包含全长抗体和单链Fab片段的多特异性抗体

摘要

本发明涉及包含全长抗体和单链Fab片段的多特异性抗体，特别地双特异性抗体、生产其的方法、含有所述抗体的药物组合物，及其用途。

说明书

本发明涉及包含全长抗体和单链Fab片段的多特异性抗体，特别地双 特异性抗体、生产其的方法、含有所述抗体的药物组合物，及其用途。

发明背景

最近，已经研发了多种多特异性重组抗体格式，例如通过融合，例如， IgG抗体格式和单链区域的四价双特异性抗体(参见例如，Coloma，M.J.， 等，Nature Biotech 15(1997)159-163；WO 2001/077342；和Morrison， S.L.，Nature Biotech 25(2007)1233-1234)。

也已经研发了几种能结合两个或多个抗原的其他新格式，例如双、三 链或四链抗体、微型抗体、几种单链抗体(scFv，Bis-scFv)，其中不再保 留抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)(Holliger，P.，等，Nature  Biotech 23(2005)1126-1136；Fischer，N.，Lége，O.，Pathobiology 74 (2007)3-14；Shen，J.等，Journal of Immunological Methods 318(2007) 65-74；Wu，C.等，Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。

所有此类格式都使用接头，以将抗体核心(IgA、IgD、IgE、IgG或 IgM)与其他结合蛋白质(例如scFv)融合或者以融合例如两个Fab片段 或scFv(Fischer，N.，Léger，O.，Pathobiology 74(2007)3-14)。应当 注意，通过与天然存在的抗体保持高度的相似性，可以期望保留通过Fc 受体结合介导的效应子功能，例如如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体 依赖性细胞毒性(ADCC)。

在WO 2007/024715中报道了作为基因工程的多价和多特异性结合蛋 白质的双可变区免疫球蛋白。在US 6,897,044中报道了制备生物活性抗体 二聚体的方法。在US 7,129,330中报道了通过肽接头相互连接的具有至少 四个可变区的多价F_V抗体构建体。在US 2005/0079170中报道了二聚和多 聚抗原结合结构。在US 6,511,663中报道了包含通过连接结构共价地相互 结合的三个或四个Fab片段的三价或四价单特异性抗原结合蛋白质，所述 蛋白质不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中报道了可以在原核细 胞和真核细胞中有效表达的并可以用于治疗和诊断方法的四价双特异性抗 体。在US 2005/0163782中报道了在包含两种类型的多肽二聚体的混合物 中，从不通过至少一个链间二硫键连接的二聚体分离或者优选地合成通过 至少一个链间二硫键连接的二聚体的方法。在US 5,959,083中报道了双特 异性四价受体。在WO 2001/077342中报道了具有三个或多个功能性抗原 结合位点的工程化抗体。

在WO 1997/001580中报道了多特异性和多价抗原结合多肽。 WO 1992/004053报道了通过合成交联共价连接的，一般制备自与相同的 抗原决定簇结合的IgG型单克隆抗体的同型缀合物(homoconjugate)。 WO 1991/06305中报道了对抗原具有高亲和力的寡聚单克隆抗体，其中分 泌的寡聚体，一般为IgG型，具有结合在一起的两个或多个免疫球蛋白单 体，以形成四价或六价IgG分子。在US 6,350,860中报道了绵羊来源的抗 体和工程化抗体构建体，其可以用于治疗疾病，其中干扰素γ活性是致病 原因。在US 2005/0100543中报道了可靶向的构建体，其是双特异性抗体 的多价运载体，即，可以将每一分子的可靶向构建体用作为两个或多个双 特异性抗体的运载体。在WO 1995/009917中报道了基因工程改造的双特 异性四价抗体。在WO 2007/109254中报道了包含稳定化scFv或由稳定化 scFv组成的稳定化结合分子。

Müller，D.等，Handbook of Therapeutic antibodies，Part III，第2 章，(2008)345-378涉及双特异性抗体，例如涉及通过肽接头在重链的C 末端与两个scFv片段融合的全长抗体(也参见WO 1995/009917)。Hust， M.等，BMC Biotechnology(2007)7涉及单链Fab(scFab)片段。

然而，鉴于多特异性抗体的不同问题和方面(如例如，药物动力学的 和生物学的特性、稳定性、聚集性、表达产率)，存在另外备选的多特异性 抗体格式的需要。特别地，在WO 1995/009917和Müller，D.等，Handbook of Therapeutic antibodies，第III部分，第2章，(2008)345-378中报道的 基因工程改造的双特异性四价抗体显示出仅非常低的表达产率。

发明概述

本发明的第一方面是多特异性抗体，其包含

a)与第一抗原特异结合的并由两个抗体重链和两个抗体轻链组成的 全长抗体；和

b)与一个至四个另外的抗原特异结合的(优选地与一个另外的抗原特 异结合的)一个或多个单链Fab片段，

其中，b)项的所述单链Fab片段通过肽连接体在a)项的所述全长抗体 的重链或轻链的C或N末端与所述全长抗体融合。

本发明的优选方面是多特异性抗体，其包含

a)与第一抗原特异结合的并由两个抗体重链和两个抗体轻链组成的 全长抗体；和

b)与一个至四个另外的抗原特异结合的(优选地与一个另外的抗原特 异结合的)一个至四个单链Fab片段，

其中，b)项的所述单链Fab片段通过肽连接体在a)项的所述全长抗体 的重链或轻链的C或N末端与所述全长抗体融合。

优选地，所述多特异性抗体包含与第二抗原结合的一个或两个单链 Fab片段(双特异性抗体)。

优选地，所述多特异性抗体包含与第二抗原结合的两个单链Fab片段 (双特异性抗体)。

优选地，所述多特异性抗体包含与第二抗原和第三抗原结合的两个单 链Fab片段(三特异性抗体)。

本发明的另外方面是编码所述多特异性抗体的链的核酸分子，其中所 述单链Fab片段与所述全长抗体的重链或轻链的C或N末端融合。

本发明的另外方面是包含所述多特异性抗体的药物组合物。

根据本发明的多特异性抗体显示出有价值的特性，例如高稳定性、低 聚集倾向(参见例如实施例2(例如，与通过肽接头在重链的C末端与两 个scFv片段融合的全长抗体比较(参见WO 1995/009917或Müller，D. 等，Handbook of Therapeutic antibodies，第III部分，第2章，(2008) 345-378)))。在一个方面，由于根据本发明的多特异性抗体与不同抗原结 合，所以它们表现出新的特性，并且在另一方面，由于它们良好的稳定性、 低聚集性和有价值的药物动力学和生物学特性，它们适合用于生产药物制 剂。由于它们的Ig核心，以及可以在哺乳动物表达系统中产生的能力，它 们仍保留了天然抗体的特性如ADCC和CDC。

发明详述

本发明的第一方面是多特异性抗体，其包含

a)与第一抗原特异结合的并由两个抗体重链和两个抗体轻链组成的 全长抗体；和

b)与一个至四个另外的抗原特异结合的(优选地与一个另外的抗原特 异结合的)一个或多个单链Fab片段，

其中，b)项的所述单链Fab片段通过肽连接体在所述全长抗体的重链 或轻链的C或N末端与a)项的所述全长抗体融合。

本发明的优选方面是多特异性抗体，其包含

a)与第一抗原特异结合的并由两个抗体重链和两个抗体轻链组成的 全长抗体；和

b)与一个至四个另外的抗原特异结合的(优选地与一个另外的抗原特 异结合的)一个至四个单链Fab片段，

其中，b)项的所述单链Fab片段通过肽连接体在a)项的所述全长抗体 的重链或轻链的C或N末端与所述全长抗体融合。

在一个实施方案中，与第二抗原结合的一个或两个相同的单链Fab片 段通过肽连接体在所述全长抗体的重链或轻链的C末端与所述全长抗体融 合。

在一个实施方案中，与第二抗原结合的一个或两个相同的单链Fab片 段通过肽连接体在所述全长抗体的重链的C末端与所述全长抗体融合。

在一个实施方案中，与第二抗原结合的一个或两个相同的单链Fab片 段通过肽连接体在所述全长抗体的轻链的C末端与所述全长抗体融合。

在一个实施方案中，与第二抗原结合的两个相同的单链Fab片段通过 肽连接体在所述全长抗体的每一重链或轻链的C末端与所述全长抗体融 合。

在一个实施方案中，与第二抗原结合的两个相同的单链Fab片段通过 肽连接体在所述全长抗体的每一重链的C末端与所述全长抗体融合。

在一个实施方案中，与第二抗原结合的两个相同的单链Fab片段通过 肽连接体在所述全长抗体的每一轻链的C末端与所述全长抗体融合。

术语“全长抗体”指由两个“全长抗体重链”和两个“全长抗体轻链” 组成的抗体(参见图1)。“全长抗体重链”是以N末端至C末端方向由抗 体重链可变区(VH)、抗体重链恒定区1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗 体重链恒定区2(CH2)和抗体重链恒定区3(CH3)，缩写为 VH-CH1-HR-CH2-CH3；和任选地，在IgE抗体亚类的情况下，抗体重链 恒定区4(CH4)组成的多肽。优选地，“全长抗体重链”是以N末端至C 末端方向由VH、CH1、HR、CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链” 是以N末端至C末端方向由抗体轻链可变区(VL)和抗体轻链恒定区 (CL)，缩写为VL-CL组成的多肽。抗体轻链恒定区(CL)可以是κ (kappa)或λ(lambda)。通过CL区和CH1区之间和全长抗体重链的 铰链区之间的链间二硫键，将两个全长抗体链连接在一起。一般的全长抗 体的实例是天然抗体如IgG(例如IgG 1和IgG2)、IgM、IgA、IgD和IgE。 根据本发明的全长抗体可以来自单一的物种例如人类，或者它们是嵌合的 或人源化的抗体。根据本发明的全长抗体包含每一个都由VH和VL对形 成的两个抗原结合位点，其都与相同的抗原特异地结合。所述全长抗体的 重链或轻链的C末端指在所述重链或轻链的C末端的最后一个氨基酸。所 述全长抗体的重链或轻链的N末端指所述重链或轻链的N末端的最后一个 氨基酸。

“单链Fab片段”(参见图2)是由抗体重链可变区(VH)、抗体恒 定区1(CH1)、抗体轻链可变区(VL)、抗体轻链恒定区(CL)和接头 组成的多肽，其中所述抗体区和所述接头具有以N末端至C末端方向的以 下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c) VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；其中所述接头是至少 30个氨基酸，优选地32至50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段 a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头 -VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL，通过CL区和CH1区之间的天然 二硫键稳定。术语“N末端”指N末端的最后一个氨基酸。术语“C末端” 指C末端的最后一个氨基酸。

