低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物及其交联材料和用途

摘要

本发明公开了一类低改性生物相容高分子巯基化改性衍生物，这些衍生物具有很低的巯基化改性度，最大限度保持了生物相容高分子的初始结构、生理功能和生物相容性，同时引入的巯基可有效地进行化学交联以制备低交联度的生物相容高分子交联材料。本发明还公开了一类双硫键交联的生物相容高分子交联材料，这些交联材料具有很低的交联度，不仅最大限度保持了生物相容高分子的初始结构、生理功能和生物相容性，同时也有效地延缓了生物相容高分子在体内的代谢和降低了溶解性，能较好地满足各种临床医学应用的要求。本发明还涉及该双硫键交联的生物相容高分子交联材料在医学和药学中的用途。

说明书

技术领域

本发明涉及低改性度生物相容高分子衍生物，尤其涉及低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物，本发明还涉及低交联度的双硫键交联的生物相容高分子交联材料，此外本发明还涉及该交联材料在医药领域中的应用。

背景技术

生物相容高分子具有许多重要的生理功能，例如透明质酸在关节炎的增粘治疗、促进创伤愈合等方面具有显著的效果。然而，通常生物相容高分子在体内的代谢很快或者易溶于体液，这在很大程度上限制了其在很多临床医学中的应用，例如透明质酸用于关节炎的增粘治疗的疗程为连续五周的每周一次关节注射，不仅给患者和医务工作者带来不便，同时还增加了感染的风险。对生物相容高分子进行化学改性、化学交联、或者化学改性后进行交联是延缓生物相容高分子在体内的代谢和降低溶解性的有效手段，显著拓展了生物相容高分子在临床医学中的应用。例如对于关节炎的增粘治疗，交联透明质酸钠的一次关节注射即可达到非交联透明质酸钠五次关节注射的疗效；同时交联透明质酸还被广泛应用于真皮填料等美容用途。

虽然生物相容高分子的化学改性和/或交联大大拓展了其在临床医学中的应用，然而在理论和实际过程中仍然存在相互矛盾之处。一方面，生物相容高分子的化学改性和/或交联必须达到一定程度才能延缓生物相容高分子在生物体内的代谢和降低溶解性，因此目前在临床医学中得到广泛应用的化学改性和/或交联的生物相容高分子衍生物或交联材料都具有很高或者比较高的改性度或交联度，例如意大利Fidia公司的HYAFF系列产品是高度酯化的透明质酸钠衍生物(改性度可高达100％)；另一方面，化学改性和/或交联改变了生物相容高分子的化学结构，影响和降低了生物相容高分子的生理功能和生物相容性能，甚至引起一定的副反应，例如Jacob等人的研究结果表明基于高度改性HYAFF的引起了炎性反应和成骨化反应(Jacob等，Laryngoscope 112：37-42，2002)。

然而，目前大部分的研究都集中于提高改性度和/或交联度以延缓生物相容高分子在体内的代谢和降低溶解性。在我们看来，相当多的情况下高度改性和/或交联的生物相容高分子并不能较好地满足临床医学应用的需要，甚至还可能引起炎症反应等副作用。因此，生物相容高分子的化学改性和/或交联必须兼顾两方面的因素：即尽可能降低化学改性和/或交联程度以保持生物相容高分子的初始结构、生理功能和生物相容性，同时化学改性和/或交联程度需要适当地延缓生物相容高分子在体内的代谢和降低溶解性以满足临床医学应用的要求。然而同时兼顾上述两方面因素的生物相容高分子化学改性和/或交联是一个技术难题。

生物相容高分子的巯基化改性和双硫键交联是一种新型的化学改性和交联方法，具有很多优点，在临床医学中具有许多重要的潜在用途。例如生物相容高分子巯基化衍生物已经被用于各种小分子药物和多肽蛋白药物的化学活性修饰等等，基于这些生物相容高分子巯基化衍生物制备的交联材料可以作为细胞生长基质、创伤修复再生基质、药物缓释载体、伤口敷料，原位包埋细胞基质等(Bernkop-Schnurch，WO2000/025823；Shu等，Biomacromolecules，3：1304，2002；Bulpitt等，WO2002/068383；Prestwich等，WO 2004/037164；Prestwich等，WO 2005/056608；Prestwich等，WO2008/008857；Song，WO2008/071058；Song，WO2008/083542；Gonzalez等，WO2009/132226)。通常研究人员认为较高的巯基化改性度对于制备后续的生物相容高分子巯基化改性衍生物的交联材料是必须的，因此在上述公开的文献报道中，生物相容高分子的巯基化改性度和/或交联度都很高，例如在Shu等的报道中26.8～66.8％的基团被改性和交联(Shu等，Biomacromolecules，3：1304，2002)。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一类低巯基化改性度的生物相容高分子巯基化衍生物，这些低巯基化改性度的生物相容高分子巯基化衍生物最大限度保持了生物相容高分子的初始结构、生理功能和生物相容性，同时引入的巯基可有效地进行化学交联以制备低交联度生物相容高分子交联材料。

