况，筛选出有效菌； 

用分离的菌株侵染文山红柱兰组培苗根，保湿接种后一周后把兰花苗种于灭菌土中，进行共生培养，并以不接菌的土所种的兰花作为对照，2个月后观察兰花苗的叶色，长势，根系生长情况，筛选出有效菌。 

菌株的分子鉴定： 

分离菌株DNA的提取：将菌丝接种于液体PDA中，在25℃条件放置于摇床上培养10天，用吸水纸吸干菌丝水分称取重量，转入预冷的研钵内，用液氮将其充分研磨至粉末状，加入1mlDAN提取缓冲液(100mM Tris-HCL PH8.0；100mM EDTA；250mM NaCl)、20％SDS、5M NaCl、10％CTAB，充分混匀，在60℃条件下保温60分钟，10,000rpm离心5分钟取上清液，加入等体积的饱和酚，离心取上清液，加入等体积的25∶24∶1的饱和酚∶氯仿∶异戊醇，离心取上清液，加入等体积的24∶1的氯仿∶异戊醇震荡混合，离心取上清液，加2 倍体积的冰无水乙醇置于-20℃冰箱，沉淀DAN，离心，保留沉淀，并用70％冰乙醇漂洗2次，自然风干或真空干燥，加入TE缓冲液溶解DAN，置于-30℃待用。 

分离菌株的5.8S rDNA-ITS克隆与测序：用ITS1和ITS4引物进行DNA扩增。扩增反应在PCR仪Perkin Elmer上进行，PCR反应体系为50uL。如下PCR循环：94℃预变性3min，循环1次；94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，30次循环；最后72℃延伸10min。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物用大连宝生物提供的试剂盒进行纯化，纯化产物可直接测序、备用。质粒载体pGEM-T-easy与PCR纯化产物连接反应、转化，经红-白斑筛选后经重组质粒PCR，最后选取阳性的重组子送上海生工进行DNA测序。所测序列为： 

GCTAACCGGTCTGTACACTCATAACCCTTTGTGACCATTATACCTAGTTGCTTCGGCGGCGCGCCTCCGGGCGTGCCCGCCGGCCAATTATAGTCTCTTAGTTGTGAATCGACGTTACATCTGAGTGTTCTAAGCGAACTGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCCAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCTTCCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCCTCGAGCCCCCGTGGCCCGGTGTTGGGGACGCTGCCCAGCTACCTGGGCAGCCCCCCTAAATGCAGTGGCGGTCCCGCAAGTCCCAGCCCTTTGCGTAGTAATATCATTCTCGCTCTGGACGGCTCGCGGGCTTACCAGCCTCGAAACCCCCTACAAAGACCGCCCCGGCGGCAACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAGCCGGGGGAGGAA 

利用Bioxm、DNAMAN和BLAST等软件分析，与GenBank中登陆的已知序列进行同源性比较。经比对，该分离菌株属于轮枝霉属(Verticillium spp.)菌株真菌。 

即得本发明共生真菌菌株。 

核苷酸序列表：

GCTAACCGGTCTGTACACTCATAACCCTTTGTGACCATTATACCTAGTTGCT

TCGGCGGCGCGCCTCCGGGCGTGCCCGCCGGCCAATTATAGTCTCTTAGTT

GTGAATCGACGTTACATCTGAGTGTTCTAAGCGAACTGTTAAAACTTTCAA

CAACGGATCTCTTGGCTCCAGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATA

TGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATT

GCGCCTTCCAGTATCCTGGGAGGCATGCCTGTCCGAGCGTCGTTTCAACCC

TCGAGCCCCCGTGGCCCGGTGTTGGGGACGCTGCCCAGCTACCTGGGCAG

CCCCCCTAAATGCAGTGGCGGTCCCGCAAGTCCCAGCCCTTTGCGTAGTAA

TATCATTCTCGCTCTGGACGGCTCGCGGGCTTACCAGCCTCGAAACCCCCT

ACAAAGACCGCCCCGGCGGCAACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATAC

CCGCTGAACTTAAGCATATCAATAGCCGGGGGAGGAA