在优选的实施方案中，在所述单链Fab片段中，所述抗体区和所述接 头具有以N末端至C末端方向的以下顺序之一：

a)VH-CH1-接头-VL-CL，或b)VL-CL-接头-VH-CH1，更优选 VL-CL-接头-VH-CH1。

在另一优选的实施方案中，在所述单链Fab片段中，所述抗体区和所 述接头具有以N末端至C末端方向的以下顺序之一：

a)VH-CL-接头-VL-CH1或b)VL-CH1-接头-VH-CL。

任选地，在所述单链Fab片段中，除CL区和CH1区之间的天然二 硫键外，通过引入以下位置之间的二硫键，也通过二硫化物稳定抗体重链 可变区(VH)和抗体轻链可变区(VL)：

i)重链可变区位置44与轻链可变区位置100，

ii)重链可变区位置105与轻链可变区位置43，或

iii)重链可变区位置101与轻链可变区位置100(通常根据Kabat的 EU索引编号)。

通过在单链Fab片段的可变区VH和VL之间引入二硫键，实现单链 Fab片段的此类另外的二硫化物稳定(disulfide stabilization)。对单链Fv 引入用于稳定的非天然二硫键的方法描述于，例如WO 94/029350， Rajagopal，V.等，Prot.Engin.10(1997)1453-59；Kobayashi，H.等， Nuclear Medicine & Biology，第25卷(1998)387-393；或Schmidt，M. 等，Oncogene 18(1999)1711-1721中。在一个实施方案中，包含在根据 本发明的抗体中的在单链Fab片段的可变区之间的任选的二硫键在重链可 变区位置44和轻链可变区位置100之间。在一个实施方案中，包含在根据 本发明的抗体中的在单链Fab片段的可变区之间的任选的二硫键在重链可 变区位置105和轻链可变区位置43之间(通常根据Kabat的EU索引编 号)。

在一个实施方案中，优选的是在所述单链Fab片段的可变区VH和 VL之间没有所述任选的二硫化物稳定的单链Fab片段。

如本发明中所用，术语“肽连接体”指具有氨基酸序列的肽，其优选 地是合成来源的。根据本发明的这些肽连接体用于将单链Fab片段与全长 抗体的C或N末端融合以形成根据本发明的多特异性抗体。优选地，b) 项的所述肽连接体是具有至少5个氨基酸长度的，优选地具有5个至100 个，更优选地10个至50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方 案中，所述肽连接体是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸， 并且(x＝3，n＝3、4、5或6，和m＝0、1、2或3)或者(x＝4，n＝2、 3、4或5和m＝0、1、2或3)，优选地x＝4和n＝2或3，更优选地，其 中x＝4，n＝2。在一个实施方案中，所述肽连接体是(G₄S)₂。

如在本发明中所用，术语“接头”指具有氨基酸序列的肽，其优选地 是合成来源的。根据本发明的这些肽用于连接a)VH-CH1至VL-CL，b) VL-CL至VH-CH1，c)VH-CL至VL-CH1或d)VL-CH1至VH-CL以形 成根据本发明的以下单链Fab片段a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL- 接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL。在 单链Fab片段内的所述接头是具有至少30个氨基酸长度，优选地具有32 至50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述接头是 (GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸(x＝3，n＝8、9或10和m＝0、1、 2或3)或(x＝4和n＝6、7或8和m＝0、1、2或3)，优选地，其中x＝ 4，n＝6或7和m＝0、1、2或3，更优选地，其中x＝4，n＝7和m＝2。 在一个实施方案中，所述接头是(G₄S)₆G₂。

对于所述全长抗体的重链或轻链的每一C或N末端，只有一个来自 b)项的单链Fab片段可以在同一时间融合。因此，可以与所述全长抗体融 合多达八个单链Fab片段。优选地，根据本发明的多特异性抗体包含一个 至四个单链Fab片段。更优选地，根据本发明的多特异性抗体包含两个相 同的单链Fab片段(优选VL-CL-接头-VH-CH1)，其都与a)项的所述全 长抗体的两条重链的两个C末端或者两条轻链的两个C末端融合。该融合 导致两个相同的融合肽(或者i)重链和单链Fab片段或者ii)轻链和单链 Fab片段)，其与全长抗体的或者i)轻链或者重链共表达，以产生根据本发 明的多特异性抗体(参见图3、4和5)。

在另一优选的实施方案中，根据本发明的多特异性抗体包含两个相同 的单链Fab片段(优选VH-CH1-接头-VL-CL)，其都与a)项的所述全长 抗体的两条重链的两个N末端或者两条轻链的两个N末端融合。该融合导 致两个相同的融合肽(或者i)重链和单链Fab片段或者ii)轻链和单链 Fab片段)，其与全长抗体的或者i)轻链或者重链共表达，以产生根据本发 明的多特异性抗体。

根据本发明的多特异性抗体的两部分都包含抗原结合位点(根据本发 明的全长抗体包含两个抗原结合位点，并且每一单链Fab片段包含一个抗 原结合位点)。如本文中所用，术语“结合位点”或“抗原结合位点”指 与各个抗原实际特异结合的根据本发明的所述多特异性抗体的区域。通过 由抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)组成的对，形成了每 一在全长抗体中或者在单链Fab片段中的抗原结合位点。

与期望的抗原(例如EGFR)特异结合的抗原结合位点可以来源于a) 抗原的已知抗体(例如抗EGFR抗体)或b)通过使用尤其是抗原蛋白质或 核酸或者它们片段的重新产生的免疫方法或者通过噬菌体展示获得的新抗 体或抗体片段。

本发明的抗体的抗原结合位点包含六个互补决定区(CDR)，其不同 程度地有助于结合位点与抗原的亲和力。其具有三个重链可变区CDR (CDRH1、CDRH2和CDRH3)和3个轻链可变区CDR(CDRL1、CDRL2 和CDRL3)。通过比较氨基酸序列的编译数据库确定CDR和构架区(FR) 的程度，其中已经根据序列之间的变异性定义了这些区域。

抗体特异性指抗体对抗原的特定表位的选择性识别。例如天然抗体是 单特异性的。如本文中所用，术语“多特异性”指具有两个或多个抗原结 合位点的抗体，其中至少两个结合不同的抗原或者相同抗原的不同表位。 根据本发明，“双特异性抗体”是具有两个不同的抗原结合特异性的抗体。 本发明的抗体是例如对至少两个不同的抗原(即作为第一抗原的EGFR和 作为第二抗原的IGF-1R)是多特异性的。在本发明的一个实施方案中， 根据本发明的多特异性抗体是双特异性的。在本发明的另一实施方案中， 根据本发明的多特异性抗体是三特异性的。

如本文中所用，术语“单特异性”抗体指具有一个或多个结合位点的 抗体，其中每一结合位点结合相同抗原的相同表位。

如在本申请中所用，术语“价”指在抗体分子中存在的结合位点的具 体数目。例如天然抗体或根据本发明的全长抗体具有两个结合位点，并且 是二价的。因此，术语“二价的”、“三价的”、“四价的”、“五价的”和“六 价的”指在抗体分子中分别存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合 位点、五个结合位点和六个结合位点。根据本发明的多特异性抗体至少是 “三价的”。优选地，它们是“三价的”、“四价的”、“五价的”或“六价的”， 更优选地它们是“三价的”或“四价的”。

本发明的抗体具有三个或多个结合位点，并且是多特异性的，优选地 双特异性的或三特异性的。甚至在存在多于三个结合位点(即抗体是四价 的、五价的或六价的或者多价的)的情况下，根据本发明的多特异性抗体 也可以是双特异性的。对于具有多于两个抗原结合位点的抗体，一些结合 位点可以是相同的，只要该蛋白质对两种不同的抗原具有结合位点。

本发明的另一实施方案是多特异性抗体，其包含

a)全长抗体，其与第一抗原特异结合，并包含

aa)由以N末端至C末端方向的抗体重链可变区(VH)、抗体重链恒 定区1(CH1)、抗体铰链区(HR)、抗体重链恒定区2(CH2)和抗体重 链恒定区3(CH3)组成的两个相同的抗体重链；和

ab)由以N末端至C末端方向的抗体轻链可变区(VL)和抗体轻链 恒定区(CL)(VL-CL)组成的两个相同的抗体轻链；和

b)与一个至四个另外的抗原特异结合的(优选地与一个另外的抗原特 异结合的)一个至四个单链Fab片段，其中单链Fab片段由抗体重链可变 区(VH)和抗体恒定区1(CH1)、抗体轻链可变区(VL)和抗体轻链恒 定区(CL)和接头组成，并且其中所述抗体区和所述接头具有以N末端 至C末端方向的以下顺序：

ba)VH-CH1-接头-VL-CL，bb)VL-CL-接头-VH-CH1，bc)VH-CL- 接头-VL-CH1或bd)VL-CH1-接头-VH-CL；

其中所述接头是至少30个氨基酸，优选地32个至50个氨基酸之间的 肽；

并且，其中b)项的所述单链Fab片段通过肽连接体在所述全长抗体的 重链或轻链的C末端或N末端与a)项的所述全长抗体融合；

其中所述肽连接体是至少5个氨基酸，优选地10个至50个氨基酸之 间的肽。

在该实施方案中，与第二抗原特异结合的，优选一个或两个，更优选 两个单链Fab片段ba)VH-CH1-接头-VL-CL或bb)VL-CL-接头 -VH-CH1，优选bb)VL-CL-接头-VH-CH1，通过肽连接体在所述全长抗 体的重链的C末端与所述全长抗体融合，并且该单链Fab片段未被二硫化 物稳定。

本发明的一个实施方案是根据本发明的多特异性抗体，其中与第二抗 原结合的一个或两个单链Fab片段通过肽连接体在所述全长抗体的重链的 C末端与所述全长抗体融合(双特异性抗体)。

根据本发明优选的多特异性抗体包含与第二抗原结合的两个相同的单 链Fab片段，所述两个相同的单链Fab片段或者都与重链或者都与轻链C 或N末端融合(双特异性抗体)。

本发明的一个实施方案是根据本发明的多特异性抗体，其中与第二抗 原结合的两个相同的单链Fab片段VL-CL-接头-VH-CH1或VH-CH1-接 头-VL-CL，优选VL-CL-接头-VH-CH1，用它们的N末端通过肽连接体在 所述全长抗体的两条重链的两个C末端或者在两条轻链的两个C末端与所 述全长抗体融合(四价、双特异性抗体)。在优选的实施方案中，根据本发 明的所述多特异性抗体(优选所述四价、双特异性抗体)包含全长IgG和 如上所述的根据本发明的两个相同的单链Fab片段，并特异结合人IGF-1R 以及人EGFR。这些分子优选地基于人抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB Clone 18(DSM ACC 2587；WO 2005/005635，简称为<IGF-1R>Clone18 或<IGF-1R>AK18)和人源化的<EGFR>ICR62(WO 2006/082515简称为 <EGFR>ICR62)的抗原结合位点。这些分子同时靶向并干扰在肿瘤细胞 上的两种受体酪氨酸激酶的作用。与仅干扰这些受体的一种的抗体比较， 该双活性造成了明显改进的抗肿瘤活性。实施例1-6中显示了此类分子的 设计、组成、产生和特征。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体的特征在于

i)与IGF1R特异结合，并且在重链可变区中包含SEQ ID NO：1的 CDR3区、SEQ ID NO：2的CDR2区和SEQ ID NO：3的CDR1区，且在 轻链可变区中包含SEQ ID NO：4的CDR3区、SEQ ID NO：5的CDR2区 和SEQ ID NO：6的CDR1区的所述全长抗体；和

ii)与EGFR特异结合，并且在重链可变区中包含SEQ ID NO：9的 CDR3区、SEQ ID NO：10的CDR2区和SEQ ID NO：11的CDR1区，且 在轻链可变区中包含SEQ ID NO：12的CDR3区、SEQ ID NO：13的CDR2 区和SEQ ID NO：14的CDR1区的所述单链Fab片段。