本发明要解决的技术问题之二是提供一类双硫键交联的生物相容高分子交联材料，该交联材料具有很低的双硫键交联度，不仅最大限度保持了生物相容高分子的初始结构、生理功能和生物相容性，同时也有效地延缓了生物相容高分子在体内的代谢和降低了溶解性，较好地满足各种医药学应用的要求。另外，这些双硫键交联生物相容高分子交联材料的交联过程可以在可注射容器内完成，具有可注射的性能，使用方便、不含杂质、生物相容性好、无毒副作用，在医药领域具有非常广泛的应用前景。

本发明要解决的技术问题之三是提供上述双硫键交联生物相容高分子交联材料在医药领域中的用途。

在本发明中所使用的部分术语定义如下所述。

生物相容高分子是指具有良好生物相容性的高分子，包括多糖、蛋白质以及合成高分子等等。其中多糖包括硫酸软骨素、皮肤素、肝素、类肝素、海藻酸、透明质酸、硫酸皮肤素、果胶、羧甲基纤维素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖等以及它们的盐形式(如钠盐，钾盐等)和衍生物形式；合成高分子包括聚丙烯酸、聚天冬氨酸、聚酒石酸、聚谷氨酸、聚富马酸等以及它们的盐形式(如钠盐，钾盐等)和衍生物形式；蛋白质包括胶原蛋白、碱性明胶蛋白、酸性明胶蛋白、弹性蛋白、核心蛋白、多糖层粘连蛋白、纤维结合蛋白等以及它们的盐形式(如钠盐，钾盐等)和衍生物形式。生物相容高分子优选硫酸软骨素、肝素、类肝素、海藻酸、透明质酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、碱性明胶蛋白和酸性明胶蛋白以及它们的盐形式(如钠盐，钾盐等)和衍生物形式；特别优选硫酸软骨素和透明质酸以及它们的盐形式(如钠盐，钾盐等)和衍生物形式。

生物相容高分子巯基化衍生物是指生物相容高分子侧链基团通过化学方式引入巯基的衍生物，巯基化改性度是指引入巯基的数量占生物相容高分子可供改性侧链基团数量的百分比。例如，当透明质酸的侧链羧基进行巯基化改性时，巯基化改性度是指引入巯基的数量占透明质酸侧链羧基总数量的百分比。

双硫键交联是指生物相容高分子巯基化衍生物通过双硫键的形式形成三维网状结构，双硫键交联度是指生物相容高分子巯基化衍生物中形成双硫键的巯基数量占生物相容高分子可供改性侧链基团数量的百分比。

水凝胶是指含有大量水的具有三维交联网络结构的物质，介于液态和固态之间，没有流动性，凝胶化是指从具有流动性的液态到失去流动性的凝胶态的过程。

动力粘度是指使单位距离的单位面积液层产生单位流速所需之力，其单位为厘泊(mPa·s)或泊(Pa·s)。动力粘度是评定粘度的指标，动力粘度越小，流动性越好，反之则流动性越差。

本发明的一方面是提供了一类低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物，这些低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物最大限度保持了生物相容高分子的初始结构、生理功能和生物相容性，同时引入的巯基可有效地进行化学交联以制备低交联度的生物相容高分子交联材料。

