鉴定长穗偃麦草E组染色体的RAPD-SCAR

摘要

本发明公开了一种鉴定长穗偃麦草E组染色体的RAPD-SCAR

说明书

技术领域

本发明属于长穗偃麦草E组染色体鉴定的技术领域，涉及一种鉴定长穗 偃麦草E组染色体的RAPD-SCAR₈₃₉标记及其应用。

背景技术

小麦是世界上重要的粮食作物之一。在中国它是仅次于水稻的第二大农 作物，小麦生产对国民经济发展有着十分重要的战略意义。由于小麦栽培品 种单一化，使其遗传基础日益狭窄，抗源匮乏，极大地限制了其产量和品质的进 一步改良。小麦的近缘物种中存在着大量的遗传变异，是小麦改良可以利用 的有益基因资源，将这些有益基因导入小麦一直是遗传学家和育种学家经久 不衰的研究课题。偃麦草属是小麦的一个近缘种属，它具有普通小麦缺少的 许多优良性状，如分蘖能力强，根系发达，抗寒、抗旱、耐瘠薄、耐盐碱力 强，多花、大穗、多实，籽粒蛋白含量高以及优良的烘烤品质，抗多种病害 能力强，对小麦条锈病、叶锈病、杆锈病、白粉病、黄矮病、条纹花叶病及 腥黑穗病高抗至免疫，是小麦遗传育种的重要亲本之一。长穗偃麦草 (Agropyron elongatum)是小麦的一个重要近缘种，具有蛋白质含量高、抗多种 真菌和病毒病害、耐旱、耐寒、大穗多花等优异性状，是在小麦品种改良中应 用最广泛的野生种之一。

在自然界，长穗偃麦草有二倍体、四倍体和十倍体3种倍性类型。其中二 倍体长穗偃麦草(Thinopyrum elongatum)E组染色体是组成偃麦草属(Elytrigia) 多倍体物种的基本染色体组，携带有对小麦遗传育种有益的基因，但对于四倍 体和十倍体类型的染色体组构成，一直没有一致的结论。通过远缘杂交及染 色体工程的方法从普通小麦野生近缘种属转移优良基因的方法已被实践证明 是一条卓有成效的途径。目前，国外从长穗偃麦草中成功转移了 Sr24(3DL)，Sr26(6AL)，Sr25(7DL，7AL)，Lr19，Lr24等基因。国内从小麦与长穗偃 麦草杂种后代中育成了小偃4号、5号、6号、小偃107等小麦品种。

通过杂交和渐渗的方式是将外源染色体的优良性状和优异基因导入小麦 的一种有效的方法，但是，在重组的小麦中，源于小麦-长穗偃麦草杂交后代 的外源E组染色质或染色体的检测成为至关重要的问题，虽然通过农学上的 重要特性以及生化分析已将有价值的基因绘图在长穗偃麦草染色体上，但这 些实验的检测手段是不稳定的，而且不适合进行重要的农学性状的检测。有 一些遗传学手段，如染色体分带、原位杂交等技术，已经将其用于小麦遗传 背景下外源遗传物质的检测，但这些技术费时、费力，对技术的要求也很高， 而且用这些实验手段进行大规模的后代快速筛选依然存在一定的局限。所以， 迫切要求开发一种可以在小麦遗传背景下快速、准确、大规模的鉴定长穗偃 麦草外源染色质或染色体的分子标记技术。

随着分子生物学的发展，DNA分子标记已经广泛应用于小麦遗传育种的 研究，限制片段长度多态性(RFLP)是首次被使用的分子标记，在植物遗传 研究中获得很大的应用价值，但是，RFLP技术需要大量纯化的DNA，而且 实验本身费时，对技术要求也很高，它不适合进行育种系统的大规模的筛选， 因此，育种学家已经开始进行普通PCR的研究，期望在小麦育种系统中找到 一种更简单的方式鉴定外源染色质，许多基于PCR的DNA分子标记技术已经 被开发，如RAPD，AFLP，EST，SSR等。在这些标记中，RAPD(Random  Amplified Polymorphic DNA)技术相对简单，而且它不需要知道有关序列方面 的信息，同时在指纹图谱和系统发生学研究领域的应用是高效的。但它的重 复性和稳定性却很差，如果将其转化为SCAR标记，其特异性和稳定性大幅 度提高，可以更方便快捷地应用于异源染色体的检测。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种鉴定长穗偃麦草E组染色体的 RAPD-SCAR₈₃₉标记及其应用，为快速、准确地鉴定小麦遗传背景下的外源 长穗偃麦草E组染色质或染色体奠定基础。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种鉴定长穗偃麦草E组染色体特异标记基因，其核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.2或SEQ.ID.NO.5所示。