在一个实施方案中，根据本发明的该多特异性抗体的特征在于

i)与IGF-1R特异结合，并且包含作为重链可变区的SEQ ID NO：7 和作为轻链可变区的SEQ ID NO：8的所述全长抗体，和

ii)与EGFR特异结合，并且包含作为重链可变区的SEQ ID NO：15 和作为轻链可变区的SEQ ID NO：16的所述单链Fab片段。

在一个实施方案中，根据本发明的该多特异性抗体的特征在于

i)与EGFR特异结合，并且在重链可变区中包含SEQ ID NO：9的 CDR3区、SEQ ID NO：10的CDR2区和SEQ ID NO：11的CDR1区，且 在轻链可变区中包含SEQ ID NO：12的CDR3区、SEQ ID NO：13的CDR2 区和SEQ ID NO：14的CDR1区的所述全长抗体；和

ii)与IGF-1R特异结合，并且在重链可变区中包含SEQ ID NO：1的 CDR3区、SEQ ID NO：2的CDR2区和SEQ ID NO：3的CDR1区，且在 轻链可变区中包含SEQ ID NO：4的CDR3区、SEQ ID NO：5的CDR2区 和SEQ ID NO：6的CDR1区的所述单链Fab片段。

在一个实施方案中，根据本发明的该多特异性抗体的特征在于

i)与EGFR特异结合，并且包含作为重链可变区的SEQ ID NO：15 和作为轻链可变区的SEQ ID NO：16的所述全长抗体，和

ii)与IGF1R特异结合，并且包含作为重链可变区的SEQ ID NO：7 和作为轻链可变区的SEQ ID NO：8的所述单链Fab片段。

本发明的一个实施方案是根据本发明的多特异性抗体，其中与第二抗 原结合的两个相同单链Fab片段VL-CL-接头-VH-CH1或VH-CH1-接头 -VL-CL，优选VL-CL-接头-VH-CH1，以它们的C末端通过肽连接体在所 述全长抗体的两条重链的两个N末端或在两条轻链的两个N末端与所述全 长抗体融合。

本发明的一个实施方案是根据本发明的多特异性抗体，其中与第二抗 原结合的一个单链Fab片段通过肽连接体在所述全长抗体的一条重链或一 条轻链的C或N末端与所述全长抗体融合。本发明的一个实施方案是根据 本发明的多特异性抗体，其中与第二抗原结合的一个单链Fab片段通过肽 连接体在所述全长抗体的一条重链或一条轻链的N末端与所述全长抗体融 合。本发明的一个实施方案是根据本发明的多特异性抗体，其中与第二抗 原结合的一个单链Fab片段通过肽连接体在所述全长抗体的一条重链或一 条轻链的C末端与所述全长抗体融合(参见例如图6)。

优选地，根据本发明的多特异性抗体包含与第二抗原和第三抗原结合 的两个单链Fab片段(三特异性抗体)(参见例如图7)。

在本发明的另一方面中，根据本发明的多特异性抗体包含

a)与第一抗原结合的由两条相同的抗体重链VH-CH1-HR-CH2-CH3 和两条相同的抗体轻链VL-CL组成的全长抗体；和

b)与一个至四个另外的抗原结合的一个至四个单链Fab片段ba) VH-CH1-接头-VL-CL或bb)VL-CL-接头-VH-CH1，其中所述单链Fab片 段通过肽连接体在所述全长抗体的重链和轻链的C或N末端与所述全长抗 体连接。

本发明的全长抗体包含一个或多个免疫球蛋白类型的免疫球蛋白恒定 区。免疫球蛋白类型包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE同种型，以及在IgG 和IgA情况下它们的亚型。在优选的实施方案中，本发明的全长抗体具有 IgG型抗体的恒定区结构。

如本文中所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一 氨基酸组成的抗体分子的制备物。

术语“嵌合抗体”是指包含来自一种来源或物种的可变区即结合区， 以及至少一部分来源于不同来源或物种的恒定区的抗体，通常通过重组 DNA技术制备。优选包含鼠源可变区和人源恒定区的嵌合抗体。由本发明 包括的“嵌合抗体”的其他优选形式是其中恒定区已经从原始抗体的恒定 区得以修饰或改变，以产生根据本发明的特性，特别是有关C1q结合和/ 或Fc受体(FcR)结合的那些嵌合抗体。此类嵌合抗体也称为“类别转换 抗体”。嵌合抗体是包含编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球 蛋白恒定区的DNA区段的免疫球蛋白基因的表达产物。用于产生嵌合抗 体的方法涉及本领域熟知的常规重组DNA和基因转染方法。参见，例如， Morrison，S.L.等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 81(1984)6851-6855；美国专 利No.5,202,238和5,204,244。

术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中框架或“互补决定区”(CDR) 已经被修饰，以包含与亲本免疫球蛋白相比具有不同特异性的免疫球蛋白 的CDR。在优选的实施方案中，将鼠CDR移植至人抗体的框架区，以制 备“人源化抗体”。参见例如，Riechmann，L.等，Nature 332(1988)323-327； 以及Neuberger，M.S.等，Nature 314(1985)268-270。特别优选的CDR对 应于提供这样序列的CDR，所述序列识别上述嵌合抗体的抗原。由本发明 包括的“人源化抗体”的其他形式是其中恒定区已经从原始抗体的恒定区 得以修饰或改变，以产生根据本发明的特性，特别是有关C1q结合和/或 Fc受体(FcR)结合的那些人源化抗体。

如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有来源于人种系免疫球蛋白 序列的可变和恒定区的抗体。人抗体在本领域是众所周知的(van Dijk，M.A. 和van de Winkel，J.G.，Curr. Opin.Chem.Biol.5(2001)368-374)。人抗体 也可以在转基因动物(如小鼠)中生产，所述转基因动物经免疫后能够生产 全部或选择的人抗体，而无内源免疫球蛋白生产。将人种系免疫球蛋白基 因阵列转移到这样的种系突变小鼠中导致在抗原刺激时生产人抗体(参见 例如Jakobovits，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551-2555； Jakobovits，A.等，Nature 362(1993)255-258；Bruggemann，M.等，Year Immunol.7(1993)33-40)。人抗体也可以在噬菌体展示文库中生产 (Hoogenboom，H.R.和Winter，G.，J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks， J.D.等，J.Mol.Biol.222(1991)581-597)。还可以利用Cole等及Boerner 等的技术制备人单克隆抗体(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer  Therapy，Alan R.Liss，(1985)77；和Boerner，P.等，J.Immunol.147 (1991)86-95)。如已经提及的根据本发明的嵌合抗体和人源化抗体，如本 文中所用，术语“人抗体”也包含其中例如通过“类别转换”(即改变或突 变Fc部分，例如从IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4的突变)修饰恒定区， 以产生根据本发明的特性，特别是有关C1q结合和/或Fc受体(FcR)结 合的此类抗体。

在根据本发明的多特异性抗体包含产生异二聚融合肽的一个或三个单 链Fab片段的情况下(或者在两个不相同的单链片段都连接在重链或轻链 的C末端或N末端的情况下)，根据本发明的所述全长抗体的CH3区可以 通过在例如WO 96/027011，Ridgway，J.B.等，Protein Eng 9(1996)617-621； 和Merchant，A.M.等，Nat Biotechnol 16(1998)677-681中用几个实施 例详细描述的“杵臼结构(knob-into-hole)”方法改变。在该方法中，改 变两个CH3区的相互作用表面以增加含有这两个CH3区的两重链的异二 聚化。(两重链的)两个CH3区的每一个可以是“杵状结构(knob)”，而 另一个是“臼状结构(hole)”。二硫键的引入稳定了异二聚体(Merchant， A.M.等，Nature Biotech 16(1998)677-681；Atwell，S.等，J.Mol.Biol.270 (1997)26-35)并增加了产率。

因此，在本发明的一个方面中，根据本发明的所述多特异性抗体包含 仅一个单链Fab片段，并且其另外的特征在于

一条重链的CH3区和另一条重链的CH3区在包含抗体CH3区之间的 原始界面处各自接触；

其中，改变所述界面以促进二价双特异性抗体的形成，其中该改变的 特征在于：

a)改变一条重链的CH3区，

以使在接触二价双特异性抗体内另一条重链CH3区的原始界面的一 条重链的CH3区原始界面内，

用具有更大的侧链体积的氨基酸残基取代氨基酸残基，从而产生该条 重链的CH3区的界面内的突出部分，其可定位于另一条重链的CH3区的 界面内的腔中

和

b)改变另一条重链的CH3区，

以使在接触三价双特异性抗体内第一CH3区的原始界面的第二CH3 区的原始界面，

用具有更小侧链体积的氨基酸残基取代氨基酸残基，从而产生在第二 CH3区的界面内的腔，其中位于第一CH3区的界面内的突出部分可以定 位于其中。

优选地，具有更大侧链体积的所述氨基酸残基选自精氨酸(R)、苯丙 氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

优选地，具有更小侧链体积的所述氨基酸选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、 苏氨酸(T)、缬氨酸(V)。

在本发明的一个方面中，通过引入半胱氨酸(C)作为每一CH3区对 应位置的氨基酸来进一步改变两个CH3区，以使两个CH3区之间可以形 成二硫键。

在优选的实施方案中，所述多特异性抗体包含仅一个单链Fab片段， 且其是三价双特异性抗体。所述三价双特异性抗体包含“杵状结构链”的 CH3区中T366W突变和“臼状结构链”的CH3区中T366S、L368A、Y407V 突变。例如，通过将Y349C突变引入“杵状结构链”的CH3区，并将E356C 突变或S354C突变引入“臼状结构链”的CH3区，也可以使用CH3区之 间的其他链间二硫键(Merchant，A.M等，Nature Biotech 16(1998) 677-681)。因此，在另一个优选的实施方案中，所述三价双特异性抗体包 含在两个CH3区之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3区的另一 个中的E356C、T366S、L368A、Y407V突变或者所述三价双特异性抗体 包含在两个CH3区之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3区的另 一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变(在一个CH3区中另外的 Y349C突变和在另一个CH3区中另外的E356C或S354C突变形成了链间 二硫键)(通常根据Kabat的EU索引编号)。但也可以备选地或另外地使 用如由EP 1870459A1描述的其他杵臼结构方法。所述三价双特异性抗体 的优选实例是在“杵状结构链”的CH3区中的R409D；K370E突变和在 “臼状结构链”的CH3区中的D399K；E357K突变(通常根据Kabat的 EU索引编号)。