在本发明中，低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物通常可以通过下述方法制备，这些方法已经在专利文件WO2009006780进行了描述。方法一是侧链羧基的氨基(酰肼)/碳二亚胺偶合化学方法。其通常方式是羧基在碳化二亚胺的活化下形成中间产物，含有双硫键的二氨或二酰肼亲核取代生成中间产物，最后双硫键还原为巯基即可得到生物相容高分子巯基化衍生物(Shu等，Biomacromolecules，3，1304，2002；Aeschlimann等，US 7,196,180B1)。也可用含有自由巯基(或巯基保护)的伯氨代替含有双硫键的二氨或二酰肼，即可得到生物相容高分子巯基化衍生物，或所得到的中间产物脱除巯基保护基团即可得到生物相容高分子巯基化衍生物(Gianolio等，Bioconjugate Chemistry，16，1512，2005)。上述的碳化二亚胺通常是指1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐。方法二是侧链羧基直接与含有双硫键的碳二亚胺(如2，2’-二硫代双(N-乙基(N’-乙基碳二亚胺))等等)反应制备，所制备的生物相容高分子巯基化改性衍生物具有下述通式(III)的结构(Bulpitt等，US 6884788)。方法三是对侧链氨基的改性，一般分为直接和间接改性两种方式。直接改性方式是指对侧链氨基的直接修饰，引入巯基。例如双丁二酸双酰胱胺双羰二咪唑活化酯对胶原氨基的巯基化改性(Yamauchi等，Biomaterials，22，855，2001；Nicolas等，Biomaterials，18，807，1997)。方法三中氨基的间接巯基化改性方式一般分为两个步骤。第一步是氨基的羧基化，第二步是采用前述方法一或二进行羧基的巯基化改性。方法四是侧链羟基的改性。通常的方法是羟基在强碱条件下的羧基化，然后羧基再按照前述方法一和方法二巯基化，例如，纤维素、透明质酸、甲壳素和壳聚糖等高分子的侧链羟基都可以羧甲基化，然后采用氨基(酰肼)/碳二亚胺碳化学反应进行巯基化改性。

对于具有一种或多种官能团(羧基、氨基和羟基)的生物相容高分子，可采用上述一种或多种方法制备本发明的低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物。

在本发明中，低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物采用前述制备方法制备，通过调节反应原料的投料比、反应时间、反应温度等参数，即可实现本发明。

在本发明中，低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物的纯化是非常重要的。残余杂质不仅可能在生物体内产生炎症等毒副作用，同时还会干扰后续的双硫键交联。在本发明中，残余杂质可以通过透析和/或有机溶剂(如乙醇等)沉淀等方法去除。

在本发明中，所采用的生物相容高分子的分子量通常在1000～10000000之间，优选10000～3000000，特别优选20000～1500000。

在本发明中，保留了大部分的生物相容高分子的初始结构，巯基化改性度很低。本发明的低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物侧链至少含有三个巯基，且巯基化改性度≤4.5％，巯基化改性度优选0.5％～3.0％，巯基化改性度特别优选0.75％～2.5％。

对于生物相容高分子巯基化衍生物，研究人员普遍具有一种技术偏见：即较高的巯基化改性度对于制备后续的生物相容高分子巯基化衍生物的交联材料以及满足临床医学用途是必须的。例如，Prestwich等的研究表明巯基化改性度较高的生物相容高分子衍生物才能较好地实现交联(Prestwich等，WO 2008/008857)，因此研究人员普遍倾向于提高生物相容高分子的巯基化改性程度。Sparer等在1983年公开了糖胺多糖(透明质酸和硫酸软骨素-半胱氨酸甲酯的衍生物，半胱氨酸甲酯与糖胺多糖通过酰胺键偶合，5％～87％的糖胺多糖侧链羧基被改性为巯基(Sparer等，Chapter 6，Page 107-119，Controlled Release Delivery System，Edited byTheodore J.Roseman，S.Z.Mansdorf，Marcel Dekker Inc.)。Gianolio等于2005年公开了透明质酸-半胱胺衍生物，半胱氨与透明质酸的侧链羧基通过酰胺键偶合，22％的透明质酸侧链羧基被改性为巯基(Gianolio等，Bioconjugate Chemistry，16：1512-1518，2005)。印等于2008年公开了透明质酸-半胱胺衍生物，半胱氨与透明质酸的侧链羧基通过酰胺键偶合，衍生物同时含有10～200μmol/g巯基和120～500μmol/g双硫键，按照透明质酸的二糖重复链段分子量为400计算，巯基化改性度分别为10％～48％(即10％～48％的透明质酸侧链羧基被巯基化改性)(印等，CN 101367884)。Shu等公开的通过酰肼键偶合的透明质酸巯基化衍生物的巯基化改性度为26.8％～66.8％(Shu等，Biomacromolecules，3：1304，2002)。

然而，当巯基化改性度较高时，生物相容高分子的初始结构被显著改变，这会对生物相容高分子的生理功能和生物相容性产生不利的影响。例如王等的研究结果表明壳聚糖巯基化衍生物在高巯基化改性度时产生了显著的细胞毒性(王等，高等学校化学学报，29：206-211，2008)，我们的研究也表明高度的巯基化改变了透明质酸的结构，干扰了与受体(如CD44等)的结合。

