铁皮石斛的杂交育种方法

摘要

铁皮石斛的杂交育种方法，本方法包括铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)母株人工授粉、无菌播种、壮苗培养和试管苗移栽各步骤。当铁皮石斛杂交种人工授粉后，将得到的杂交果实消毒杀菌后切开，用种子萌发培养基培养，使种子萌发成原球茎并进一步形成小苗，再将无菌播种获得的小苗接种到专门配制的壮苗培养基上进行壮苗培养，最后进行试管苗移栽。本发明采用独特的培养基，铁皮石斛杂交种子的萌发率高、成苗快、种苗品质好，具有操作性强，应用价值高等优点，为铁皮石斛杂交育种及其种苗繁殖开辟了一条新的途径。

说明书

技术领域

本发明涉及一种珍稀药用植物种苗繁殖方法，具体地说，涉及一种铁皮 石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)的杂交育种和种苗繁殖方法。

背景技术

铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)又叫黑节草、铁皮兰 等，为兰科多年生附生草本植物，主要分布于秦岭和长江流域以南地区，并 且主要集中在山区中的树荫下或石缝中。铁皮石斛是我国常用的名贵中药， 具有独特的药用价值，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功效。现代药 理研究表明，铁皮石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强人体免疫力及扩张血管 的作用。但由于人们对铁皮石斛的过度采挖而使野生资源枯竭，现铁皮石斛 已成为国家重点保护的药材品种之一。

由于铁皮石斛分布范围较广，并且各个分布区中又相对比较集中，加上 铁皮石斛主要以无性方式进行繁殖，造成铁皮石斛在种内形成了许多地域性 种群。加强不同种群之间的优势互补，实现杂交优势技术在铁皮石斛中的应 用对解决缺乏优质铁皮石斛种苗的现状具有重要的理论与实践意义。

发明内容

本发明的目的在于提供出一种萌发率高、成苗快、种苗品质好的高效率 的铁皮石斛杂交育种的方法。

本发明人通过将选好的两种铁皮石斛杂交亲本进行人工授粉，得到的果实 在基本成熟而未开裂时在种子萌发培养基上进行无菌播种，种子萌发后再转 移到壮苗培养基上培养，形成的试管苗经过自然光照下炼苗后出瓶栽培，试 管苗移栽成活率达到95％以上，由于靠本发明人利用了培养基上培养出壮苗， 经长期摸索终于找到适合壮苗培养基作为发明点，从而实现了本发明的目的。

本发明的铁皮石斛杂交育种方法，其特征在于包括以下的步骤：

(1)人工授粉：选定用于杂交的两种铁皮石斛亲本，采集父本的花粉授 于母本的柱头上，两个亲本互为父、母本进行正反交；

(2)无菌播种：当铁皮石斛杂交种授粉后，在果实发育基本成熟而果实 未开裂时，将该果实作为外植体用70％-80％酒精消毒20-60秒后，用无菌水冲 洗2-5次后置于0.1％-0.2％的升汞中消毒15-30分钟，再用无菌水漂洗4-6次 后切开果实，用接种针将黄白色粉末状胚接种到种子萌发培养基上培养，所 述的种子萌发培养基每升含蛋白胨0.5-4g，椰子汁50-150ml，蔗糖15-30g， 琼脂3.5-5g，肌醇40-100mg，盐酸硫胺4.5-12mg，甘氨酸1.5-4.0mg， 烟酸1.0-2.5mg，D-泛酸钙0.9-2.5mg，抗坏血酸0.8-2.0mg，吡哆辛盐酸 0.4-1.5mg，生物素0.09-0.25mg，其余为MS培养基中的大量元素和微量元 素成分；

(3)壮苗培养：将无菌播种获得的小植株接种到壮苗培养基上培养，所 述的壮苗培养基每升含蛋白胨0.5-3g，水解酪蛋白0.1-0.5g，蔗糖15-30g， 琼脂3.5-5g，α-萘乙酸0.5-3.0mg，肌醇40-100mg，盐酸硫胺4.5-12mg， 甘氨酸1.5-4.0mg，烟酸1.0-2.5mg，D-泛酸钙0.9-2.5mg，抗坏血酸0.8-2.0 mg，吡哆辛盐酸0.4-1.5mg，生物素0.09-0.25mg，香蕉匀浆50-150g，胡 萝卜汁10-50g，苹果汁10-50g，马铃薯汁10-50g，其余为MS培养基中的 大量元素和微量元素成分；

(4)试管苗移栽：当小植株形成的植株长至4-6厘米时，将培养瓶转移 到自然光下炼苗7-14天，然后将其从组培瓶中取出，洗净根部的培养基，移 至水苔或泥炭和兰石按体积比1∶1的混合基质中栽培，得到种苗；