在另一个优选的实施方案中，所述三价双特异性抗体(包含仅一个单 链Fab片段的多特异性抗体)包含在“杵状结构链”的CH3区中的T366W 突变和在“臼状结构链”的CH3区中的T366S、L368A、Y407V突变， 并且另外地，在“杵状结构链”的CH3区中的R409D；K370E突变和在 “臼状结构链”的CH3区中的D399K；E357K突变。

在另一个优选的实施方案中，所述三价双特异性抗体(包含仅一个单 链Fab片段的多特异性抗体)包含在两个CH3区之一中的Y349C、T366W 突变和在两个CH3区的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变 或者所述三价双特异性抗体包含在两个CH3区之一中的Y349C、T366W 突变和在两个CH3区的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变 和另外地，在“杵状结构链”的CH3区中的R409D；K370E突变和在“臼 状结构链”的CH3区中的D399K；E357K突变。

因此，本发明的一个实施方案是根据本发明的多特异性抗体，其中与 第二抗原结合的一个单链Fab片段通过肽连接体在所述全长抗体的一条重 链或一条轻链的C末端或N末端(优选一条重链的C末端)与所述全长 抗体融合，其中全长抗体包含在两个CH3区之一中的T366W突变和在两 个CH3区的另一个中的T366S、L368A、Y407V突变。本发明的另一个 实施方案是根据本发明的多特异性抗体，其中与第二抗原结合的一个单链 Fab片段通过肽连接体在所述全长抗体的一条重链或一条轻链的C末端或 N末端(优选一条重链的C末端)与所述全长抗体融合，其中全长抗体包 含在两个CH3区之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3区的另一 个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变(参见例如图6)。本发明的 另一个实施方案是根据本发明的多特异性抗体，其中与第二抗原结合的一 个单链Fab片段通过肽连接体在所述全长抗体的一条重链或一条轻链的C 末端或N末端(优选一条重链的C末端)与所述全长抗体融合，其中全长 抗体包含在两个CH3区之一中的Y349C、T366W突变和在两个CH3区 的另一个中的S354C、T366S、L368A、Y407V突变。

如本文所用，术语“重组人抗体”旨在包括通过重组手段制备、表达、 创建或分离的所有人抗体，例如，从宿主细胞例如NS0或CHO细胞或者 从转基因人免疫球蛋白基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体或利用转染 到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。此类重组人抗体具有以重排形 式的可变区和恒定区。可以将根据本发明的重组人抗体进行体内体细胞高 度突变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是在体内人抗体种 系所有组成成分内并不天然存在的序列，尽管其来源于并与人种系VH和 VL序列有关。

如本文所用的“可变区”(轻链可变区(VL)、重链可变区(VH))表示直 接参与抗体与抗原结合的每一对轻链和重链。人轻链和重链可变区具有相 同的一般结构，并且每一区域包含由三个“高变区”(或互补决定区，CDR) 连接的序列广泛保守的四个构架(FR)区。该构架区采用β折叠构象，并 且CDR可以形成连接β折叠结构的环。每一链中的CDR通过构架区固定 在其三维结构中并与来自其他链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重 链和轻链CDR3区在根据本发明的抗体的结合特异性/亲和力中起着特殊 的重要作用，并因此提供了本发明的另外目的。

当在本文中使用时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指负 责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR” 的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是非如本文中定义的高变区残基的这 些可变区区域。因此，抗体的轻链和重链从N末端到C末端包含区域FR1、 CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。在每一链上的CDR由此类 构架氨基酸分开。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。CDR 和FR根据Kabat等，Seq uences of Proteins of Immunological Interest， 第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda， MD(1991)的标准定义确定。

如本文中所用，术语“结合”或“特异结合”指用纯化的野生型抗原， 在体外测定中，优选地在等离振子共振测定(plasmon resonance assay) (BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，瑞典)中，抗体与抗原的表位的结 合。结合的亲和力由术语ka(抗体/抗原复合物的抗体结合的速率常数)、 k_D(解离常数)和K_D(k_D/ka)定义。结合或特异结合指10^-8mol/l或更低， 优选10^-9M至10^-13mol/l的结合亲和力(K_D)。因此，根据本发明的多特异 性抗体与每一抗原特异结合，对于所述多特异性抗体，其具体10^-8mol/l或 更低，优选地10^-9M至10^-13mol/l的结合亲和力(K_D)。

通过BIAcore测定(GE-Healthcare Uppsala，瑞典)，可以研究抗体 与FcγRIII的结合。通过术语ka(抗体/抗原复合物的抗体结合的速率常数)、 k_D(解离常数)和K_D(k_D/ka)定义了结合的亲和力。

术语“表位”包括能与抗体特异结合的任一多肽决定簇。在某些实施 方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，例如氨基酸、糖侧链、 磷酰基或磺酰基，在某些实施方案中，可以具有特殊三维结构特征和或特 殊电荷特征。表位是抗原结合抗体的区域。

在某些实施方案中，在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中，当抗体优 先识别其靶抗原时，认为该抗体特异地结合抗原。

如在本申请中所用，术语“恒定区”指抗体非可变区的区域的总和。 恒定区并不直接参与结合抗原，但显示出多种效应子功能。取决于抗体的 重链的恒定区的氨基酸序列，将抗体分为：IgA型、IgD型、IgE型、IgG 型和IgM型，并且可以将这些的几种进一步分成亚型，例如IgG1、IgG2、 IgG3和IgG4、IgA1和IgA2。与抗体的不同型对应的重链恒定区分别称 为α、δ、ε、γ和μ。可以在全部五种抗体类型中发现的轻链恒定区称 为κ(kappa)和λ(lambda)。

如在本申请中所用，术语“来源于人类来源的恒定区”指人抗体的亚 型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区和/或κ或者λ轻链恒定区。 此类恒定区在本领域是熟知的，并例如由Kabat，E.A.，(参见例如Johnson， G.和Wu，T.T.，Nucleic Acids Res.28(2000)214-218；Kabat，E.A.等， Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(1975)2785-2788)描述。

尽管IgG4亚型的抗体显示出降低的Fc受体(FcγRIIIa)结合，但其 他IgG亚型的抗体显示出强的结合。然而，如果改变Pro238、Asp265、 Asp270、Asn297(缺失Fc糖类)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、 Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435， 那么这些残基也提供降低的Fc受体结合(Shields，R.L.等，J.Biol.Chem. 276(2001)6591-6604；Lund，J.等，FASEB J.9(1995)115-119；Morgan， A.等，Immunology 86(1995)319-324；EP 0307434)。

在一个实施方案中，根据本发明的抗体与IgG1抗体比较，具有降低 的FcR结合，并且关于IgG4亚型的FcR结合或IgG1或IgG2亚型的FcR 结合，全长亲本抗体具有S228、L234、L235和/或D265突变，和/或含有 PVA236突变。在一个实施方案中，全长亲本抗体中的突变是S228P、 L234A、L235A、L235E和/或PVA236。在另一个实施方案中，全长亲本 抗体中的突变是IgG4中S228P和IgG1中L234A和L235A。重链恒定区 显示于SEQ ID NO：17和18中。在一个实施方案中，全长亲本抗体的重 链恒定区是具有突变L234A和L235A的SEQ ID NO：17。在另一个实施 方案中，全长亲本抗体的重链恒定区是具有突变S228P的SEQ ID NO：18。 在另一个实施方案中，全长亲本抗体的轻链恒定区是SEQ ID NO：19的κ 轻链区或λ轻链区。优选地全长亲本抗体的重链恒定区是具有S228P突变 的SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18。

抗体的恒定区直接参与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)和 CDC(补体依赖的细胞毒性)。补体活化(CDC)通过补体因子C1q与大 多数IgG抗体亚型的恒定区结合引发。C1q与抗体的结合通过在称为结合 位点的确定的蛋白质-蛋白质相互作用发生。此类恒定区结合位点在本领域 是已知的，并例如由Lukas，T.J.等，J.Immunol.127(1981)2555-2560； Brunhouse，R.和Cebra，J.J.，Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton， D.R.等，Nature 288(1980)338-344；Thommesen，J.E.等，Mol.Immunol. 37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.等，J.Immunol.164(2000)4178-4184； Hezareh，M.等，J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan，A.等， Immunology 86(1995)319-324；和EP 0307434描述。此类恒定区结合 位点，例如，以氨基酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、 P331和P329为特征(根据Kabat的EU索引编号)。

术语“抗体依赖性细胞毒性(ADCC)”指在效应细胞存在的情况下， 通过根据本发明的抗体裂解人靶细胞。优选地通过在效应细胞例如新鲜分 离的PBMC或从暗黄覆盖层纯化的效应细胞，如单核细胞或天然杀伤 (NK)细胞或者永久生长的NK细胞系存在的情况下，用根据本发明的抗 体处理表达抗原的细胞的制备物测量ADCC。

术语“补体依赖性细胞毒性(CDC)”指通过补体因子C1q与大多数 IgG抗体亚型的Fc部分结合引发的过程。C1q与抗体的结合通过在称为结 合位点的确定的蛋白质-蛋白质相互作用发生。此类Fc部分结合位点是现 有技术中已知的(参见上述)。此类Fc部分结合位点，例如，以氨基酸L234、 L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329为特征(根据 Kabat的EU索引编号)。IgG1、IgG2和IgG3亚型的抗体通常显示出包 括C1q和C3结合的补体活化，而IgG4并不活化补体系统并且不结合C1q 和/或C3。

在另外的实施方案中，根据本发明的多特异性抗体的特征在于，所述 全长抗体是人IgG1亚型或具有突变L234A和L235A的人IgG1亚型。

在另外的实施方案中，根据本发明的多特异性抗体的特征在于，所述 全长抗体是人IgG2亚型。

在另外的实施方案中，根据本发明的多特异性抗体的特征在于，所述 全长抗体是人IgG3亚型。

在另外的实施方案中，根据本发明的多特异性抗体的特征在于，所述 全长抗体是人IgG4亚型或具有另外的突变S228P的人IgG4亚型。

优选地，根据本发明的多特异性抗体的特征在于，所述全长抗体是人 IgG1亚型、具有另外的突变S228P的人IgG4亚型。

在另外的实施方案中，根据本发明的多特异性抗体的特征在于，以增 加针对人Fcγ受体IIIa的亲和力的方式修饰(或者通过在Fc区突变或者 通过glycoengineering)所述全长抗体，以增加其介导ADCC的能力。通 过降低岩藻糖的量增强抗体的ADCC的方法描述于例如 WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700、WO 2004/065540、 WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、US 2006/0134709、 US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835、WO 2000/061739 Niwa，R.等，J.Immunol.Methods 306(2005)151-160；Shinkawa，T. 等，J.Biol.Chem.278(2003)3466-3473；WO 03/055993或US 2005/0249722 中。因此，在本发明的一个实施方案中，根据本发明的多特异性抗体的特 征在于，所述全长抗体是去岩藻糖基化(afucosylated)的IgG1或IgG3 同种型，其中在Asn297，岩藻糖的量是寡糖(糖)的总量的60％或更少 (这意味着在Asn297处Fc区的至少40％或更多的寡糖是去岩藻糖基化 的)。

