促进植物生长和发育的生物刺激剂

摘要

本发明涉及一种用于获得促进的植物生长的生物刺激剂组合物。该生物刺激剂组合物为发酵的培养液的形式，所述培养液含有细胞裂解物组分的混合物，所述细胞裂解物组分来自在先培养和裂解于所述培养液中的一株或多株细菌以及一株或多株酵母。所述生物刺激剂组合物可以进一步与其它农用化合物(例如尿素)组合，以适应所希望的应用的特定需要或要求。

说明书

相关申请

本申请要求享有2008年10月20日提交的新西兰专利申请No.572108 的权益，通过引用将其整体并入本文。

技术领域

本发明包括一种通过一种植物生物刺激剂组合物结合尿素和/或其它农 用化合物的施用以促进植物生长响应、减少氮的投入量和促进植物发育的方 法。本发明还包括一种将所述组合物与尿素和/或其它农用化合物结合的方 法。本发明进一步包括一种用于获得促进的植物生长的生物刺激剂组合物， 所述组合物可以与尿素和/或其它农用化合物组合或不组合。

背景技术

新西兰传统上依赖于苜蓿和其它豆科植物将种植牧草所需的氮进行生 物固定。近来，为进一步提高牧草的产量和解决饲料供应季节性短缺，氮肥 (如尿素)的使用有所增加。

氮肥的过度使用会带来许多负面环境影响。最常被宣传的是硝酸盐水平 增加的可能性，硝酸盐会渗入地下水中而污染水道。还涉及到与温室气体相 关的担忧。氮肥的大量使用会促进反硝化作用的水平，导致高水平的一氧化 二氮(一种有效的温室气体)的释放。此外，人工氮肥的生产是高度能源集 中的；所需能源来源于天然气的燃烧，这会导致另一种温室气体二氧化碳的 产生。这也代表了有限的天然气资源的一个主要用途，而有限的天然气资源 在其它方面(包括发电)的用途是越来越重要的。

氮肥的使用在稳定地增长。在新西兰，对于经济着重依赖于乳牛、羊和 肉牛养殖的乡村，总化肥的使用量在1968年到2002年间增加了113％ (Statistics New Zealand，Fertiliser use and the environment，August 2006(新西 兰统计局，化肥的使用与环境，2006年8月))。尿素的使用在2002年和2004 年间增加了大约27％(出处同上)。

氮肥使用的问题是通常给牧草施用了过量的氮。而且，如果使用氮的时 间不正确(例如，在植物生长不活跃的时期使用)，氮的损失就会更加严重。 目前，已经有多种减少肥料使用的不利影响的方法得到推行。这些方法的其 中之一是使用硝化作用抑制剂。

最常见的硝化作用抑制剂有2-氯-6(三氯甲基)吡啶 (2-chloro-6(trichloromethyl)pyridine)、双氰胺和3，4-二甲基吡唑磷酸盐 (3，4-dimethylpyrazole-phosphate)。这些抑制剂具有减少硝酸盐渗透和氮的 氧化物释放的功效。植物生长得到促进。然而，这种效果是不稳定的，并且 取决于施用的时期、氮肥施用的量以及物理因素如土壤温度、湿度和pH值。

脲酶抑制剂也被用于防止氮元素以氨气的形式挥发而流失到大气中去。 脲酶抑制剂通过减慢水解速度来发挥作用。农场管理实践中还有其它减少氮 流失的方法，包括施肥时期、分批的肥料施用、放牧的管理、牧草种类的选 择、作物类型和地形的改造。

然而，仍然需要新的产品和方法来促进植物生长和发育，同时减少氮的 投入量。

发明内容

本发明包括微生物生物刺激剂组合物，不管是单独使用还是与固体氮肥 一起使用，该组合物都可以提高牧草产量。作用方式包括促进氮的吸收和氨 基酸的合成。

本发明的一个目的是提供一种尿素用量低于50％的刺激植物生长的方 法，或者至少提供一种有效的刺激植物生长的其它方法的替代。

一方面，本发明包括一种促进植物生长的方法，所述方法通过生物刺激 剂组合物与尿素和/或其它农用化合物组合或不组合的施用来进行。该方法也 用于减少氮的投入量和促进植物发育。所述农用化合物可以为尿素、肥料、 叶面肥、除草剂、杀虫剂、杀真菌剂或矿物溶液。