在上述(2)-(3)各步骤中所用的培养基均为PH5.4～5.8，培养温度 28～30℃，每天光照10～12小时，光照度1500～2000lx。

在上述人工授粉步骤中，如果选定用于杂交的两种铁皮石斛亲本同时开 花，可在花朵展开后3-5天内进行人工授粉，授粉选择在16:00～17:30进行， 授粉前先去除母本和父本的唇瓣，去除父本的药帽，将父本的花粉粒授于母 本的柱头窝内，两个亲本可互为父、母本进行正反交；

如果所选定的两个亲本不在同一时间开花时，则可以先开花的铁皮石斛亲 本为父本，后开花的铁皮石斛亲本为母本，先采集父本的花粉用密封消毒的 塑料管室温保存，铁皮石斛花粉保存时间可达1-3个月，当母本铁皮石斛开 花3-5天后，将有生命力的花粉授于母本的柱头窝内，花粉的生命力可采用 氯化三苯四氮唑染色法测定。

大部分铁皮石斛在授粉后110-150天杂交果实成熟，一般铁皮石斛杂交种 子最佳的萌发期是在果实发育基本成熟而果实未开裂时。

步骤(2)所述的果实成熟期为90～200天。

步骤(3)所述的小植株的高度为0.5-8cm。

本发明的特点是虽然国内早有关于铁皮石斛种苗生产的专利和文献报道， 但是却没有见到利用杂交育种技术来繁殖铁皮石斛种苗的。而本发明具有杂 交成功率高的特点，特别的是对一些花期不遇的优良铁皮石斛杂交亲本十分 有效。本发明采用独特的培养基，铁皮石斛杂交种子的萌发率高、成苗快、 种苗品质好。本发明具有操作性强，应用价值高等特点。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但不是对本发明的限制。

实施例一

本地产铁皮石斛和云南产铁皮石斛的杂交育种和种苗繁殖：

(1)人工授粉：本地产铁皮石斛和云南广南县产铁皮石斛两种铁皮石斛 于4月至6月同时开花，在花朵展开3天后于17:00进行人工授粉，授粉前 先去除母本和父本的唇瓣，去除父本的药帽，将父本的花粉粒授于母本的柱 头窝内，两个亲本互为父、母本进行正反交。授粉后要挂标签，标签上具有 父、母本名称、杂交日期和授粉人等信息。3个月时统计授粉的成功率，正反 交无差异，结实率均达85％以上；

(2)无菌播种：将授粉后120天的果实，先用75％酒精消毒20秒，再用 无菌水漂洗2次后于0.1％的升汞溶液中消毒15分钟，无菌水漂洗5次后切开 果实，用接种针将黄白色粉末状胚接种到种子萌发培养基上培养，消毒成功 率95％以上，12天后种子萌发，形成原球茎，80天时能形成完整的小植株。 种子萌发率85％以上，成苗率80％以上。种子萌发培养基每升含蛋白胨1.5g， 椰子汁100ml，蔗糖20g，琼脂4.5g，肌醇60mg，盐酸硫胺5.0mg，甘氨 酸2.0mg，烟酸1.0mg，D-泛酸钙1.2mg，抗坏血酸0.8mg，吡哆辛盐酸 0.5mg，生物素0.1mg，其余为MS培养基中的大量元素和微量元素成分；

(3)壮苗培养：将无菌播种获得的小苗接种到壮苗培养基上，70天时能 形成株高4～6cm，每丛有2～3个芽的健壮植株。所述的半苗培养基每升含 蛋白胨1.5g，水解酪蛋白0.3g，蔗糖20g，琼脂5g，α-萘乙酸1mg，肌 醇100mg，盐酸硫胺12mg，甘氨酸4.0mg，烟酸2.0mg，D-泛酸钙2.0mg， 抗坏血酸1.5mg，吡哆辛盐酸1.0mg，生物素0.2mg，香蕉匀浆100g，胡 萝卜汁15g，苹果汁15g，马铃薯汁30g，其余为MS培养基中的大量元素 和微量元素成分；

(4)移栽：当小苗形成的植株长至4-6厘米时，将培养瓶转移到自然光 下炼苗10天，然后将其从组培瓶中取出，洗净根部的培养基，移至泥炭和兰 石按体积比1∶1的混合基质中栽培，保持适当通风和足够的湿度，移栽成活 率均可达95％以上。

在上述(2)-(3)各步骤中所用的培养基均为PH5.4，培养温度28℃， 光照度2000lx，光照10小时/天。

实施例二：

本地产铁皮石斛和浙江雁荡产铁皮石斛的杂交育种和种苗繁殖：

(1)人工授粉：本地产铁皮石斛和浙江产铁皮石斛两种铁皮石斛于4月 中旬同时开花，在花朵展开5天后于17:30进行人工授粉，授粉前先去除母 本和父本的唇瓣，去除父本的药帽，将父本的花粉粒授于母本的柱头窝内， 两个亲本互为父、母本进行正反交。授粉后要挂标签，标签上具有父、母本 名称、杂交日期和授粉人等信息。3个月时统计授粉的成功率，正反交无差异， 结实率均达80％以上；