在本发明中，所制备的低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物采用前述一种或多种方法进行了高度纯化，残余杂质的重量含量通常小于千分之一甚至万分之一。

本发明的有益效果是本发明的低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物的巯基化改性度很低，最大限度保持了生物相容高分子的初始结构、生理功能和生物相容性，同时还具有原料用量少、反应时间短等特点，此外本发明的低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物可以方便地用于制备交联材料和满足多种临床医学用途的要求。另外本发明还克服了前述技术偏见：即较高的巯基化改性度对于制备后续的生物相容高分子巯基化衍生物的交联材料以及满足临床医学用途是必须的。

本发明的另一方面是提供一类双硫键交联的生物相容高分子交联材料，这些生物相容高分子交联材料具有很低的双硫键交联度，不仅最大限度保持了生物相容高分子的初始结构、生理功能和生物相容性，同时也有效地延缓了生物相容高分子在体内的代谢和降低了溶解性，较好地满足各种临床医学应用的要求。本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联材料通常为水凝胶的形式，其优选含水量为95％(重量/体积百分比，g/ml)以上的水凝胶形式，特别优选含水量为98％(重量/体积百分比，g/ml)以上的水凝胶形式。本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶干燥或冷冻干燥后即可制成薄膜、海绵等多种固态形式。

本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶采用本发明的低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物为原料制得，一种实现途径如下所述：将本发明的低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物溶解于水得到合适浓度的溶液(通常为0.2％～5.0％)，调节溶液pH值为特定值(通常为中性，即pH值约为7)，然后巯基在空气中的氧气和溶液中的溶解氧气的氧化下逐渐形成双硫键，溶液逐渐凝胶化，溶液动力粘度逐渐增加，最终溶液失去流动性形成三维网状交联结构。也可以在上述溶液中加入氧化剂(如过氧化氢等)加快交联过程。

本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶的第二种实现途径是采用Shu等公开的方法(WO2010043106)。在该方法中凝胶化过程可以在可注射容器内完成，具有可注射的性能，使用方便、不含杂质、生物相容性好、无毒副作用等特点。该实现途径的具体过程如下所述：将本发明的低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物溶解于水得到合适浓度的溶液(通常为0.2％～5.0％)，调节溶液pH值为特定值(通常为中性)，然后将溶液灌注于可注射容器内并密封，巯基主要在溶液中溶解氧气的氧化下逐渐形成双硫键，溶液逐渐凝胶化，溶液动力粘度逐渐增加，最终溶液失去流动性形成三维网状交联结构。也可以在上述溶液中加入氧化剂(如过氧化氢等)加快交联过程。

本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶的第二种实现途径可采用无菌工艺或终端灭菌工艺(如医药工业常用的湿热灭菌工艺等)的方式生产，以满足不同临床医学要求。可采用医药工业常用的罐封生产线实现大规模工业化生产，每小时产量可方便地达3000支以上。罐封生产线可选用高宁格公司的直线式全自动注射器预灌封生产线或蜂巢式注射器全自动预罐装和加塞设备、以及德国博世等公司的预消毒灭菌注射器液体灌封机等等。可注射容器可以是玻璃材质或塑料材质注射器，如BD公司的Hypak SCF类预消毒灭菌注射器，也可以用软胶袋等可挤出容器代替注射器。

在本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶中，由于采用本发明的低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物为原料，双硫键的交联度取决于本发明的低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物的巯基化改性度(≤4.5％)，因此本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶中的双硫键交联度也很低(≤4.5％)。通常情况下在本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶中一半以上的巯基被氧化成了双硫键，形成了三维网状交联结构，失去了液体溶液的流动性，具有很高的动力粘度。与未形成交联的初始溶液相比较，本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶的动力粘度通常提高了50倍以上，在优化条件下甚至可提高500倍以上，本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶的高动力粘度的特性使其在术后粘连防治、关节炎增粘治疗等重要临床医学用途方面具有独特的优势。

采用旋转粘度计，按照《中华人民共和国药典》(2005年版)二部附录VI G第二法测定，在剪切速率不小于0.25Hz、25±0.1℃条件下，本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶的动力粘度通常大于10000厘泊(mPa·s)，动力粘度优选大于25000(mPa·s)，动力粘度特别优选大于40000(mPa·s)。