一种扩增SEQ.ID.NO.2所示的标记的引物，其引物的核苷酸序列如 SEQ.ID.NO.1所示。

一种扩增SEQ.ID.NO.5所示的标记的引物对，其上、下游引物的核苷酸 序列分别如SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4所示。

SEQ.ID.NO.5所示的序列作为SCAR标记应用于小麦遗传背景下的长穗 偃麦草2E或3E染色体的鉴定或跟踪检测。

所述的应用是基于长穗偃麦草2E或3E染色体体系培育小麦品种的分子 标记辅助育种。

所述的应用是以SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4所示的上、下游引物对待 测基因组进行PCR扩增，然后根据扩增产物的电泳结果，对是否含有长穗偃 麦草2E或3E染色体进行判定。

所述的PCR扩增的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃ 退火30s，72℃延伸60s，30～35个循环；72℃延伸10min。

若扩增产物的电泳结果当中含有839bp的目标片段，则待测基因组中含 有长穗偃麦草2E或3E染色体；若扩增产物的电泳结果当中没有839bp的目 标片段，则待测基因组中没有长穗偃麦草2E或3E染色体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明采用RAPD分子标记技术对“中国春”小麦、二倍体长穗偃麦 草、四倍体长穗偃麦草三种材料进行长穗偃麦草E组染色体的多态性的分析， 筛选出长穗偃麦草E组染色体的RAPD特异片段，然后再将其转换为稳定的 SCAR标记；这样的SCAR标记具有了长穗偃麦草E组染色体的特异性，提 高了检测的准确性，非常有利于小麦遗传背景下的长穗偃麦草E组染色体的 鉴定和跟踪检测。与现有的鉴定方法相比，利用该SCAR标记进行鉴定则无 疑正确率要明显提升，而且是十分方便、快捷的。

2、本发明获得的SCAR标记称为SCAR₈₃₉，利用普通小麦“中国春”、“中 国春”-杀配子染色体2C二体附加系、二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草 材料进行了SCAR标记验证，在二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草中扩 增出了839bp的片段，而在普通小麦“中国春”、“中国春”-杀配子染色体2C 二体附加系中没有该产物，初步证明此标记可以用于长穗偃麦草E组染色体 的检测。

进一步用该对SCAR引物对“中国春”-杀配子染色体2C二体附加系与“中 国春”-长穗偃麦草3E二体附加系的杂种F₁代、F₂代进行了分析，结果在全 部F₁代以及部分F₂代材料中扩增出了目的片段，进一步证明了此SCAR₈₃₉标记可以用来检测小麦背景下的长穗偃麦草E组染色体，为小麦背景中长穗 偃麦草E组染色体的快速跟踪检测提供了新途径。

3、所用到的SCAR标记的检测，使用的PCR反应体系，不需要特殊的 PCR反应仪器和特殊的反应试剂，与其它普通PCR反应要求一样；只需要 在PCR扩增之后通过电泳检测，就可以根据电泳结果有无大小相同的目的条 带进行判定，操作简单方便。

4、本发明提供的长穗偃麦草E组染色体的标记，通过SCAR标记的检 测，为快速鉴定小麦遗传背景下的长穗偃麦草E组外源染色质或染色体奠定 了良好的基础，同时也为分子标记辅助育种提供了十分方便快捷的途径。

附图说明

图1为RAPD引物LW10在三种不同材料中的扩增结果，泳道1为普通 小麦“中国春”，泳道2为二倍体长穗偃麦草，泳道3为四倍体长穗偃麦草 (Marker：DL2000)；

图2为核苷酸序列SEQ.ID No.2(称为LW10)，在NCBI中进行Blast 搜索的结果；

图3为SCAR₈₃₉标记在四种不同材料中的扩增结果，泳道1为“中国春”， 泳道2为二倍体长穗偃麦草，泳道3为四倍体长穗偃麦草，泳道4为“中国 春”-杀配子染色体2C二体附加系(Marker：DL2000)；

图4为SCAR₈₃₉分子标记在“中国春”-长穗偃麦草1E～7E一套二体附加系 中的定位结果，泳道1为“中国春”-长穗偃麦草1E二体附加系，泳道2为“中 国春”-长穗偃麦草2E二体附加系，泳道3为“中国春”-长穗偃麦草3E二体附 加系，泳道4为“中国春”-长穗偃麦草4E二体附加系，泳道5为“中国春”“中 国春”-长穗偃麦草5E二体附加系，泳道6为“中国春”-长穗偃麦草6E二体附 加系，泳道7为“中国春”-长穗偃麦草7E二体附加系，泳道8为“中国春”， 泳道9为二倍体长穗偃麦草，泳道10为四倍体长穗偃麦草，泳道11为“中 国春”-杀配子染色体2C二体附加系(Marker：DL2000)；

