一种通过悬浮培养提高鞑靼荞麦不定芽分化率的方法

摘要

本发明公开了一种通过悬浮培养提高鞑靼荞麦不定芽分化率的方法，该方法在离体条件下建立了鞑靼荞麦的固体-液体-固体培养体系，诱导愈伤组织频率为100％，不定芽分化率为90.7％，生根率为100％。在人工调控下，8-10周可获得再生植株。本发明方法简单易行，效率高，可以减轻鞑靼荞麦愈伤组织褐化程度，促进不定芽的分化，缩短培养时间，为提高鞑靼荞麦的离体高频再生体系建立重要的技术基础。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种通过悬浮培养提高鞑靼荞麦不定芽分 化的方法。

背景技术

荞麦是蓼科(Polygonaceae)、荞麦属(Fagopyrum Mill)双子叶禾谷类作物，主要栽 培种有甜荞(F.esculentum Moench，也称普通荞麦)和苦荞(F.tartaricum(L.)Gaerth， 也称鞑靼荞麦)。荞麦是惟一含有芦丁的粮食作物，被逐渐发现利用研究，营养丰富，对中 老年人的减肥、延年益寿和增加儿童智力发育可起到良好的作用，并对肺病、肝脏病、糖尿 病、痢疾等疾病有明显的治疗作用，并且含有多种维生素和矿物质。我国劳动人民很早就认 识到鞑靼荞麦的药用价值，在唐初著名医学家孙思邈的巨著《备急千金要方》中就有：“荞麦 味酸、微寒、无毒”的记载。在我国的医学名著《草本纲目》中对鞑靼荞麦的作用有如下记 载：“苦荞麦性味苦、平、寒，有益气力、缓精神、利耳目、降气、宽肠、健胃的作用”。世 界各国的科学家从不同角度对这唯一药食同源的植物进行各方面研究。

芦丁即维生素P，主要生理功能是强化血管，增加毛细血管壁通透性，降低血管脆性，促 进细胞增生和防止血细胞的凝结。芦丁能够降低血脂和胆固醇，对高血压和心血管疾病有较 好的预防和治疗作用，并有控制和治疗糖尿病、防止癌变、抗感染、抗过敏、利尿、镇咳、 平滑松弛肌肉等方面的功效，在食品和医药工业上有着广泛的用途。鞑靼荞麦的芦丁含量比 甜荞高13.5倍，维生素B2高3.16倍。所以对于鞑靼荞麦的研究显得尤为重要。

由于鞑靼荞麦具有显著的研究价值，目前研究重点主要在植物遗传操作，基因转化等方 面，但是鞑靼荞麦的组织培养技术却一直停滞不前，主要由于鞑靼荞麦分化难，愈伤组织易 褐化，培养时间长等因素造成。这些不利因素使鞑靼荞麦研究严重滞后，所以，通过促进不 定芽的分化率，从而建立稳定的植物高频再生体系，对于鞑靼荞麦的深入研究具有积极作用。 目前，鞑靼荞麦(F.tartaricum(L.)Gaerth)组织培养已有少量报道，李占旗和吴崇明等 人通过下胚轴和子叶获得了鞑靼荞麦(F.tartaricum(L.)Gaerth)的再生植株(西北植物 学报，2006；应用与环境生物学报，2009)，而通过对愈伤组织进行悬浮培养促进鞑靼荞麦 不定芽分化的研究国内外未有报道。

发明内容

本发明目的在于，提供一种通过悬浮培养提高鞑靼荞麦不定芽分化率的方法，为鞑靼荞 麦规模化快繁和遗传操作研究奠定基础。该方法以鞑靼荞麦7天龄无菌苗下胚轴为外植体，建 立固体诱导愈伤-液体诱导分化-固体促进生根的体系，同时调节诱导各阶段的光照强度，可 以防止鞑靼荞麦愈伤组织的褐化，并且极大的促进芽的分化。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案得以实现：

一种通过悬浮培养提高鞑靼荞麦不定芽分化率的方法，其特征在于，按以下步骤进行：

(1)外植体的获得

将成熟的鞑靼荞麦种子在水中浸泡10分钟后去皮，将剥好皮的种子在质量分数为70％的 酒精中表面消毒1min，再在浓度0.1％的升汞中灭菌15min，最后用无菌水漂洗四次；