本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联材料可以含有一种或多种本发明的低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物，此外还可以含有一种或多种其它物质。这些物质可以是多糖、蛋白质或合成高分子，如硫酸软骨素、肝素、类肝素、海藻酸、透明质酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、胶原蛋白、碱性明胶蛋白和酸性明胶蛋白以及它们的盐形式(如钠盐，钾盐等)和衍生物形式等，优选透明质酸钠、硫酸软骨素、肝素钠、碱性明胶蛋白和酸性明胶蛋白等，特别优选透明质酸钠、硫酸软骨素和肝素钠；这些物质也可以是活性药物组份，包括类固醇、抗生素、治疗肿瘤的药物和各种多肽蛋白药物，例如皮质激素(属于类固醇)，如倍氯米松、倍氯美松双丙酸酯、布地奈德、地塞米松、泼尼松龙、泼尼松等；又如各种多肽蛋白药物，如各种生长因子(碱性生长因子、酸性生长因子、血管生长因子、成骨生长因子等)、核酸(如RNA)等等。该活性药物组份可以固体颗粒形式分散和/或溶解在本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联材料中。

在医药领域的实际应用中，要求双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶有合适的贮存时间，其性能需要保持稳定。然而，双硫键交联的高改性生物相容高分子交联水凝胶并不稳定，随着贮存时间的增加，水凝胶逐渐收缩，大量水从水凝胶中被挤出，导致动力粘度大大降低，严重影响了凝胶性能，不符合临床医学实际应用的需要，严重制约了双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶在医药领域中的应用。例如双硫键交联的透明质酸交联水凝胶(13.5％的巯基化改性度)在室温储存6个月后，水凝胶的体积收缩了约30％。

本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶采用本发明的低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物为原料，取得了意想不到的技术效果，很好地解决了上述双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶不稳定的难题。为期6个月的稳定性加速试验表明本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶具有很好的稳定性，将结合实施例进一步说明。

本发明的有益效果是本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联材料具有很低的交联度，不仅最大限度保持了生物相容高分子的初始结构、生理功能和生物相容性，同时具有很高的动力粘度，有效地延缓了生物相容高分子在体内的代谢和降低了溶解性，较好地满足各种临床医学应用的要求。本发明的有益效果还包括本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联水凝胶具有很好的稳定性。

在本发明的另一方面，还提供了上述双硫键交联的生物相容高分子交联材料在医药领域中的应用。

本发明的双硫键交联的生物相容高分子交联材料在医学中的应用包括：可以用于促进伤口愈合，可用于皮肤或其它创伤的伤口敷料；也可用于防止粘连，包括外科手术(例如鼻窦炎手术)之后防止组织或器官之间的纤维性粘连；也可用作关节润滑剂用于关节炎增粘治疗等。

本发明所制备的双硫键交联的生物相容高分子交联材料在药学中的应用包括作为各种活性治疗物质的缓释载体，实现缓慢释放的性能。活性治疗物质可以是化学药物或生物学上的活性因子，包括消炎剂、抗生素、止痛药、麻醉剂、伤口愈合促进剂、细胞生长促进或抑制因子、免疫刺激剂、抗病毒药物等等。

附图说明

图1是本发明实施例12的实验结果示意图(即左后足的重量分布图)。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1透明质酸巯基化衍生物的制备及表征

按照Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中公开的方法制备。透明质酸20克溶解于2升蒸馏水，加入11.9克二硫代二丙二酰肼，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，按照表1分别加入一定量的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。加入1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液到pH 7.0终止反应。然后加入100克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌。调解溶液的pH值为8.5。室温电磁搅拌反应24小时。此后，在上述溶液中加入1摩尔/升的盐酸直至约pH 3.0。上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用大量0.001摩尔/升的盐酸和0.2摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用大量的0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液。最后收集透析管内的溶液，直接使用制备的溶液或冷冻干燥得到白色絮状固体。

采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测巯基含量并计算巯基化改性度，或者采用氢谱核磁共振检测(¹H-NMR)(D₂O为溶剂)测定巯基化改性度(以透明质酸的乙酰基的特征甲基吸收峰为内标)。巯基化改性度是指引入巯基的数量占透明质酸侧链羧基总数量的百分比，其结果如下：