图5为SCAR₈₃₉标记在“中国春”-长穗偃麦草3E二体附加系与“中国春”- 杀配子染色体2C二体附加系杂种后代F₁、F₂中的扩增结果，泳道1～9为“中 国春”-长穗偃麦草3E二体附加系与“中国春”-杀配子染色体2C二体附加系杂 交获得的F₁代材料，泳道10～19为F₁代自交获得的F₂代材料，泳道20为普 通小麦-“中国春”，泳道21为“中国春”-杀配子染色体2C二体附加系，泳道 22为二倍体长穗偃麦草，泳道23为四倍体长穗偃麦草(Marker：DL2000)。

具体实施方式

本发明提供一种鉴定长穗偃麦草E组染色体的RAPD-SCAR₈₃₉标记及其 应用，通过RAPD-SCAR法筛选获得特异性的RAPD片段，并转换为稳定的 SCAR标记，并对其扩增进行了检测。下面结合具体的实施例对标记的制备、 扩增和鉴定做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

所涉及的材料来源：

“中国春”小麦：来源于哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种重点实 验室，2010年4月将材料种于哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种重点 试验苗圃基地，2个月后提取DNA进行分子标记筛选试验。

二倍体长穗偃麦草：来源于日本国家生物资源计划小麦中心 (http://www.shigen.nig.ac.jp/-wheat/komugi/top.jsp)，2010年1月将材料种于 哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种温室，3个月后提取DNA，保存备 用。

四倍体长穗偃麦草：来源于中国农科院，2010年1月将材料种于哈尔滨 师范大学分子细胞遗传与遗传育种温室，3个月后提取DNA，保存备用。

“中国春”-杀配子染色体2C二体附加系：来源于日本国家生物资源计划 小麦中心(http://www.shigen.nig.ac.jp/-wheat/komugi/top.jsp)，2010年4月将 材料种于哈尔滨师范大学分子细胞遗传与遗传育种重点试验苗圃基地，2个 月后提取DNA进行分子标记筛选试验。

1、RAPD分子标记方法筛选特异性RAPD片段

利用RAPD分子标记方法，在普通小麦“中国春”、二倍体长穗偃麦草、 四倍体长穗偃麦草中进行多态性的筛选，获得特异性片段。

1.1采用CTAB法从新鲜的不同材料幼嫩叶片中分别提取基因组DNA， 并检测DNA浓度及质量；

1.2RAPD片段扩增

PCR反应体系：DNA模板30ng，10×PCR buffer 2.0μl，dNTP Mix(2.5mM) 1.5μl，RAPD引物(10μM)1μl，r Taq polymerase(5U/μl)0.2μl，灭菌超纯 水补足至20μl；

PCR反应程序：

在筛选的过程中，利用普通小麦“中国春”、二倍体长穗偃麦草、四倍体 长穗偃麦草三种材料对36条RAPD引物进行筛选，筛选的依据是在普通小 麦“中国春”与二倍体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草两种材料中存在多态性， 同时二倍体长穗偃麦草和四倍体长穗偃麦草两种材料又有同样大小的PCR 产物，且PCR产物的片段大小要大于500bp，重复性好，稳定且PCR产物 的条带要清晰。

从36条RAPD引物(由上海生工生物工程有限公司合成)中筛选出特 异引物LW10(SEQ.ID.NO.1所示)。

1.3取扩增产物各5μl，均在含有1mg/ml EB的1.2％琼脂糖中电泳检测， 在紫外成像系统(Gel Doc-2000，Bio-Rad，USA)下观察并照相记录结果。

1.4构建载体并转化

将琼脂糖电泳产物回收并纯化，然后将扩增的片段连接到pMD18-T载 体(明酶切位点为EcoR I，HindIII)，然后将连接后的载体转染JM109感受 态细胞，接种于含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB固体培养基平板上，0.1M IPTG 4μl和20mg/ml的X-gal 40μl诱导，37℃培养箱过夜培养；

挑取少量白斑菌落进行PCR扩增，同时将其在含有氨苄青霉素(50 μg/ml)的LB固体培养基平板上划线，扩大培养，37℃培养过夜；

1.5挑去扩大培养后的细菌，提取DNA，然后进行PCR扩增，所用引 物为通用引物即RV-M，M13-47(Kang，2005)，其扩增体系如下：

94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸60s，35 个循环；72℃延伸10min。

1.6将扩增的片段进行测序，其核苷酸序列如SEQ.ID.No.2所示，在NCBI 中将扩增的片段(称为LW10)进行Blast搜索，利用Primer Premier 5.0和 DNAMAN 5.0等软件进行序列比对及分析，结果显示，它与小麦染色体3B 特异BAC库中的1305个碱基具有84％的同源性，其分析结果如图2所示， 也可以将该片段称为长穗偃麦草E组染色体特异片段。