(2)无菌播种：将授粉后135天的果实，先用80％酒精消毒15秒，再用 无菌水漂洗4次后于0.2％的升汞溶液中消毒15分钟，无菌水漂洗6次后切开 果实，用接种针将黄白色粉末状胚接种到种子萌发培养基上培养，消毒成功 率90％以上，14天后种子萌发，形成原球茎，70天时能形成完整的小植株。 种子萌发率90％以上，成苗率85％以上。种子萌发培养基每升含蛋白胨1g， 椰子汁80ml，蔗糖30g，琼脂5g，肌醇80mg，盐酸硫胺10mg，甘氨酸 4.0mg，烟酸2.0mg，D-泛酸钙2.0mg，抗坏血酸1mg，吡哆辛盐酸1mg， 生物素0.2mg，其余为MS培养基中的大量元素和微量元素成分；

(3)壮苗培养：将无菌播种获得的小苗接种到壮苗培养基上，85天时能 形成株高4～6cm，每丛有2～3个芽的健壮植株。所述的半苗培养基每升含 蛋白胨2.0g，水解酪蛋白0.4g，蔗糖15g，琼脂4g，α-萘乙酸2mg，肌 醇40mg，盐酸硫胺5mg，甘氨酸3.0mg，烟酸2.5mg，D-泛酸钙1.0mg， 抗坏血酸1.0mg，吡哆辛盐酸1.5mg，生物素0.25mg，香蕉匀浆80g，胡 萝卜汁30g，苹果汁30g，马铃薯汁30g，其余为MS培养基中的大量元素 和微量元素成分；

(4)试管苗移栽：当小苗形成的植株长至4-6厘米时，将培养瓶转移到 自然光下炼苗14天，然后将其从组培瓶中取出，洗净根部的培养基，移至水 苔和兰石按体积比1∶1的混合基质中栽培，保持适当通风和足够的湿度，移 栽成活率均可达90％以上。

在上述(2)-(3)各步骤中所用的培养基均为PH5.6，培养温度30℃， 光照度1500lx，光照12小时/天。

实施例3：云南产铁皮石斛和浙江产铁皮石斛的杂交育种和种苗繁殖：

(1)人工授粉：本实验采用的浙江产铁皮石斛在4月中旬开花，而云南 产铁皮石斛在5月中旬开花。在浙江产铁皮石斛开花时，取其花粉用密封消 毒的塑料管室温保存，1个月后，当云南产铁皮石斛开花时，采用氯化三苯四 氮唑染色法测定花粉生活力发现所有花粉均有活力，将其授于云南产铁皮石 斛的柱头上。授粉后要挂标签，标签上具有父、母本名称、杂交日期和授粉 人等信息。结实率均达85％以上；

(2)无菌播种：将授粉后150天的果实，先用70％酒精消毒60秒，再用 无菌水漂洗5次后于0.1％的升汞溶液中消毒30分钟，无菌水漂洗6次后切开 果实，用接种针将黄白色粉末状胚接种到种子萌发培养基上培养，消毒成功 率85％以上，10天后种子萌发，形成原球茎，75天时能形成完整的小植株。 种子萌发率80％以上，成苗率85％以上。种子萌发培养基每升含蛋白胨3g，椰 子汁60ml，蔗糖25g，琼脂4.5g，肌醇40mg，盐酸硫胺8mg，甘氨酸1.5 mg，烟酸2.0mg，D-泛酸钙1.0mg，抗坏血酸1mg，吡哆辛盐酸0.6mg， 生物素0.1mg，其余为MS培养基中的大量元素和微量元素成分；

(3)壮苗培养：将无菌播种获得的小苗接种到壮苗培养基上，80天时能 形成株高4～6cm，每丛有2～3个芽的健壮植株。所述的半苗培养基每升含 蛋白胨2.5g，水解酪蛋白0.2g，蔗糖30g，琼脂4.5g，α-萘乙酸3mg， 肌醇60mg，盐酸硫胺12mg，甘氨酸4.0mg，烟酸2.5mg，D-泛酸钙2.0mg， 抗坏血酸1.0mg，吡哆辛盐酸1.5mg，生物素0.20mg，香蕉匀浆60g，胡 萝卜汁40g，苹果汁40g，马铃薯汁30g，其余为MS培养基中的大量元素 和微量元素成分；

(4)试管苗移栽：当小苗形成的植株长至4-6厘米时，将培养瓶转移到 自然光下炼苗7天，然后将其从组培瓶中取出，洗净根部的培养基，移至水 苔和兰石按体积比1∶1的混合基质中栽培，保持适当通风和足够的湿度，移 栽成活率均可达95％以上。

在上述(2)-(3)各步骤中所用的培养基均为PH5.8，培养温度29℃， 光照度1800lx，光照11小时/天。