表1.巯基化改性度

实施例2硫酸软骨素巯基化衍生物的制备及表征

硫酸软骨素(c型，来自鲨鱼软骨，Sigma，美国)1克溶解于100毫升蒸馏水中，得到澄清透明溶液。在上述溶液中加入0.6克二硫代二丙二酰肼，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，按照表2分别加入一定量的1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75，室温电磁搅拌反应2小时。然后加入10克二硫苏糖醇(DiagnosticChemical Limited，美国)和少量0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌。同时不断加入0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液使溶液的pH值保持在8.5，室温电磁搅拌反应4小时。此后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至约pH 3.0。上述溶液装入透析管(截除分子量2000，Sigma，美国)，用2升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用2升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液。最后透析管内的溶液，直接使用制备的溶液或冷冻干燥得到絮状固体。

采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测巯基含量并计算巯基化改性度，或者采用氢谱核磁共振检测(¹H-NMR)(D₂O为溶剂)测定巯基化改性度(以硫酸软骨素的乙酰基的特征甲基吸收峰为内标)。巯基化改性度是指引入巯基的数量占硫酸软骨素侧链羧基总数量的百分比，其结果如下：

表2.巯基化改性度

实施例3透明质酸巯基化衍生物的制备及表征

透明质酸10克溶解于1升蒸馏水，按照表3所列数量分别加入N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(Sulfo-NHS)、胱胺二盐酸盐(CYS)和1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，搅拌溶解，溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.5～6.5，电磁搅拌反应一定时间。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.5～6.5。加入1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液到pH 8.5终止反应。然后加入50克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和适量1.0摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌。调解溶液的pH值为8.5。室温电磁搅拌反应24小时。此后，在上述溶液中加入1摩尔/升的盐酸直至约pH 3.0。上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用大量0.001摩尔/升的盐酸和0.5摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用大量的0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液。最后收集透析管内的溶液，直接使用制备的溶液或者冷冻干燥得到白色絮状固体。

采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测巯基含量并计算巯基化改性度，或者采用氢谱核磁共振检测(¹H-NMR)(D₂O为溶剂)测定巯基化改性度(以透明质酸的乙酰基的特征甲基吸收峰为内标)。巯基化改性度是指引入巯基的数量占透明质酸侧链羧基总数量的百分比，其结果如下：

表3.巯基化改性度

实施例4双硫键交联的透明质酸交联水凝胶的制备

实施例1所制备的2种透明质酸巯基化衍生物(巯基化改性度分别为2.33％和4.18％，表1中编号4、6)分别配制成10、15和20mg/ml溶液，调节溶液的pH值为7.4。上述溶液2毫升转移至10毫升玻璃瓶后密封，室温静置保存1周，溶液失去流动性并形成交联水凝胶，水凝胶的含水量(g/ml)分别为99％、98.5％和98％。

实施例5双硫键交联的硫酸软骨素交联水凝胶的制备

实施例2所制备的硫酸软骨素巯基化衍生物(巯基化改性度为4.50％，表2中编号5)分别配制成50和80mg/ml溶液，调节溶液的pH值为7.4。上述溶液2毫升转移至10毫升玻璃瓶后密封，室温静置保存1周，溶液失去流动性并形成交联水凝胶，水凝胶的含水量(g/ml)分别为95％和92％。

实施例6双硫键交联的透明质酸交联水凝胶的制备

实施例3所制备的4种透明质酸巯基化衍生物(巯基化改性度为1.28％、1.54％、2.14％、3.97％，表3中编号3、7、8、9)分别配制成5、7.5和10mg/ml溶液，调节溶液的pH值为7.4。上述溶液2毫升转移至10毫升玻璃瓶后密封，室温静置保存10天，溶液失去流动性并形成交联水凝胶，水凝胶的含水量(g/ml)分别为99.5％、99.25％和99％。

实施例7双硫键交联的透明质酸交联水凝胶的制备

实施例3所制备的透明质酸巯基化衍生物(巯基化改性度为2.14％，表3中编号7)配制成10mg/ml溶液，然后按照体积比2∶1分别加入透明质酸溶液(5mg/ml)和硫酸软骨素溶液(10mg/ml)，调节溶液的pH值为7.4。上述溶液2毫升转移至10毫升玻璃瓶后密封，室温静置保存10天，溶液失去流动性并形成交联水凝胶。

实施例8双硫键交联的透明质酸交联水凝胶的动力粘度测定

采用旋转粘度计，在剪切速率不小于0.25Hz、25±0.1℃条件下。按照《中华人民共和国药典》(2005年版)二部附录VI G第二法测定，测定实施例6所制备的双硫键交联的透明质酸交联水凝胶的动力粘度，其结果见表4。交联水凝胶的动力粘度比相应未改性透明质酸溶液提高了408-547倍。