根据本发明的抗体通过重组手段生产。因此，本发明的一个方面是编 码根据本发明的抗体的核酸，且进一步的方面是包含编码根据本发明的抗 体的所述核酸的细胞。用于重组产生的方法在本领域广为人知，并且包括 在原核和真核细胞中表达蛋白质，随后分离抗体多肽，并通常纯化至可药 用的纯度。为在宿主细胞中表达如前所述的抗体，通过标准方法将各自编 码修饰的轻链和重链的核酸插入表达载体中。在合适的原核或真核宿主细 胞如CHO细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK293细胞、COS细胞、PER.C6 细胞、酵母或大肠杆菌细胞中进行表达，从细胞(裂解后的上清液或细胞) 中回收抗体。用于抗体的重组生产的一般方法在本领域众所周知，并描述 于例如Makrides，S.C.，Protein Expr. Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.等， Protein Expr. Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，Mol.Biotechnol.16 (2000)151-160；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880的综述文章中。

可以通过常规的免疫球蛋白纯化方法例如，如蛋白质A-琼脂糖、羟基 磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析从培养基中适当地分离根据本发 明的多特异性抗体。编码单克隆抗体的DNA和RNA利用常规方法很容易 分离，并进行测序。杂交瘤细胞可用作为此类DNA和RNA的来源。DNA 一经分离，即可将DNA插入到表达载体中，随之转染到否则将不生产免 疫球蛋白的宿主细胞例如HEK293细胞、CHO细胞或骨髓瘤细胞中，以 实现宿主细胞中重组单克隆抗体的合成。

通过将合适的核苷酸改变引入到抗体DNA中，或者通过核苷酸合成 制备多特异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)。可以进行此类修饰，然 而，仅以非常有限的范围，例如，如上所述。例如，修饰并不改变上述的 抗体特征，例如IgG同种型和抗原结合，但可以改进重组产物的产率、蛋 白质稳定性或有助于纯化。

如在本申请中所有，术语“宿主细胞”指可以工程改造以产生根据本 发明的抗体的任一类型的细胞系统。在一个实施方案中，将HEK293细胞 和CHO细胞用作为宿主细胞。

如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”互换使用， 且所有这样命名包括子代。因此，措辞“转化株”和“转化细胞”包括最 早的受试细胞和由之获得的培养物，而不考虑转移次数。也应当理解，由 于故意或无意的突变，所有的子代在DNA内容方面可能并不精确相同。 具有在原始转化的细胞中所筛选的相同功能或生物学活性的变体子代包括 在本发明的范围内。在需要特定指明的情况下，从上下文中可以清晰地得 知。

在NS0细胞中表达由例如，Barnes，L.M.等，Cytotechnology 32(2000) 109-123；Barnes，L.M.等，Biotech.Bioeng.73(2001)261-270描述。瞬 时表达由例如，Durocher，Y.等，Nucl.Acids.Res.30(2002)E9描述。 可变区的克隆由Orlandi，R.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989) 3833-3837；Carter，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285-4289； 和Norderhaug，L.等，J.Immunol.Methods 204(1997)77-87描述。优 选的瞬时表达系统(HEK 293)由Schlaeger，E.-J.，and Christensen， K.，在Cytotechnology 30(1999)71-83中和由Schlaeger，E.-J.，在J. Immunol.Methods 194(1996)191-199中描述。

适合于原核生物的控制序列，例如，包括启动子，备选的操纵序列和 核糖体结合位点。真核细胞已知利用启动子、增强子和多聚腺苷化作用信 号。

当核酸与另一核酸序列处于功能关联状态时，其“有效连接”。例如， 如果前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA的连接表达为参与所述 多肽分泌的前蛋白，则他们有效连接；如果启动子或增强子的连接影响编 码序列的转录，则他们有效连接；或者如果核糖体结合位点与编码序列的 排置有利于翻译，则他们有效连接。通常，“有效连接”表示连接的DNA 序列是相邻的，而且在分泌前导序列的情况下是相邻且同读框连接的。不 过，增强子不必相邻。连接通过便利的限制性位点处的连接实现。如果不 存在这样的位点，则按照常规操作使用合成的寡核苷酸适配体(adaptor)或 接头。

通过标准技术，包括本领域众所周知的碱/SDS处理、氯化铯分带(CsCl banding)、柱层析、琼脂糖凝胶电泳等等进行抗体的纯化，以除去其他细 胞组分或其他杂质，如其他细胞核酸或蛋白质(参见Ausubel，F.等编辑 Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley  Interscience，New York(1987))。已经建立了不同的方法并广泛用于蛋白质 纯化，例如使用微生物蛋白质的亲和层析(例如A蛋白或G蛋白亲和层析)、 离子交换层析(例如阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨乙基树脂) 和混合模式交换)、亲硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其他SH配体)、疏水 作用或芳族吸附层析(例如用苯基琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂或间-氨 基苯基硼酸(m-aminophenylboronic acid))、金属螯合亲和层析(例如用 Ni(II)和Cu(II)亲和材料)大小排阻层析和电泳方法(例如凝胶电泳、毛细 管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102)。

如本文中所用，术语“转化”指将载体/核酸转移到宿主细胞中的方法。 如果将没有坚固的细胞壁屏障的细胞用作为宿主细胞，例如通过如 Graham，F.L.，和van der Eb，A.J.，Virology 52(1973)456-467所述的 磷酸钙沉淀方法实施转染。然而，也可以使用将DNA引入细胞的其他方 法，例如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用含有坚固的细胞壁结 构的原核细胞或细胞，例如，转染的一种方法是使用如由Cohen，S.N.等， PNAS.69(1972)2110-2114所述的氯化钙的钙处理。

如本文中所用，“表达”指核酸转录成mRNA的过程和/或所述转录的 mRNA(也称为转录物)随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和 编码的多肽都称为基因产物。如果多核苷酸来源于基因组DNA，那么在真 核细胞中表达包括mRNA的剪接。

“载体”是将核酸分子插入到宿主细胞中和/或之间的，特别是自复 制的核酸分子。该术语包括主要用于将DNA或RNA插入到细胞中(例如， 染色体整合)的载体，载体的复制主要用于DNA或RNA的复制，以及用 于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达载体。也包括提供一个以上的如 上所述功能的载体。

“表达载体”是当将其引入到合适的宿主细胞时，能转录并翻译成多 肽的多核苷酸。“表达系统”通常指包含可以用于产生想要的表达产物的表 达载体的合适宿主细胞。

目前已经发现，根据本发明的多特异性抗体具有改进的特征，例如生 物学或药理学活性、药物动力学特性或毒性。可以将它们用于例如治疗疾 病如癌症。

本发明的一个方面是包含根据本发明的抗体的药物组合物。本发明的 另一方面是根据本发明的抗体用于生产药物组合物的用途。本发明的另外 方面是用于生产包含根据本发明的抗体的药物组合物的方法。在另一方面， 本发明提供含有与药物运载体一起配制的根据本发明的抗体的组合物，例 如药物组合物。

本发明的一个实施方案是用于治疗癌症的根据本发明的多特异性，优 选双特异性抗体。

本发明的另一方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。

本发明的另一方面是根据本发明的抗体用于生产用于治疗癌症的药物 的用途。

本发明的另一方面是通过将根据本发明的抗体施用给需要该治疗的患 者，治疗患癌症的患者的方法。

如本文中所用，“药物载体”包括生理上相容的任何及所有溶剂、分散 介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。优选载体 适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊锥(spinal)或表皮给药(例如通过注 射或输注)。

本发明的组合物可通过本领域公知的多种方法给药。正如技术人员将 会理解的那样，给药路径和/或方式将随期望的结果而变动。为通过某些给 药路径给药本发明的化合物，可能需要用防止化合物失活的材料对其进行 包衣，或化合物与之共给药。例如，可以向受试者给药处于适宜载体例如 脂质体或稀释剂中的化合物。可药用稀释剂包括盐溶液和水性缓冲溶液。 可药用载体包括无菌水性溶液或分散液，以及用于临时制备无菌注射液或 分散液的无菌粉剂。此类介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域公 知的。

如本文所用的短语“肠胃外给药”和“经肠胃外给药”，表示不同于肠 和局部给药的给药方式，通常是通过注射，包括但不限于：静脉内、肌内、 动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表 皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

如本文中所用，术语癌症指增生性疾病，例如淋巴瘤、淋巴细胞白血 病、肺癌、非小细胞肺(NSCL)癌、细支气管细胞肺癌、骨癌、胰腺癌、 皮肤癌、头或颈的癌、皮的或眼内的黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、 肛区的癌、胃癌(stomach cancer)、胃癌(gastric cancer)、结肠癌、乳 腺癌、子宫癌、输卵管的癌、子宫内膜的癌、子宫颈的癌、阴道的癌、外 阴的癌、霍奇金病、食管的癌、小肠的癌、内分泌系统的癌、甲状腺的癌、 甲状旁腺的癌、肾上腺的癌、软组织的肉瘤、尿道的癌、阴茎的癌、前列 腺癌、膀胱的癌、肾或输尿管的癌、肾细胞癌、肾盂的癌、间皮瘤、肝细 胞癌、胆癌、中枢神经系统(CNS)的瘤、脊椎轴肿瘤(spinal axis tumor)、 脑干胶质瘤、多形性成胶质细胞瘤、星细胞瘤、斯万细胞瘤、室管膜细胞 瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、鳞状细胞癌、垂体腺瘤和尤文肉瘤，包括 任一上述癌的难治类型或者一种或多种上述癌的组合。

这些组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。 通过前述灭菌操作，以及通过纳入多种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯 甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，均可以确保防止微生物的存在。 还可能期望在组合物中纳入等渗剂，如糖、氯化钠等。另外，可注射药物 形式的延迟吸收可以通过纳入延迟吸收的药剂如单硬脂酸铝和明胶来实 现。

无论所选的施用路径如何，可以以适宜水合物形式使用的本发明的化 合物和/或本发明的药物组合物通过本领域公知的常规方法配制为可药用 剂型。

根据本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可有变动，以获得 有效量的活性成分，从而对于特定的患者、组合物和给药方式实现期望的 治疗反应，而对患者没有毒性。所选的剂量水平将取决于多种药代动力学 因素，包括所采用的本发明特定组合物的活性、给药路径、给药时间、所 采用特定化合物的排泄速率、与所采用特定组合物组合使用的其他药物、 化合物和/或材料、所治疗患者的年龄、性别、体重、病情、总体健康和既 往病史、以及医学领域众所周知的类似因素。

组合物必需是无菌和流动的，从而组合物可以通过注射器递送。除了 水之外，载体还可以是等渗缓冲盐溶液。

例如，可以通过使用包衣如卵磷脂，分散剂的情况下通过维持所需的 颗粒大小，通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。在许多情况下， 优选在组合物中纳入等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇或山梨糖醇，和氯 化钠。