另一方面，本发明包括一种用于促进植物生长的生物刺激剂组合物，所 述组合物可以与尿素和/或其它农用化合物组合使用也可以不组合使用。所述 组合物也可以用于减少氮的用量和促进植物生长。所述农用化合物可以为尿 素、化肥、除草剂、杀虫剂、杀真菌剂或叶面肥料或矿物溶液。

在一个特定的方面，本发明的所述生物刺激剂组合物含有发酵的培养 液，所述培养液含有一种或株或者多种或株的微生物，所述微生物培养在所 述发酵的培养液中，随后在所述发酵的培养液里处死或裂解以产生细胞组分 混合物(如裂解的发酵的培养液)。

在进一步的方面，本发明包括一种将本发明的生物刺激剂组合物与尿素 和/或其它农用化合物组合的方法。在一个特定的方面，所述方法包括将尿素 溶解于水中，再往溶液中加入所述生物刺激剂组合物。这样施用于植物，相 对于尿素的颗粒施用方式，可以获得更多的施用方式(如通过喷洒)。而且 还有利于增加叶面的吸收并且降低生物刺激剂组合物的植物硝酸盐水平。

在更进一步的方面，本发明包括一种制剂，所述制剂将本发明的生物刺 激剂组合物与尿素和/或其它农用化合物进行组合。所述制剂可以含有添加到 所述生物刺激剂组合物中的溶解尿素。该制剂可以适用于叶面施用(如叶面 喷雾或滴灌)。所述制剂可以用于促进植物生长。

附图说明

参照本发明的具体实施方式并且参照附图描述本发明。

图1：本发明中的生物刺激剂组合物(Donaghys40)对比相同 量的尿素(U40)及双倍量的尿素(U80)喷剂在23日的田间测试结果。

具体实施方式

本发明中的生物刺激剂通过一种或组合的微生物的发酵然后处死或裂 解而得到制备，所述微生物包括但不限于乳酸菌和酵母。根据本发明，可以 使用任何能进行发酵的微生物或微生物的组合。所述发酵可以涉及培养含有 用于微生物的碳水化合物及矿物质源的液态培养液。可以使用任何发酵培养 基，其中许多适用的培养基已为本领域众所周知。

适用于本发明的细菌包括但不限于植物乳杆菌(Lactobacillus  plantarum)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(也称为唾液链球菌 (Streptococcus salivarius))及费氏丙酸杆菌(Propionibacter freudenreichii)。 本发明包括乳杆菌属(Lactobaccillus)、链球菌属(Streptococcus)和丙酸杆 菌属(Propionibacter)的多个种。进一步举例来说，本发明包括嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、约氏乳 杆菌(Lactobacillus johnsonii)、小鼠乳杆菌、(Lactobacillus murinus)类植 物乳杆菌戊糖乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)(Lactobacillus  pentosus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、乳酸乳球菌(Lactococcus  lactis)、酒明串珠菌(Leuconostoc oenos)、两歧双歧杆菌(Bifidobacter bifidus)、 谢氏丙酸杆菌(Propionibacter shermani)、嗜泥丙酸杆菌(Propionibacter  pelophilus)和泥生丙酸杆菌(Propionivibrio limicola)。

适用于本发明的酵母包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces  cerevisiae)。本发明包括酵母属(Saccharomyces)的多个种。进一步举例来 说，本发明包括巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、布拉酵母 (Saccharomyces boulardii)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、狭小酵母 (Saccharomyces exiguous)、粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)、还有假 丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)、 梅奇酵母属(Metschnikowia)、伊萨酵母属(Issatchenkia)、克鲁维酵母属 (Kluyveromyces)和克勒克酵母属(Kloeckera)的种。

根据本发明，所述微生物产生一系列生长促进化合物，其中包括细胞分 裂素、甜菜碱、赤霉素以及抗氧化物。还有一系列的氨基酸、寡肽及微生物 裂解产生的细胞碎片。在特定的方面，所述微生物可以在培养基中培养至约 10⁴cfu/ml、约10⁵cfu/ml、约10⁶cfu/ml、约10⁷cfu/ml、约10⁸cfu/ml、约10⁹cfu/ml、约10¹⁰cfu/ml、约10¹¹cfu/ml、约10¹²cfu/ml、约10¹³cfu/ml、约10¹⁴cfu/ml、或在约10⁶至约10¹⁰cfu/ml、或约10⁷cfu/ml至约10⁹cfu/ml范围内 的浓度。