灭菌后的种子接种到不含蔗糖的1/2MS(Murashige-Skoog)固体培养基上，在温度为25 ℃±2℃和光强为2000lx条件下萌发。

(2)愈伤组织的诱导

将萌发7天龄的苦荞无菌苗下胚轴剪为0.5cm长的小段，接种在诱导愈伤组织培养基上， 在温度为25℃±2℃、光照培养条件为500-2000Lx的条件下培养15天；所述的诱导愈伤组织培 养基的组成为：在常规的MS培养基中加入质量浓度为0.8％的琼脂，质量浓度为3％的蔗糖， 1-2mg/L的2，4-D，0.1-1mg/L的6-BA，10mg/L的AgNO₃；

(3)不定芽的诱导

将诱导的愈伤组织转移到液体MS分化培养液上，20rpm，在温度为25℃±2℃、光照强度 为1000-2500Lx条件下，每天光照16h，进行诱导苗的分化；所述的液体MS分化培养液的组 成为：在常规的MS培养基中加入0.5-2mg/L的NAA，1-2mg/L的6-BA，0.1-1mg/L的TDZ， 5mg/L的AgNO₃，0.1-0.3mg/L的水解酪蛋白，接种密度为40g/L，250ml三角瓶含有60ml液 体MS分化培养液(将只有愈伤组织的中下部浸于液体MS分化培养液中)；待2-3周愈伤组织 出现芽点后，将带有芽点的愈伤组织从液体MS分化培养基中取出，转入固体MS分化培养基 中继续培养；(MS固体分化培养基成分与MS液体分化培养基成分相同，琼脂质量浓度为0.8％)；

(4)苗的生根

待不定芽长至2-3cm，将诱导得到的不定芽剪下，插入诱导生根培养基中进行培养，所 述的诱导生根培养基的组成为：在常规的MS培养基中加入1mg/L的NAA，培养温度为25℃± 2℃、光强为2000lx、每天光照16h，培养2-3周后即可获得大量组培苗。

采用本发明的方法，鞑靼荞麦不定芽分化率可高达90.7％。与传统固体培养相比，通过 利用固-液-固的生长体系和调节光照强度，极大的抑制了愈伤组织的褐化，促进愈伤组织生 长和提高不定芽分化率。

具体实施方式

以下结合发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。

在以下实施例中，所述的常规的MS培养基是目前使用最普遍的培养基，本领域的技术人 员均可获得，其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组 织的生长。其主要成分为：

大量元素：NH₄NO₃、KNO₃、CaC₁₂·2H₂O、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄；

微量元素：KI、H₃BO₃、MnSO₄·4H2₀、ZnSO₄·7H₂O、Na2MoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O；

铁盐：FeSO₄·7H2₀；Na₂-EDTA·2H₂O；

有机成分：肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素(维生素B1)、甘氨酸。

实施例1：

(1)外植体的获得

将成熟的鞑靼荞麦种子在水中浸泡10分钟后去皮，将剥好皮的种子在质量分数为70％的 酒精中表面消毒1min，再在质量浓度为0.1％的升汞中灭菌15min，最后用无菌水漂洗四次。

将灭菌后的种子接种到不含蔗糖的1/2MS(Murashige-Skoog)固体培养基上，在温度为 25℃±2℃和光强为2000Lx条件下萌发。

(2)愈伤组织的诱导

将萌发7天龄的苦荞无菌苗下胚轴剪为0.5cm长的小段，接种在诱导愈伤组织培养基上， 诱导愈伤组织培养基的组成为：在常规的MS培养基中加入质量浓度为0.8％的琼脂，质量浓度 为3％的蔗糖，2mg/L的2，4-D，0.5mg/L的6-BA，10mg/L的AgNO₃；在温度为25℃±2℃、500Lx， 培养15天。下胚轴两端迅速膨胀，诱导出愈伤组织，诱导率达100％，所诱导的愈伤组织绝大 多数为质地疏松的淡黄色或淡红色愈伤组织。

(3)不定芽的诱导

将诱导的愈伤组织转移到液体MS分化培养液上，接种密度为40g/L，250ml三角瓶含有60ml 的液体MS分化培养液(只有愈伤组织的中下部浸于液体MS分化培养液中)，20rpm，温度为25 ℃±2℃、2500Lx，每天光照16h的条件下诱导苗的分化。液体MS分化培养液的组成为：在常 规的液体MS培养液中加入0.5mg/L的NAA，2mg/L的6-BA，0.5mg/L的TDZ，5mg/L的AgNO₃，0.3mg/L 的水解酪蛋白。

2-3周后，愈伤组织出现绿色的芽点，并迅速长大，将带有0.5cm大小丛生芽的愈伤组织 从液体MS分化培养基中取出，转入固体MS分化培养基中继续培养，固体MS分化培养基主要成 分与液体MS分化培养液组成相同，琼脂0.8％。芽的分化率可达90.7％。