提供如下实施例、序列列表和附图以帮助理解本发明，本发明的真正 范围阐释在所附权利要求书中。应当理解，可以对所示的操作进行改动而 不会偏离本发明的精神。

氨基酸序列的说明

SEQ ID NO：1重链CDR3，<IGF-1R>HUMAB-Clone 18

SEQ ID NO：2重链CDR2，<IGF-1R>HUMAB-Clone 18

SEQ ID NO：3重链CDR1，<IGF-1R>HUMAB-Clone 18

SEQ ID NO：4轻链CDR3，<IGF-1R>HUMAB-Clone 18

SEQ ID NO：5轻链CDR2，<IGF-1R>HUMAB-Clone 18

SEQ ID NO：6轻链CDR1，<IGF-1R>HUMAB-Clone 18

SEQ ID NO：7重链可变区，<IGF-1R>HUMAB-Clone 18

SEQ ID NO：8轻链可变区，<IGF-1R>HUMAB-Clone 18

SEQ ID NO：9重链CDR3，人源化<EGFR>ICR62

SEQ ID NO：10重链CDR2，人源化<EGFR>ICR62

SEQ ID NO：11重链CDR1，人源化<EGFR>ICR62

SEQ ID NO：12轻链CDR3，人源化<EGFR>ICR62

SEQ ID NO：13轻链CDR2，人源化<EGFR>ICR62

SEQ ID NO：14轻链CDR1，人源化<EGFR>ICR62

SEQ ID NO：15重链可变区，人源化<EGFR>ICR62-I-HHD

SEQ ID NO：16轻链可变区，人源化<EGFR>ICR62-I-KC

SEQ ID NO：17来源于IgG1的人重链恒定区

SEQ ID NO：18来源于IgG4的人重链恒定区

SEQ ID NO：19κ轻链恒定区

附图描述

图1与第一抗原1特异结合的，具有以一般顺序包含可变区和恒定区 的两对重链和轻链的、没有CH4区的全长抗体的示意性结构。

图2例如与第二抗原2特异结合的4个可能的单链Fab片段的示意性 结构。

图3包含与第一抗原1特异结合的全长抗体和与第二抗原2特异结合 的两个单链Fab的根据本发明的多特异性抗体的示意性结构-双特异性四 价实例。

图4包含与IGF-1R特异结合的全长抗体和与EGFR特异结合的两个 相同单链Fab的根据本发明的双特异性抗体-ScFab-XGFR1分子A、B、 C和D以及纯化后表达水平

A：与重链的C末端融合的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL)

B：与重链的C末端融合的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL，含有额外 的VH44-VL100二硫键)。

C：与轻链的C末端融合的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL)。

D：与轻链的C末端融合的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL，含有额外 的VH44-VL100二硫键)。

图5包含与EGFR特异结合的全长抗体和与IGF-1R特异结合的两个 相同的单链Fab的根据本发明的双特异性抗体-ScFab-XGFR2分子A、B、 C和D

A：与重链的C末端融合的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL)

B：与重链的C末端融合的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL，含有额外 的VH44-VL100二硫键)。

C：与轻链的C末端融合的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL)。

D：与轻链的C末端融合的scFab(VH-CH1-接头-VL-CL，含有额外 的VH44-VL100二硫键)。

图6包含与第一抗原1特异结合的全长抗体和与第二抗原2特异结合 的一个单链Fab的根据本发明的多特异性抗体的示意性结构-具有杵状结 构和臼状结构的双特异性三价实例。

图7包含与第一抗原1特异结合的全长抗体和与第二抗原2特异结合 的一个单链Fab以及与第三抗原3特异结合的一个单链Fab的的根据本发 明的多特异性抗体的示意性结构-具有杵状结构和臼状结构的三特异性四 价实例

图8SDS-PAGE分析含有单链Fab的双特异性抗体衍生物 scFab-XGFR1

1：scFab-XGFR14720(非还原的)

2：scFab-XGFR14721(非还原的)

3：scFab-XGFR14720(还原的)

4：scFab-XGFR14721(还原的)

图9HP-SEC分析含有scFab的双特异性抗体衍生物scFab-XGFR1

图9a：scFab-XGFR1-4720；7.7％聚合物(标记在框内)

图9b：scFab-XGFR1-4721；3.5％聚合物(标记在框内)

图10scFab-XGFR1和scFab-XGFR2与EGFR和IGF1R的结合

图10a：Biacore图-scFab-XGFR12720与EGFR的结合，KD＝2nM

图10b：Biacore图-scFab-XGFR12720与IGF-1R的结合，KD＝2nM

图10c：Biacore图-scFab-XGFR22720与EGFR的结合，KD＝0.5nM

图10d：Biacore图-scFab-XGFR22720与IGF-1R的结合，KD＝11 nM

图11图解-通过FACS竞争测定，用以下一般方法分析scFab-XGFR 与细胞的结合

--平行加入用Alexa647标记的<IGF1R>Mab(1μg/mL)+未标记的 scFab-XGFR(100μg/mL-0，001μg/mL)

--冰上孵育45分钟，洗涤&除去未结合的抗体

--用1％HCHO固定，然后FACS

图12通过FACS竞争测定分析scFab-XGFR 2721和亲本<IGF1R> Clone18对细胞的结合

图12a：比较<IGF-1R>Clone18(0，18μg/ml)和scFab-XGFR_2721 (0，15μg/ml)的IC50值

图12b：<IGF-1R>Clone18(拐点0，11μg/ml)的结合曲线-y轴＝RLU； x轴抗体浓度(μg/ml)

图12c：scFab-XGFR_2721(拐点0，10μg/ml)的结合曲线-y轴＝ RLU；x轴抗体浓度(μg/ml)

图13用不同的scFab-XGFR变体(100nM)孵育24小时后，H322M 细胞上的IGF1-R下调。

图14用不同的scFab-XGFR变体(100nM)孵育24小时后，H322M 细胞上的EGFR下调。

图15用不同的scFab-XGFR变体(100nM)抑制H322M细胞的增 值

实验方法

实施例

材料&一般方法

对于人免疫球蛋白轻链和重链的一般信息给出在：Kabat，E.A.等， Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health  Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)中。根据EU编 号对抗体链的氨基酸编号并以此提及(Edelman，G.M.等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA 63(1969)78-85；Kabat，E.A.等，Sequences of Proteins of  Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes  of Health，Bethesda，MD.(1991))。

重组DNA技术

用于操纵DNA的标准技术描述于Sambrook，J.等，Molecular cloning： A laboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约，1989中。根据厂商说明使用分子生物学试剂。

基因合成

想要的基因区段制备自通过化学合成制备的寡核苷酸。通过退火和连 接寡核苷酸组装其两侧具有单独限制性内切核酸酶切割位点的600-1800 bp长的基因区段，包括PCR扩增和随后通过指定的限制性位点例如 BamHI/BstEII、BamHI/BsiWI、BstEII/NotI或BsiWI/NotI克隆到基于pUC 克隆载体的pcDNA 3.1/Zeo(+)(Invitrogen)中。通过DNA测序确认亚 克隆基因片段的DNA序列。根据给定的说明书在Geneart(Regensburg， 德国)订购基因合成片段。

DNA序列测定

通过在Sequiserve GmbH(Vaterstetten，德国)进行的双链测序测定 DNA序列。

DNA和蛋白质序列分析和序列数据管理

将版本10.2的GCG′s(Genetics Computer Group，Madison， Wisconsin)软件包和版本9.1的Invitrogens Vector NT1Advance套件用于 序列创建、作图、分析、注释和说明。

细胞培养技术

所用的标准细胞培养技术描述于Current Protocols in Cell Biology (2000)，Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz， J.和Yamada，K.M.，(编辑)，John Wiley & Sons，Inc中。

在HEK293F细胞中免疫球蛋白变体的瞬时表达

根据厂商说明书(Invitrogen，美国)使用FreeStyle^TM 293表达系统， 通过人胚肾293-F细胞的瞬时转染表达多特异性抗体。简言之，在37℃/8％ CO₂，将悬浮FreeStyle^TM 293-F细胞培养于FreeStyle^TM 293表达培养基中， 并在转染当天将细胞以1-2×10⁶活细胞/ml接种于新鲜培养基中。使用 333μl的293fectin^TM(Invitrogen，德国)和1∶1摩尔比的250μg的重链和轻 链质粒DNA，在I培养基(Invitrogen，美国)中制备250ml 终转染体积的DNA-293fectin^TM复合物。转染7天后，通过在14000g离心 30分钟，澄清含双特异性抗体的细胞培养上清液，并通过无菌过滤器 (0.22μm)过滤。将上清储存于-20℃直到纯化。

蛋白质测定

根据Pace，C.N.等，Protein Science，4(1995)2411-2423，使用基于 氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测定在280nm处的光密度(OD) 和在320nm处作为背景校正的OD，测定纯化的抗体和衍生物的蛋白质浓 度。

在上清液中测定抗体浓度

通过亲和HPLC层析测量细胞培养上清液中抗体和衍生物的浓度。简 言之，在UltiMate 3000HPLC系统(Dionex)上，将含结合A蛋白的抗 体和衍生物的细胞培养上清液应用于200mM KH2PO4、100mM柠檬酸钠， pH7.4中的Applied Biosystems Poros A/20柱，并用200mM NaCl、100mM 柠檬酸，pH 2.5从基质洗脱。通过UV吸收和峰面积的整合定量洗脱的蛋 白质。将纯化的标准IgG1抗体用作为标准。

蛋白质纯化

通过使用A蛋白-琼脂糖^TM(GE Healthcare，瑞典)的亲和层析和 Superdex200大小排阻层析，以两步纯化来自上清液的分泌抗体。简言之， 将含双特异性和三特异性抗体的澄清培养上清液应用在用PBS缓冲液(10 mM Na₂HPO₄、1mM KH₂PO₄、137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4) 平衡的HiTrap ProteinA HP(5ml)柱上。用平衡缓冲液洗去未结合的蛋 白质。用0.1M柠檬酸，pH 2.8缓冲液洗脱双特异性抗体，并用0.1ml1M Tris，pH 8.5中和含蛋白质的组分。然后，收集洗脱的蛋白质组分，用 Amicon Ultra离心过滤装置(MWCO：30K，Millipore)浓缩至3ml的 体积并上样在用20mM Histidin、140mM NaCl，pH6.0平衡的Superdex200 HiLoad 120ml 16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，瑞典)上。收集、速冻 单体的抗体组分，并储存于-80℃。提供部分样品用于后续的蛋白质分析和 表征。

分析纯化的蛋白质

使用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量在280nm处的光 密度(OD)测定纯化的蛋白质样品的蛋白质浓度。在存在或不存在还原剂 (5mM 1，4-二硫苏糖醇)的情况下，通过SDS-PAGE分析双特异性抗体 的纯度，并用考马斯亮蓝染色。根据厂商说明(4-20％Tris-甘氨酸凝胶) 使用Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen，美国)。在25℃，使用在 200mM KH₂PO₄、250mM KCl、pH 7.0运行缓冲液中的Superdex 200分 析的大小排阻柱(GE Healthcare，Sweden)，通过高性能SEC，在UltiMate 3000HPLC系统(Dionex)上分析双特异性抗体样品的聚集含量。以0.5ml/ 分钟的流速，将25μg蛋白质注射在柱上，并等度洗脱50分钟以上。对于 稳定性分析，制备0.1mg/ml、1mg/ml和3mg/ml浓度的纯化蛋白质并在 4℃、37℃孵育7天，并然后通过高性能SEC评价。通过用肽-N-糖苷酶F (Peptide-N-Glycosidase F)(Roche Molecular Biochemicals)酶处理除去 N-聚糖后，通过NanoElectrospray Q-TOF质谱法验证还原的双特异抗体 轻链和重链氨基酸骨架的完整性。