表4.动力粘度(mPa·s)

实施例9双硫键交联的透明质酸交联水凝胶的制备及稳定性测试

水凝胶1：实施例3所制备的透明质酸巯基化衍生物(巯基化改性度为13.5％，表3中编号1)分别配制成10mg/ml溶液，调节溶液的pH值为7.4。上述溶液2毫升转移至10毫升玻璃瓶后密封，室温静置保存10天，溶液失去流动性并形成交联水凝胶。

水凝胶2：实施例6所制备的水凝胶(采用实施例3所制备的透明质酸巯基化衍生物，透明质酸浓度10mg/ml，巯基化改性度1.54％，表3中编号3)。

可见，水凝胶2的原料的巯基化改性度(即1.54％)要明显低于水凝胶1的原料的巯基化改性度(即13.5％)，即水凝胶2的交联度就明显低于水凝胶1的交联度。

稳定性测试：依据中国药典2010版第二部XIX C原料药与药物制剂稳定性试验指导原则对水凝胶进行稳定性加速试验，试验条件为温度40±2℃的下放置6个月，在试验期间第0、1、2、3和6个月末，取样对水凝胶动力粘度和收缩率(％)进行测定，其结果列于表5。对于高交联度的水凝胶1，随着稳定性加速试验的增加，动力粘度急剧下降，并且凝胶的体积不断收缩，在1、2、3和6个月，凝胶体积的收缩率分别为10.2、35.1、39.2和41.4％，大量水从凝胶中被挤出。对于本发明的低交联度的水凝胶2，则保持了很好的稳定。

表5.稳定性测试结果

实施例10双硫键交联的透明质酸交联水凝胶防止鼻窦炎术后鼻窦口的再狭窄化

10只雄性巴斯德灭菌的新西兰白兔，体重3.5-4.0公斤，肌肉注射氯胺酮(35毫克/公斤)及甲苯唑嗪(5毫克/公斤)麻醉，剥离鼻外背面，碘酒消毒，然后以3毫升1％利多卡因与1∶100000肾上腺素混合液麻醉。无菌条件下，沿中线做2.5毫米垂直切口，将覆盖于上颌窦的软组织及骨膜提起分离。用外科电钻打开上颌窦前壁，以4毫米球面切割钻将上颌窦中壁与鼻腔打通，从而形成一个直径4毫米边缘无黏膜的圆周形孔道。在5只兔子的孔道两侧中均填入实施例6所制备的水凝胶(透明质酸浓度10mg/ml，巯基化改性度1.54％)(治疗组)，在5只兔子的孔道两侧中均不作填充(对照组)。然后将骨膜以可吸收缝线间断缝合，然后将皮肤以可吸收缝线缝合封闭上颌窦。不做其他包扎。术后给予动物正常饮食饮水。

术后两周，处死兔子。处死后将愈合的伤口切开，暴露窦腔。窦腔内的残留物用吸引器一边冲水一边轻轻吸出，用30度鼻内窥镜检查鼻窦内侧壁并进行摄像。每个孔径均用毫米刻度的尺子进行测量。双盲法完成对孔径的观察及测量。治疗组的鼻窦口直径为2.78±1.17毫米，对照组的鼻窦口直径为0.7±0.52。

鼻窦口的再狭窄化是鼻窦炎临床手术的一个重要难题，会影响手术疗效，甚至导致鼻窦炎复发。上述结果表明本发明的低交联度的双硫键交联的透明质酸交联水凝胶可以非常显著地防止鼻窦口的狭窄化，有望在临床上得到广泛的应用。

实施例11双硫键交联的透明质酸交联水凝胶在术后粘连防治中的应用。

采用Hemadeh等(Surgery 114：907-10，1993)和Yetkin等(Int J Surg 7：561-65，2009)报道的大鼠盲肠模型。其过程简述如下：32个大鼠共分为3组，其盲肠的浆膜用无菌纱布刮去浆膜光泽直至表面出血，然后一滴无水乙醇滴至出血表面进一步引发粘连；第一组为空白对照，不做任何治疗；第二组采用1ml市售透明质酸溶液(10mg/ml)进行治疗；第三组采用实施例6所制备的水凝胶(透明质酸浓度10mg/ml，巯基化改性度1.54％)进行治疗；最后缝合大鼠体表伤口，两周后处死大鼠，解剖观察粘连状况。