该片段是来源于长穗偃麦草E组染色体的特异片段，它可以筛选含有长 穗偃麦草E组染色体的后代，该片段要求在小麦遗传背景下具有低同源性， 其优势在于，它可以更加有效、准确地筛选小麦遗传背景下的含有长穗偃麦 草E组染色体的后代，可以使后代筛选的过程更加简便、易行、可靠。

2、将RAPD转化为SCAR标记

根据设计SCAR引物的要求：(1)引物长度范围18-26bp，通常是选择 20-22bp；(2)退火温度范围50～60℃，最好在52～58℃；(3)GC含量范围 40-55％；(4)产物片段大小400～800bp。

利用Primer Premier 5.0和DNAMAN 5.0等软件进行RAPD片段特异 SCAR引物设计，设计结果如下：

2C-F₈₃₉：GACGCAACAATAACCCTC    (SEQ.ID No.3所示)

2C-R₈₃₉：GTTTGCTTGACTGGCTTG    (SEQ.ID No.4所示)

以该引物对进行PCR扩增的反应体系和反应程序分别为：

PCR反应体系：DNA模板30ng，10×PCR buffer 2.0μl，dNTP Mix(2.5mM) 1.5μl，上游引物(10μM)1μl，下游引物(10μM)1μl，r Taq polymerase(5U/μl) 0.2μl，灭菌超纯水补足至20μl；

所述的PCR扩增的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃ 退火30s，72℃延伸60s，30～35个循环；72℃延伸10min。

所述PCR扩增产物片段大小为839bp，所以将其命名为SCAR₈₃₉，具体 的核苷酸序列如SEQ.ID No.5所示。

3、SCAR₈₃₉分子标记验证

3.1长穗偃麦草特异SCAR₈₃₉分子标记

提取普通小麦“中国春”、“中国春”-杀配子染色体2C二体附加系、二倍 体长穗偃麦草、四倍体长穗偃麦草材料的DNA，以其基因组为模板，采用 2C-F₈₃₉和2C-R₈₃₉作为引物对扩增，再将其扩增产物进行凝胶电泳，进行了 SCAR标记验证，具体的检测结果如图3所示：

在二倍体长穗偃麦草(泳道2)、四倍体长穗偃麦草(泳道3)中扩增出 了839bp的片段，而在普通小麦“中国春”(泳道1)、“中国春”-杀配子染色 体2C二体附加系(泳道4)中没有该目的条带，初步证明此标记可以用于长 穗偃麦草E组染色体的检测。

3.2长穗偃麦草特异SCAR₈₃₉分子标记定位

利用“中国春”-长穗偃麦草1E～7E一套二体附加系对SCAR₈₃₉分子标记 进行定位，分别以1E～7E二体附加系的基因组为模板，采用2C-F₈₃₉和2C-R₈₃₉作为引物对扩增，再将其扩增产物进行凝胶电泳，进行了SCAR标记定位， 具体的检测结果如图4所示：其中泳道9为阳性对照，可以看到该标记定位 于“中国春”-长穗偃麦草2E(泳道2)和3E(泳道3)的两个同祖群的染色体 上。

3.3长穗偃麦草特异SCAR₈₃₉分子标记应用

进一步利用SCAR₈₃₉分子标记对“中国春”-杀配子染色体2C二体附加系 与“中国春”-长穗偃麦草3E二体附加系的杂种F₁代、F₂代进行了分析，电泳 结果如图5所示：

作为阴性对照的“中国春”没有扩增出目的片段，阳性对照二倍体长穗偃 麦草扩增出目的片段，在全部F₁代(泳道1～9)以及部分F₂代材料(泳道 10～19)中扩增出了目的片段，该SCAR₈₃₉标记的检测结果与材料基因组的 特性相吻合，表现出检测的特异性；进一步证明了此SCAR₈₃₉标记可以用来 检测小麦背景下的长穗偃麦草E组染色体。

因此该SCAR标记就可应用于小麦遗传背景下的长穗偃麦草2E或3E染 色体鉴定或跟踪检测：

以SEQ.ID.NO.3、SEQ.ID.NO.4所示的上、下游引物对待测基因组进行 PCR扩增，然后根据扩增产物的电泳结果，对是否含有长穗偃麦草E组染色 体进行判定：若扩增产物的电泳结果当中含有839bp的目标片段，则待测基 因组中含有长穗偃麦草E组染色体，而且为2E或3E染色体；若扩增产物的 电泳结果当中没有839bp的目标片段，则待测基因组中没有长穗偃麦草2E 或3E染色体。

该SCAR标记也为快速鉴定小麦遗传背景下的长穗偃麦草2E或3E染色 质或染色体奠定了良好的基础，同时也为分子标记辅助育种提供了十分方便 快捷的途径：筛选标准即在普通小麦“中国春”背景下含有长穗偃麦草2E或 3E染色质或染色体的后代。