实施例1

识别人IGF1受体以及人EGF受体的根据本发明的多特异性抗体分子的设 计

在以下作为本发明的一个实施方案中，举例说明了包含与第一抗原 (IGF-1R或EGFR)结合的全长抗体和两个单链Fab片段的四价双特异 性抗体，所述两个单链Fab片段通过肽连接体与全长抗体(两个单链Fab 片段都在重链的两个C末端或轻链的两个C末端)连接，并与第二不同抗 原(IGF-1R或EGFR的另一个)结合。在所述单链Fab片段中抗体区和 连接体具有以下以N末端至C末端方向的顺序：VL-CL-接头-VH-CH1。

作为用于<IGF-1R>抗原结合位点的重链可变区VH，使用SEQ ID NO： 15。作为用于<IGF-1R>抗原结合位点的轻链可变区VL，使用SEQ ID NO： 16。

作为用于<EGFR>抗原结合位点的重链可变区VH，使用SEQ ID NO： 7。作为用于<EGFR>抗原结合位点的轻链可变区VL，使用SEQ ID NO：8。

通过基因合成和重组分子生物学方法，通过甘氨酸丝氨酸(G4S)n单链 接头连接包含VH和VL的分别抗原结合位点的VL-CL和VH-CH1，以 产生单链Fab片段VL-CL-接头-VH-CH1，其使用(G4S)n接头连接于抗体 重链或轻链的C末端。

任选地，根据如先前所述的方法(例如WO 94/029350；Reiter，Y.等， Nature biotechnology 14(1996)1239-1245；Young，N.M.等，FEBS Letters 377(1995)135-139；或Rajagopal，V.等，Protein Engineering 10(1997) 1453-59)，将半胱氨酸残基引入到单链Fab片段的VH(包括Kabat位置 44)和VL(包括Kabat位置100)区中。

重组地产生、纯化和表征所有这些分子，并评价蛋白质表达、稳定性 和生物学活性。

在表1中给出了应用于产生四价双特异性<EGFR-IGF-1R>、 <IGF-1R-EGFR>抗体的多特异性抗体设计的总结。对于该研究，我们使 用术语‘scFab-Ab’以描述多种四价蛋白质实体。设计格式的描述显示于 图4和5中并在表1中列出。

表1-具有C末端单链Fab片段连接的不同双特异性抗IGF1R和抗 EGFR四价抗体格式和对应的scFab-Ab-命名。

实施例2

双特异性<EGFR-IGF1R>抗体scFabXGFR1分子的表达&纯化

在携带原核和真核选择标记的表达载体中构建对应的双特异性抗体的 轻链和重链。在大肠杆菌中扩增这些质粒、纯化并随后转染到在HEK293F 细胞中，以瞬时表达重组蛋白质(使用Invitrogen’s freesyle系统)。7天后， 获取HEK 293细胞上清液，并通过A蛋白和大小排阻层析纯化。通过 SDS-PAGE，在非还原和还原条件下，确认所有双特异性抗体构建体的同 质性。在还原条件下(图8)，携带C和N末端scFab融合物的多肽链显 示出与计算的分子量类似的基于SDS-PAGE的表面分子大小。通过A蛋 白HPLC分析所有构建体的表达水平，并且其与‘标准’IgG的表达产率 类似，或者在一些情况下稍低。在此类非优化的瞬时表达实验中，平均蛋 白质产率在每升细胞培养上清液1.5至10mg的蛋白质之间(图4和5)。

纯化蛋白的HP大小排阻层析分析显示出重组分子的一些聚集的倾 向。为了解决此类双特异性抗体的聚集问题，使用了其他结合实体的在VH 和VL之间的二硫化物稳定。为此，我们在scFab的VH和VL内指定的 位置(根据Kabat编号方案的位置VH44/VL100)处引入了单半胱氨酸取 代。这些突变使得在VH和VL之间形成稳定的链间二硫键，其反过来稳 定了得到的二硫化物稳定的scFab组件。在scFab中引入VH44/VL100二 硫化物并没有显著干扰蛋白质的表达水平，并且在一些实例中甚至改进了 表达产率(参见图4和5)。

根据厂商说明(Invitrogen，美国)，使用FreeStyle^TM 293表达系统， 通过瞬时转染人胚肾293-F细胞表达双特异性抗体。简言之，在37℃/8％ CO₂，将悬浮FreeStyle^TM 293-F细胞培养于FreeStyle^TM 293表达培养基中， 并在转染当天将细胞以1-2x10⁶活细胞/ml接种于新鲜培养基中。使用333μl 的293fectin^TM(Invitrogen，德国)和1∶1摩尔比的250μg的重链和轻链质粒 DNA，在I培养基(Invitrogen，美国)中制备250ml终转染 体积的DNA-293fectin^TM复合物。转染7天后，通过在14000g离心30分 钟，澄清含重组抗体衍生物的细胞培养上清液，并通过无菌过滤器 (0.22μm)过滤。将上清储存于-20℃直到纯化。

通过使用A蛋白-琼脂糖^TM(GE Healthcare，瑞典)的亲和层析和 Superdex200大小排阻层析，以两步纯化来自上清液的分泌抗体。简言之， 将含双特异性和三特异性抗体的澄清培养上清液应用在用PBS缓冲液(10 mM Na₂HPO₄、1mM KH₂PO₄、137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4) 平衡的HiTrap ProteinA HP(5ml)柱上。用平衡缓冲液洗去未结合的蛋 白质。用0.1M柠檬酸，pH 2.8缓冲液洗脱抗体衍生物，并用0.1ml1M Tris，pH 8.5中和含蛋白质的级分。然后，收集洗脱的蛋白质级分，用 Amicon Ultra离心过滤装置(MWCO：30K，Millipore)浓缩至3ml的 体积并上样在用20mM Histidin、140mM NaCl，pH 6.0平衡的 Superdex200HiLoad 120ml16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，瑞典)上。 收集、速冻单体的抗体级分，并储存于-80℃。提供部分样品用于后续的蛋 白质分析和表征。在图8和9中显示了纯化蛋白质的示例性SDS-PAGE分 析和双特异性抗体衍生物的HP大小排阻层析(SEC)谱。

图5列出了在瞬时表达系统中观察到的表达产率。所有设计的抗体衍 生物可以以足够进一步分析的量表达和纯化。

出于比较原因，制备并命名了如在WO 1995/009917和Müller D.等， Handbook of Therapeutic antibodies，第III部分，第2章(2008)345-378 中所述的基于与两个scFv片段通过肽连接体在重链的C末端融合的全长 抗体的四价双特异性抗体。替代scFab其携带替代。作为<IGF-1R>抗原结 合位点的重链可变区VH，使用SEQ ID NO：15。作为用于<IGF-1R>抗原 结合位点的轻链可变区VL，使用SEQ ID NO：16。作为用于<EGFR>抗原 结合位点的重链可变区VH，使用SEQ ID NO：7。作为用于<EGFR>抗原 结合位点的轻链可变区VL，使用SEQ ID NO：8。该比较分子称为 XGFR12320(并也在PCT PCT/EP2009/006782中描述)。

双特异性单链Fv分子XGFR1-2320具有0.27mg的纯化后终产率，而 对应的单链Fab分子XGFR1-2720具有6.8mg的终产率(参见图4，化合 物A)，其表现出200倍以上的产率增加。

实施例3

双特异性<EGFR-IGF1R>抗体scFab-XGFR分子的稳定性和聚集倾向

进行HP大小排阻层析分析仪测定在制备的重组抗体衍生物中存在的 聚集物的量。为此，使用Superdex 200分析的大小排阻柱(GE Healthcare， 瑞典)，通过高性能SEC在UltiMate 3000HPLC系统(Dionex)上分析双 特异性抗体样品。图9显示了这些分析的实例。聚集物在含单体抗体衍生 物的级分之前显示为单独的峰或肩(shoulder)。对于该工作，我们定义了 由两个异二聚体组成的所期望的‘单体’分子，该异二聚体包含具有与其 任一连接的scFab的重链和轻链。通过用肽-N-糖苷酶F(Roche Molecular  Biochemicals)酶促处理除去N-聚糖后，通过NanoElectrospray Q-TOF 质谱法验证还原的双特异抗体轻链和重链和融合蛋白质的氨基酸骨架的完 整性。

与正常IgG比较，在不同条件(不同的浓度和时间)下，纯化蛋白质 的HP大小排阻层析分析显示，含scFab的分子具有轻微的聚集倾向。我 们观察到的对于一些分子的该轻微聚集倾向可以通过在scFab组件中引入 VH44/VL100链间二硫键改善。

实施例4

双特异性<EGFR-IGF1R>抗体scFab分子与RTKs EGFR和IGF1R的结 合

将在不同的双特异性抗体格式scFab-XGFR的scFab组件的结合和不 同的双特异性抗体格式scFab-XGFR的全长IgG组件中保留的抗原结合位 点的结合与衍生结合组件和双特异性抗体的‘野生型’IgG的结合比较。 通过应用表面等离振子共振(Biacore)，以及细胞ELISA实施这些分析。

通过表面等离振子共振(SRP)技术，使用Biacore T100仪器(GE Healthcare Bio-Sciences AB，Uppsla)分析双特异性<IGF-1R-EGFR>抗体 的结合特性。该系统是成功建立的用于研究分子相互作用的系统。其允许 在多种测定设置中连续地实时监测配体/分析物结合，并因此测定结合速率 常数(ka)、解离速率常数(kd)和平衡常数(KD)。SPR技术基于测量 接近金包被的生物传感器芯片的表面的折射率。折射率的改变表明，通过 固定化配体与注射的溶液中的分析物的相互作用造成了表面上的质量改 变。如果分子与表面上的固定化配体结合，那么质量会增加，在解离的情 况下，质量减少。

使用胺偶联的化学物质，将捕获性抗人IgG抗体固定在C1生物传感 器芯片的表面上。用1∶1混合的0.1M N-羟基琥珀酰亚胺和0.1M 3-(N，N- 二甲氨基)丙基-N-乙基碳二亚胺以5μl/分钟的流速活化流动池。将pH5.0 的乙酸钠中的抗人IgG抗体以5μg/ml注射，这产生了大约200RU的表面 密度。以相同的方式但仅用载体缓冲液代替捕获性抗体处理参考对照流动 池。通过注射1M乙醇胺/HCl pH 8.5封闭表面。在HBS-P中稀释双特异 性抗体并以5μg/ml的流速注射。对于浓度在1至5nM之间的抗体，接触 时间(结合期)为1分钟。EGFR-ECD以1.2、3.7、11.1、33.3、100和 300nM的增加浓度注射，IGF-1R以0.37、1.11、3.33、10、30和90nM 的浓度注射。对于以30μl/分钟的流速的两种分子，接触时间(结合期)为 3分钟，解离时间(用运行缓冲液洗涤)为5分钟。所有相互作用都在25℃ (标准温度)进行。以5μg/ml的流速，将0.85％磷酸和5mM氢氧化钠 的再生溶液每次注射60秒，以除去每一结合周期后任一未共价结合的蛋白 质。以每秒一个信号的速率检测信号。以增加的浓度注射样品。