采用Yetkin等的粘连评价系统进行粘连评价(Int J Surg 2009；7：561-65)，其结果如表6所示。空白对照组(第一组)产生了严重的粘连，市售透明质酸治疗组(第二组)存在一定程度粘连，本发明的双硫键交联的透明质酸交联水凝胶(第三组)具有最好的粘连防治效果。

表6.粘连评分

实施例12双硫键交联的透明质酸交联水凝胶在关节炎增粘治疗中的应用。

采用Mihara等(Osteoarthritis and Cartilage 15：543-549，2007)报道的兔子关节炎模型，简述如下：肌肉注射氯胺酮(35毫克/公斤)及甲苯唑嗪(5毫克/公斤)进行麻醉，兔子的左膝关节在膝盖骨的侧面切开2cm的切口，然后切断暴露的外侧副韧带；切开腘肌肌腱的末端，露出外侧半月板，然后外侧半月板正中切除3.0-4.0mm；缝合皮下肌肉层和皮肤层，腿部肌肉注射约0.2ml氨苄西林。

半月板部分切除术后的兔子分为三组：第一组为生理盐水对照组，分别在术后0、3、6、9、12天在关节内注射0.2ml生理盐水(共5次注射)；第二组为透明质酸治疗组，分别在术后0、3、6、9、12天在关节内注射0.2ml市售透明质酸溶液(10mg/ml)进行治疗(共5次注射)；第三组为本发明的双硫键交联的透明质酸交联水凝胶治疗组，在术后第0天关节内注射一次实施例6所制备的水凝胶(透明质酸浓度10mg/ml，巯基化改性度1.54％)(共1次注射)。术后第0、2、5、8、11和14天对术后关节进行疼痛指数测定，疼痛指数通过测定左后足的重量分布来表征(Mihara等，Osteoarthritis and Cartilage 15：543-549，2007)；术后15天处死兔子，对术后关节的损伤情况进行外观和组织学评价。

对手术关节的损伤情况进行外观和组织学评价结果表明，本发明的双硫键交联的透明质酸交联水凝胶对术后关节的保护作用与透明质酸治疗组相当，但显著优于生理盐水对照组。左后足的重量分布结果表明在术后8、11和14天，本发明的双硫键交联的透明质酸交联水凝胶治疗组(第三组)显著优于生理盐水对照组(第一组)(p＜0.05)；在所有术后观察时间点，透明质酸治疗组(第二组)与生理盐水对照组(第一组)的效果没有统计显著差异(p＞0.05)，同时本发明的双硫键交联的透明质酸交联水凝胶治疗组(第三组)与透明质酸治疗组(第二组)的效果没有统计显著差异(p＞0.05)(见图1)。

上述结果表明，本发明的双硫键交联的透明质酸交联水凝胶在关节炎增粘治疗中有显著效果，一次关节注射的疗效与未交联透明质酸五次关节注射的疗效相当。

实施例13含有药物的双硫键交联的透明质酸交联水凝胶的制备和表征

在实施例6的双硫键交联的透明质酸交联水凝胶的制备过程中(透明质酸浓度10mg/ml，巯基化改性度3.97％)，分别加入0.1～10毫克皮质激素(例如，倍氯米松Beclomethasone、倍氯美松双丙酸酯Beclomethasone dipropionate、布地奈德Budesonide、地塞米松Dexamethasone、泼尼松龙Prednisolone、泼尼松Prednisone等)，皮质激素均匀分散在所制备的交联水凝胶中。

上述含药物的交联水凝胶0.2毫升放入15毫升塑料离心管，加入10毫升磷酸盐缓冲溶液，放入摇床(37℃，100转/分钟)，间隔一定的时间测定上清液中药物的紫外吸收。测定波长如下：倍氯米松Beclomethasone 246nm、倍氯美松双丙酸酯Beclomethasone dipropionate 240nm、布地奈德Budesonide 248nm、地塞米松Dexamethasone 242nm、泼尼松龙Prednisolone 248nm、泼尼松Prednisone 244nm。

表7.药物在不同时间点的累积释放百分比

从上述表7的结果可以看出，双硫键交联的透明质酸交联水凝胶是一种很好的药物缓释载体，对6种皮质激素均具有较好的缓释效果。根据药物疏水性的差异，药物从水凝胶中释放的行为有很大的不同。药物疏水性越强，释放越为缓慢。例如对于相对较为亲水的泼尼松龙Prednisolone，7天内已基本释放完毕；而对于疏水性很强的倍氯美松双丙酸酯Beclomethasone dipropionate，几乎检测不到释放。