可以通过多种方式处死或裂解所述微生物，例如，冷冻、加热、研磨(bead  beating)、洗涤剂(包括非离子型及两性离子洗涤剂)、低pH值处理(包括 利用盐酸、氢氟酸及硫酸)、高pH值处理(通过氢氧化钠)。还包括酶裂解， 所述酶裂解包括但不限于一种或多种类型的纤维素酶、聚糖酶、溶菌酶、溶 葡球菌酶、甘露聚糖酶、变溶菌素(mutanolysin)、蛋白酶和消解酶。

还包括的方法为溶剂处理法，如先后用十二烷基硫酸钠及丙酮溶液处理 或进行超声处理。进一步包括的方法是先加压后迅速降压，例如通过压力喷 雾罐(pressure bomb)、细胞喷雾罐(cell bomb)或提供高剪切压力的处理 器如阀门式处理器(valve type processor)(包括但不限于弗氏压力细胞压碎 器(French pressure cell press)或转子-定子处理器(rotor-stator processors) 或固定几何流体处理器(fixed geometry fluid processors))实现。

本发明中的组合物及制剂可以通过多种方式施用于植物，其中包括喷、 洒、滴、蘸、浸、敷、涂和任何类型的灌溉系统。作为非限制性的实例，本 发明包括叶面喷洒、草皮喷洒、犁沟喷洒、蘸根、浸根、浸茎、浸种、浸块 茎、浸果实、滴土壤以及注入土壤。作为进一步的实例，所述组合物及制剂 可以以干燥的形式施用，如颗粒、微颗粒、粉末、小球、棒、薄片、晶体及 碎屑。

对于制剂，所述生物刺激剂组合物可以与尿素组合，例如，尿素的浓度 可以为约0.1kg/L、约0.12kg/L、约0.15kg/L、约0.18kg/L、约0.2kg/L、约 0.22kg/L、约0.25kg/L、约0.28kg/L、约0.3kg/L、约0.35kg/L、约0.38kg/L、 约0.4kg/L、约0.42kg/L、约0.45kg/L、约0.48kg/L、或约0.50kg/L、或在 约0.15kg/L至约0.25kg/L、或约0.18kg/L至约0.22kg/L、或约0.35kg/L 至约0.45kg/L、或约0.38kg/L至约0.42kg/L的范围内。

本发明中的组合物可以促进植物生长及植物的免疫系统。可以用于克服 植物的逆境阶段。需要特别指出的是，本发明中的生物刺激剂组合物可以用 于帮助植物获得更加高效的养分利用。本发明中的组合物作为生物生长促进 剂发挥作用，通过促进植物光合作用、细小营养根的无性繁殖和继而对养分 吸收的增加，来提高牧草产量。

所述生物刺激剂组合物可以在土壤温度有利于牧草或作物生长发育的 时期施用。所述组合物可以以稀释到至少十分之一的比例，并且通过喷洒或 灌溉来播撒的方式施用。所述生物刺激剂组合物可以用于促进牧草生长，也 可广泛用于其它作物。

本发明的组合物还含有一系列自然产生且平衡的生长促进因子。其重要 的前体是细胞分裂素(一种具有促进细胞分裂和生长功能的微生物和植物激 素)、甜菜碱(植物细胞用于抵抗渗透压、干旱、高盐或高温的物质)和寡 肽(促进通过细胞膜吸收养分的氨基酸组成的短链)。虽然植物可以自己合 成细胞分裂素，但当其处于逆境中时合成会受到抑制。

本发明的组合物的使用促进了氮的吸收。所述组合物显示出对毗邻于多 年生黑麦草的白苜蓿的生长的促进。由于白苜蓿具有极高的饲料价值和该植 物的根瘤可以进行固氮的重要性(以使更多的氮可被植物自身或其它牧草利 用)，这是有好处的。而且，本发明的组合物的使用减少了需要施用的尿素 的量。由于更高比例的氮会潜在地减少苜蓿的固氮率，而且还使得杂草的生 长超过苜蓿的生长，这有利于牧草中的苜蓿成分。

实施例

本文描述的实施例是基于阐释本发明的实施方案的目的。其它实施方 案、分析的方法和类型在分子诊断领域的普通技术人员的范围内并且不需要 对其详细描述。本领域范围内的其它实施方案被认为是本发明的一部分。