在图10a-d中显示双特异性抗体<IGF-1R-EGFR>抗体与EGFR和 IGF1R的示例性同时结合。

表2：双特异性抗体(scFab-XGFR12720和scFab-XGFR22720) 与EGFR和IGF-1R的亲和力(KD)

在培养细胞上的基于FACS结合和竞争分析也可以用于评估双特异性 抗体衍生物与暴露在细胞表面上的RTK的结合能力。图11显示了我们用 于在A549癌细胞上测试含双scFab的特异性XGFR衍生物的结合能力的 实验设置。对于这些细胞竞争测定，分离并计数了表达抗原EGFR以及 IGF1R的A549细胞。将1.5×10e5个细胞接种在锥形96孔板的每孔中。 将细胞离心(1500转/分钟，4℃，5分钟)并在冰上，在50μL具有2％FCS (胎牛血清)、含1μg/mL的Alexa647标记的IGFIR特异性抗体的PBS 中系列稀释的各个特异性抗体中孵育45分钟。再次离心细胞并用200μL 含2％FCS的PBS洗涤两次。最后，在BD CellFix溶液(BD Biosciences) 中重悬细胞并在冰上孵育至少10分钟。通过流式细胞术(FACS Canto) 测定细胞的平均荧光强度(mfi)。两个独立的染色至少一式两份测定Mfi。 使用FlowJo软件(TreeStar)进一步处理流式细胞术光谱。使用XLFit 4.0 (IDBS)和剂量应答一个位点模式205(dose response one site model 205) 测定最大半数结合值。

在图12a-c中显示的这些测定的结果表明了含scFab的双特异性抗体 衍生物在肿瘤细胞的表面的结合功能。例如，在双特异性抗体衍生物 scFab-XGFR12721的竞争实验中的IC50为0.11ug/ml，而单特异性抗体 的IC50高＞50％(0.18ug/ml)。与亲本抗体比较，双特异性 scFab-XGFR 2721衍生物的竞争测定中该增加的活性表明，双特异性分子 比单特异性抗体与细胞表面结合得更好。

实施例5

通过双特异性<EGFR-IGF-1R>抗体scFab-XGFR分子下调EGFR以及 IGF-1R

人抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB Clone 18(DSM ACC 2587)抑 制IGFR1信号，并且人源化大鼠抗EGFR抗体<EGFR>ICR62抑制经由 EGFR的信号。为了评价不同scFab-XGFR1变体的潜在抑制活性，分析 了来自二者的受体的下调的程度。

为了检测本发明的抗体对肿瘤细胞中IGF-I受体(IGF-IR)的量的影 响，进行了用IGF-IR和EGFR特异性抗体的时程实验和随后的ELISA分 析。

将6孔板接种每孔1ml的在补充了10％FCS(PAA，目录号E15-039) 和1％PenStrep的RPMI1640中的人肿瘤细胞(H322M，5×10⁵个细胞 /ml)。每孔加入3ml培养基并将细胞在37℃和5％CO₂培养24小时。

将培养基小心除去，并用2ml稀释在RPMI-VM培养基中的100nM XGFR抗体取代。在对照孔中，将培养基用培养基和没有抗体的缓冲液或 者具有对照抗体(<IGF-1R>HUMAB Clone 18和<EGFR>ICR62终浓度 100nM)的培养基取代。将细胞在37℃和5％CO₂孵育，并在24小时后， 将各个板取出用于进一步的处理。

通过抽吸，将培养基小心除去，并用1ml PBS洗涤细胞。加入300μl/ 孔的冷MES裂解缓冲液(MES，10mM Na₃VO₄和蛋白酶抑制 剂)。1小时后，使用细胞刮棒(Corning，目录号3010)在冰上分离细胞， 并将孔内含物转移到Eppendorf反应管中。通过在13000转/分钟和4℃离 心10分钟去除细胞片段。

对于EGFR检测

根据方案制备96孔微滴定板(MTP)(DuoSet ELISA for Human  EGFR，RnD系统目录号DY231)。将在PBS中的人EGFR山羊抗体 144μg/ml在PBS中1∶180稀释，并将100μl/孔加入到MTP中。将MTP 室温搅拌孵育过夜。用补充了0.1％20的PBS洗涤板3次，并用 300μl/孔的PBS、3％BSA和0.1％20溶液室温(RT)搅拌封闭1 小时。用补充了0.1％20的PBS洗涤板3次。

使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)测定细胞裂解物中蛋白质的量， 然后将细胞裂解物用补充了100mM Na₃VO₄1∶100和蛋白酶抑 制剂1∶20的MES裂解缓冲液调整到0.04mg/ml的蛋白质浓度，并将100μl 每孔的裂解物加入到预制备的MTP中。对于背景测量，将100μl裂解缓 冲液加入到MTP的孔中。

使用的第二细胞裂解物浓度为0.025mg/ml，1∶2稀释裂解物，并以每 孔100μl加入到预制备的MTP中。将MTP室温搅拌孵育另外2小时，并 然后用具有0.1％20溶液的PBS洗涤3次。

EGFR的检测抗体是以在PBS、3％BSA和0.2％20中1∶180 稀释的浓度为36μg/ml的人EGFR山羊生物素化抗体。每孔加入100μl， 并在室温搅拌孵育2小时。然后将MTP用200μl每孔的具有0.1％ 20溶液的PBS洗涤3次。然后加入100μ每孔的在PBS、3％BSA 和0.2％20中1∶200的链霉抗生物素-HRP，并室温搅拌孵育20分 钟。然后用具有0.1％20溶液的PBS洗涤板6次。加入100μl每 孔的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(Roche，BM-Blue ID-No.：11484581)，并室 温搅拌孵育20分钟。通过加入25μl每孔的1M H₂SO₄并室温孵育另外5 分钟终止颜色反应。在450nm处测量吸光度。

对于IGF-1R检测

通过加入100μl每孔的在PBS，3％BSA和0.2％20中1∶200 稀释的AK1a生物素化的抗体(Genmab，丹麦)，制备链霉抗生物素-MTP (Roche ID.No.：11965891001)。将链霉抗生物素-MTP室温搅拌孵育1 小时，并然后用200μl每孔的具有0.1％20溶液的PBS洗涤3次。

使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce)测定细胞裂解物中蛋白质的量， 然后将细胞裂解物用50mM Tris pH 7.4、100mM Na₃VO₄1∶100和 蛋白酶抑制剂1∶20调整到0.3mg/ml的蛋白质浓度，并将100μl 每孔的裂解物加入到预制备的链霉抗生物素-MTP中。

使用的第二细胞裂解物浓度为0.15mg/ml，稀释裂解物，并以每孔 100μl加入到预制备的链霉抗生物素-MTP中。对于背景测量，将100μl裂 解缓冲液加入到链霉抗生物素-MTP中的每孔中。

将MTP室温搅拌孵育另外1小时，并然后用具有0.1％20溶 液的PBS洗涤3次。

IGF-1R的检测抗体是以在PBS、3％BSA和0.2％20中1∶750 稀释的人IGF-1Rβ兔抗体(Santa Cruz Biotechnology，目录号sc-713)。 每孔加入100μl，并在室温搅拌孵育1小时。然后将MTP用200μl每孔的 具有0.1％20溶液的PBS洗涤3次。然后加入第二抗体，将100μl 在PBS、3％BSA和0.2％20中1∶4000的兔IgG-POD(Cell  signaling目录号7074)加入每孔，并室温搅拌孵育1小时。然后用具有 0.1％20溶液的PBS洗涤板6次。加入100μl每孔的3，3’-5，5’-四甲 基联苯胺(Roche，BM-Blue ID-No.：11484581)，并室温搅拌孵育20分 钟。通过加入25μl每孔的1M H₂SO₄并室温孵育另外5分钟终止颜色反应。 在450nm处测量吸光度。

在图13和14中显示了，在A549细胞中，与亲本单特异性抗体 <EGFR>ICR62和<IGF-1R>HUMAB-Clone 18比较，含scFab的双特异 性XGFR分子的受体下调的检测结果。双特异性抗体scFab-XGFR下调了 EGFR以及IGF1R二者。这显示，保留了结合组件的全部功能(生物学 功能)和表型调节(phenotype mediation)。令人惊奇地，图14也表明， 与单独的亲本<EGFR>ICR62抗体比较，双特异性抗体scFab-XGFR 2720 显示出了改进的EGFR的下调。

当以相同的体积摩尔浓度应用于相同的测定时，含scFab的XGFR1 变体显示出了与野生型抗体相同或者比野生型抗体更好的活性的这一事实 表明scFab-XGFR1分子能干扰两个信号通路。

实施例6

scFab-XGFR1和scFab-XGFR2介导的体外肿瘤细胞系的生长抑制

人抗IGF-1R抗体<IGF-1R>HUMAB Clone 18(DSM ACC 2587)抑 制表达IGF1R的肿瘤细胞系的生长(WO 2005/005635)。以类似的方式， 人源化的大鼠抗EGFR抗体<EGFR>ICR62也显示出抑制表达EGFR的 肿瘤细胞系的生长(WO 2006/082515)。为了评价不同scFab-XGFR1变体 在肿瘤细胞系的生长测定中的可能抑制活性，分析了在表达EGFR以及 IGF1R的H322M细胞中抑制的程度。

在防止与塑料表面粘附而包被了聚HEMA(聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)) 的平皿上，将H322M细胞(5000个细胞/孔)培养于补充了10％FCS的 RPMI 1640培养基中。在这些条件下，H322M细胞形成3维生长的致密 球状体(称为贴壁不依赖性的特性)。这些球状体与原位实体肿瘤的三维组 织结构和组织极其类似。在100nM抗体存在的情况下孵育球状体培养物7 天。将Celltiter Glow发光测定用于测量生长抑制。当用<IGF-1R> HUMAB-Clone18处理H322M球状体时，可以观察到生长的抑制。

图15显示100nM<IGF-1R>HUMAB-Clone18的应用降低了细胞生 长72％，并且在相同的测定中，100nM<EGFR>ICR62的应用降低了细胞 生长77％。两种抗体(都以100nM的相同浓度)的同时应用造成了细胞 生存力的完全降低(100％抑制)。这表明，同时干预两个RTK途径比只 干预仅一个途径对肿瘤细胞系更具有显著的影响。以100nM的摩尔浓度应 用多种scFab-XGFR1变体造成更多的生长抑制，其比仅用单分子所观察 到的生长抑制更显著。事实上，以100nM的抗体浓度，多种scFab-XGFR1 变体显示出细胞生长的完全(100％)抑制，而应用单一的组件仅造成部分 抑制。

我们得出结论，与仅仅干扰EGFR信号或IGF1R信号的IgG比较， scFab-XGFR1分子具有更显著的增加的生长抑制活性。