(4)苗的生根

待不定芽长至2-3cm，将诱导得到的不定芽剪下，插入MS+NAA 1.0mg/L的诱导生根培养 基中进行培养，温度为25℃±2℃、光强为2000lx、每天光照16h条件。生根率为100％。培 养2-3周后即可获得大量组培苗。

实施例2：

(1)外植体的获得

将成熟的鞑靼荞麦种子在水中浸泡10分钟后去皮，将剥好皮的种子在质量分数70％的酒 精中表面消毒1min，再在浓度0.1％的升汞中灭菌15min，最后用无菌水漂洗四次。

灭菌后的种子接种到无蔗糖的1/2MS(Murashige-Skoog)固体培养基上，在温度为25℃ ±2℃和光强为2000Lx条件下萌发。

(2)愈伤组织的诱导

将萌发7天龄的苦荞无菌苗下胚轴剪为0.5cm长的小段，接种在诱导愈伤组织培养基上， 诱导愈伤组织培养基的组成为：在常规的MS培养基中加入质量浓度为0.8％的琼脂，质量浓度 为3％的蔗糖，1mg/L的2，4-D，0.5mg/L的6-BA，10mg/L的AgNO₃；在温度为25℃±2℃、500Lx， 培养15天。下胚轴两端膨胀成哑铃形，诱导出愈伤组织，诱导率达89％，所诱导的愈伤组织大 多数为质地疏松的黄色或红色愈伤组织。

(3)不定芽的诱导

将诱导的愈伤组织转移到液体MS分化培养液中(只有愈伤组织的中下部浸于液体MS分化 培养液中)，20rpm，在温度为25℃±2℃、2500Lx，每天光照16h条件下诱导苗的分化，液体 MS分化培养液的组成为：在常规的液体MS培养基中加入0.5mg/L的NAA，1mg/L的6-BA，0.1mg/L 的TDZ，5mg/L的AgNO₃，0.1mg/L的水解酪蛋白。2-3周后，部分愈伤组织出现绿色的芽点，同 时愈伤组织上出现少量不定根。将带有0.5cm大小丛生芽的愈伤组织从液体培养基中取出，转 入固体分化培养基中继续培养(固体MS分化培养基的主要成分与液体MS分化培养液的组成相 同)。芽的分化率达55.7％。

(4)苗的生根

待不定芽长至2-3cm，将诱导得到的不定芽剪下，插入MS+NAA 1mg/L的诱导生根培养 基中进行培养，温度为25℃±2℃、光强为2000lx、每天光照16h条件。生根率为100％。培 养2-3周后即可获得组培苗。

实施例3：

(1)外植体的获得

将成熟的鞑靼荞麦种子在水中浸泡10分钟后去皮，将剥好皮的种子在质量分数70％的酒 精中表面消毒1min，再在浓度0.1％的升汞中灭菌15min，最后用无菌水漂洗四次。

灭菌后的种子接种到无蔗糖的1/2MS(Murashige-Skoog)固体培养基上，在温度为25℃ ±2℃和光强为2000Lx条件下萌发。

(2)愈伤组织的诱导

将萌发7天龄的苦荞无菌苗下胚轴剪为0.5cm长短，接种在诱导愈伤组织培养基上(诱导 愈伤组织培养基的组成与实施例1相同)。在温度为25℃±2℃、2000Lx，培养15天。下胚轴 两端膨胀成哑铃形，诱导出愈伤组织，诱导率达94.5％，所诱导的愈伤组织多数为质地疏松的 黄色或红色愈伤组织，少数为质地紧密的黄色或红色愈伤组织。

(3)不定芽的诱导

将诱导的愈伤组织转移到液体MS分化培养液上(液体MS分化培养液的组成与实施例1相 同，只有愈伤组织的中下部浸于液体MS分化培养液)，20rpm，温度为25℃±2℃、1000Lx， 每天光照16h条件下诱导苗的分化。2-3周后，部分愈伤组织出现绿色的芽点，同时愈伤组织 上出现少量不定根。将带有0.5cm大小丛生芽的愈伤组织从液体培养基中取出，转入MS固体分 化培养基中继续培养(MS固体分化培养基的主要成分与液体MS分化培养液的组成相同)，芽 的分化率达69.6％。

(4)苗的生根

待不定芽长至2-3cm，将诱导得到的不定芽剪下，插入MS+NAA 1mg/L的诱导生根培养 基中进行培养，温度为25℃±2℃、光强为2000lx、每天光照16h条件。生根率为100％。培 养2-3周后即可获得大量组培苗。