实施例1

发酵的培养液

用本领域的标准方法分离并培养了细菌(植物乳杆菌、嗜热链球菌、费 氏丙酸杆菌)及酵母(酿酒酵母)。培养液的基质使用添加以下成分的Diffco^TM乳杆菌MRS培养液(Diffco^TM Lactobacilli MRS Broth)制备。

表1.发酵的培养液的组成(每升培养液中的所有组分)

 Diffco^TM乳杆菌MRS培养液   55g  尿素   2g  胡萝卜汁   1.25mL  从甘蔗中提取的糖浆粉   2.5g

培养液通过不断搅拌下煮沸并维持1分钟来制备。这样可以保证所述培 养液基质、尿素和糖浆完全溶解。

然后将所述培养液置于高压灭菌器中进行灭菌(121℃，15分钟)，之后 倒入灭菌后的20L生物反应器中。等所述培养液冷却到35℃左右后，采用 本领域已知的标准无菌操作技术进行接种，以避免被其它微生物污染，往其 中加入三种细菌(每种菌至少形成10⁶个菌落形成单位或cfu)和一种酵母(至 少10⁴个cfu)的纯培养物。在35℃下进行12天的发酵，通过该阶段，每毫 升至少含有10⁸个cfu的优势种植物乳杆菌。

然后将发酵的培养液放在一个固定几何流体处理器中以进行微生物的 细胞裂解。为抵消因增压和减压而升高的温度，需要两次处理，并在处理之 间对培养液进行冷却。所述处理中的压力优化为小于或等于200MPa。

实施例2

用溶解尿素制备制剂

将尿素肥料颗粒以每197L体积水中加入40kg尿素的浓度溶解在水中。 通过搅拌帮助溶解，但无需加热。

尿素的溶解是一个吸热的过程，溶解所需时间取决于尿素的浓度、总体 积、水的初始温度以及搅拌方法。不断搅拌且水的初始温度为12℃时，上述 浓度及体积的尿素(来源于平衡农业-营养有限公司(Ballance Agri-nutrients  Limited)，新西兰陶兰加)完全溶解需要7分钟。生产尿素颗粒时加入的硬 化剂的种类和量可能会影响尿素在水中的溶解速度。

溶解的尿素溶液pH值为9.0左右。但发现多数氮是以有机形式存在的。 本领域公知的滴定分析测定表明，以100mL的溶液为基准，这些形式的氮 质量百分含量只有0.004％的铵态氮和0.002％硝态氮。

尿素完全溶解后，将实施例1准备好的裂解的发酵的培养液加入尿素溶 液中，每197L的尿素溶液中加入3L的发酵液。有机酸发酵产物的产生，使 得发酵液具有酸性的3.6的pH值，从而使得整个溶液pH接近中性，为6.2 左右。溶解尿素及相对较少的发酵液都对溶液的pH起到了低缓冲效果。

配制好的溶液待施用于牧草或适用作物。

实施例3

在牧草上使用所述制剂与溶解的尿素肥料的田间试验

简介：田间试验的目的在于验证将Donaghys(3L/ha)与40kg/ha 尿素(18kg N)组合施用增加牧草干物质(DM)的效果是否等同于仅施用 80kg/ha尿素(37kg N/ha)的水平。用Grass Master(GM)探针测量第一天(处 理前，基点值)及处理施行21天后牧草的DM。所述GM探针通过厂家提 供的预编程校准方程估测DM累积量。

方法：2007年12月，从新西兰中坎特伯雷地区挑选能够进行灌溉的乳 牛业畜牧场。选择一片刚放牧过的牧草覆盖均匀的围场以减少分区间的差 异。所述围场刚刚放牧过牲畜，处于重新生长期。在试验期内，将牲畜赶离 试验区。

包括4个处理且每个处理使用5个重复分区的完全随机的区组设计 (CRBD)。这样就形成了总共20个分区，并将20个分区分成5个区组。每 个区组中所有5种处理方式的重复都是随机指定的。

每个区组中，将处理通过随机数生成器随机分配于区组中。分区宽4m 长100m。喷杆宽4m。用60cm长的标志分别在分区的0处、一半处和全长 处做标记。

使用Grass Master探针来测定每个分区处理前的牧草干物质。沿分区长 度的一个方向每走两步测量一次，将探针随机置于脚落下的地方，但是至少 远离身体15cm以避免误读。这样测得每个分区的读数为50-65左右。读出 独立的读数并用录音机记录，然后听取并输入到Excel表格中进行分析。在 不知道分区作何处理的情况下进行每块分区的读数以消除偏差的风险。所述 探针设置成“缓慢”读数(即读数时大约需要3秒时间)。对于每次读数， 探针发出蜂鸣声前需保持稳定，将第一天测得的牧草覆盖平均值作为每个分 区生长开始的基线。

清洗喷淋罐并检查喷头。喷淋泵设置为30psi。用容器收集单位时间内 每个喷头喷出的水量，以校准喷淋装置，从而通过计时并保持适当速度(10 km/h)来确定喷洒设定量的水，等量地在每公顷土地上喷出200L。

对照：往喷淋罐中加入五十50升水。每个对照分区中，从距离分区边 缘1-2m的地方启动泵，并且运输车辆以一定的速度(10km/h左右)稳定行 驶。然后清空喷淋罐。

U40-(溶解尿素喷洒量为40kg N/ha)：往喷淋罐中加入20升水和10kg 尿素颗粒。搅拌水直至尿素完全溶解。然后往喷淋罐加满中水(加入大概 23L)，使得总体积为50L。再次检查喷头，以确定其运行无误且压力设置在 30psi。每个U40分区中，从距离分区边缘1-2m的地方启动泵，并且运输车 辆以一定的速度(10km/h左右)稳定行驶。然后清空喷淋罐并用水冲洗。

Donaghys40-(溶解尿素喷洒量为40kg N/ha并与3L被称为 Donaghys40的培养液一起喷洒)：往喷淋罐中加入20公水和10kg 尿素颗粒。搅拌水直至尿素完全溶解。往溶液中加入0.75L的发酵的培养液， 然后往喷淋罐中加满水(加入大概22.25L)，使得总体积为50L。再次检查 喷头，以确定其运行无误且压力设置在30psi。每个Donaghys40分 区中，从距离分区边缘1-2m的地方启动泵，并且运输车辆以一定的速度 (10km/h左右)稳定行驶。然后清空喷淋罐并用水冲洗。

U80-(溶解尿素喷在80公斤N/ha)：往喷淋罐中加入35升水和20kg尿素 颗粒。搅拌水直至尿素完全溶解，尿素溶解需要25分钟左右。然后往喷淋 罐加满中水(加入大概1L)，使得总体积为50L。再次检查喷头，以确定其 运行无误且压力设置在30psi。每个U80分区中，从距离分区边缘1-2m的地 方启动泵，并且运输车辆以一定的速度(10km/h左右)稳定行驶。然后清 空喷淋罐并用水冲洗。

处理后-牧草DM的测量：23天后用Grass Master探针对处理后的牧草 干物质进行测定，方法如处理前读数的部分所述。

统计分析：用Genstat软件对数据进行CRBD方差分析(ANOVA)。评 估不同处理的显著意义。

结果：三个放牧循环(grazing rotations)中的每个结束后的牧草干物质 测量值减去相应的牧草干重基点测量值可得到牧草生长。Donaghys40与尿素80的效果相近，与使用尿素40相比(与对照组相比的增加统计上 不显著)，这两种处理方式都可以使牧草生长得到统计上显著的增加。

表2：牧草干物质生产(kg/ha)

^a，b数字旁边的不同字母表示各自之间在统计上显著不同(p＜0.05)

上述说明书中提到的所有出版物和专利在此通过引用并入至本文。绝不 应该认为整个说明书中的出版物和专利的所有讨论是承认它们构成了现有 技术或本领域普遍知道的或公知的常识。

上述说明书的引用是作为具有其已知等同物的整体的，这些等同物在本 文的引入如同它们具有分别说明。虽然已经结合具体优选的实施方式描述了 本发明，但是应理解的是，要求保护的本发明不应该被过度限于这些具体的 实施方式。应理解的是，可以对如本文描述的本发明做出进一步的修改并不 偏离本发明的范围。在此示例性描述的本发明，在缺少在此没有特别说明是 必要的要素或限制的情况下，可以实施。

此外，在本文的每一种情形中，在本发明的实施方案或实施例中，术语 “含有”、“包括”等，应当被认为是无限制的开放式的。因而，除非上下文 很清楚，否则在其它地方，在整个说明书和权利要求中，词汇“含有”、“包 括”以及类似词汇应当被解释为包含的意义，而不是以排除性的或穷举性的 意义进行解释；也就是说以“包括但不限于”的意义进行解释。