用于预防和延迟色素性视网膜炎的丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂

摘要

本发明涉及丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂用于预防和延迟遗传性视网膜变性的用途，以及含有它们的组合物。

说明书

发明的技术领域

本发明涉及丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂用于预防和延迟遗传性视网膜 变性的用途，并涉及含有它们的组合物，特别是基于脂类纳米球的组合物。

技术现状

术语色素性视网膜炎(RP)包括一类遗传性的病症，涉及双眼视网膜 的进行性变性。受影响的个体受累于暗视觉的逐渐丧失，以及周边视觉的 下降(也称为“管状视”)，并且中心视力也可能随时间而丢失，疾病可 发展为弱视(hypovision)和失明。另一个典型特征是对闪光的增加的敏 感度，换言之，对由明亮向黑暗的转变(反之亦然)适应滞后。所述病症 可影响光受体(视锥和主要是视杆，后者负责周边视觉)或视网膜色素上 皮，伴随有特征性的色素沉积，这是疾病名称的由来。

受色素性视网膜炎影响的在4000人中约有1人，发现于世界各地并且 目前是不可治愈的。在意大利，至少15000人受影响，弱视，在没有有效 治疗的条件下，产生明显的经济和社会冲击。在EU至少150000人受累于 该不可治愈的病症。该疾病虽是遗传性的，但不影响生育能力，由于工业 化国家增加的预期寿命，其发病率有增加的趋势。

Hodge WG等(Can J Ophthalmol.2006Aug；41(4)：481-90)描述了ω -3脂肪酸来治疗视网膜和晶状体的病症的潜在用途，特别是预防或延迟色 素性视网膜炎的进展。然而，作者强调临床试验仍处于初步阶段。

还提出使用一些神经营养因子，然而这仍处于试验阶段，并且受这样 的事实局限，即这类物质具有蛋白质结构、高分子量且并非自由的渗透细 胞。特别而言，Thanos C.，Emerich D.(Expert Opin Biol Ther.2005 Nov；5(11)：1443-52)描述了神经营养因子的受控释放，如CNTF、BDNF、 GDNF、LEDGF、PEDF和其他用于视网膜病症治疗的因子，所述视网膜 病症例如色素性视网膜炎、黄斑变性、青光眼等。

根据一些作者，用抗氧化剂(如二十二碳六烯酸(DHA))或膳食补 充剂(如维生素A棕榈酸盐)口服治疗，延迟视网膜视锥的次级变性。然 而，这类治疗的效果在科学团体中仍有争议。Berson EL.(Int Ophthalmol  Clin.2000Fall；40(4)：93-111)描述了使用营养学方法治疗影响光受体的退 行性视网膜病症的尝试，例如维生素A、E、K和B6补充成分，低蛋白膳 食等。

高比重治疗不是特别有效，虽然一些研究观察到阳性的细胞反应，视 网膜电图(ERG)予以有益的证实，其显示在高压舱用氧治疗的患者的振 幅具有统计学显著的增加。

发明概述

目前发现，体内施用无毒量的丝氨酸棕榈酰转移酶的抑制剂，通过降 低光受体的变性速率、延长其存活和改善其功能性质，能够延迟所述病症 (即，色素性视网膜炎)的进展，特别是残留视觉的时间窗，其中所述丝 氨酸棕榈酰转移酶催化神经酰胺生物合成的第一个关键阶段。

还发现，使用脂类纳米球制剂不仅允许纳米球负载丝氨酸棕榈酰转移 酶抑制剂，其中所述抑制剂获得水性分散体，从而浓度可与用于眼内注射 的制剂相当，而且还在视网膜上(尤其是在与视网膜色素上皮的界面上) 提供了高浓度的化合物，释放药物而不引起毒性。

发明的描述

本发明涉及丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)抑制剂用于预防和延迟遗传 性视网膜变性，即色素性视网膜炎的用途，并涉及基于脂类纳米球的、含 有SPT抑制剂的组合物。

丝氨酸棕榈酰转移酶抑制剂的实例包括多球壳菌素和在下列目录参考 文献中说明的化合物。

Sasaki，S.等，J.Antibiot.47：420-33(1994)描述了mycestericins(与多 球壳菌素结构性相关的化合物)作为SPT抑制剂。

VanMiddlesworth F.，等，J.Antibiotics 45：861-7(1992)描述了另一类 有效的SPT抑制剂，鞘氨酸抗菌素(sphingofungins)。

其他的SPT抑制剂包括环丝氨酸、D-丝氨酸、绿黄菌素(viridiofungin) A和脂黄霉素。

US 20080249274描述了通过施用多球壳菌素治疗动脉粥样硬化的方 法。

WO 2005092325描述了多球壳菌素用于制备用于治疗哺乳动物中高 甘油三酯血症的药物的用途。

WO 2008046071描述了具有SPT调控活性的化合物，用于治疗胰岛 素耐受、心血管病症、代谢综合征和炎性病症。

WO 2008083280描述了作用于SPT的化合物，用于治疗胰岛素耐受、 胰腺β细胞凋亡、肥胖、心血管病症、脂代谢紊乱(dyslipidaemias)和脆 性X综合征。

WO 2004039351描述了适合眼科领域使用的、含有脂类纳米微粒的药 物组合物。

更特别的是，本发明涉及多球壳菌素用于预防和延迟遗传性视网膜变 性，即色素性视网膜炎的用途，以及基于负载了多球壳菌素的脂类纳米球 的组合物。

多球壳菌素是真菌来源的天然化合物，可溶于(细胞)膜并能够自由 的渗透细胞，具有对丝氨酸棕榈酰转移酶的抑制作用。

多球壳菌素的施用诱导对神经酰胺的从头合成的抑制，神经酰胺是鼠 RP模型中存在的鞘脂。

已发现在视网膜施用的多球壳菌素能够直接作用于光受体的代谢通 路，选择性抑制在遗传性视网膜变性病症的光受体细胞死亡过程中激活的 代谢通路，因而部分的抑制受累于RP的光受体的死亡。

然而，应该注意到多球壳菌素对正常细胞没有作用，也没有不利。该 化合物因而可用于延迟色素性视网膜炎中的光敏感性视网膜细胞的进行性 变性过程，从而延长受累于所述病症的对象的可用视觉期。因为这是一种 缓慢的进行性病症，因此延迟，即使是部分的延迟都涉及受累对象的视觉 性能的可观的改善，从而改善了他/她的生活质量。

已发现，在实验动物体内施用多球壳菌素导致视网膜光受体的选择性 改变，使其存活延长，并观察到这些细胞变性速率的同时减少。

此外，用视网膜电描记术法测量，观察到增加的视网膜视觉性能。

多球壳菌素治疗抑制了视网膜细胞死亡的活性过程，无视导致该过程 的突变。这是所用方法的巨大优势，因为RP治疗涉及的主要困难是由于 它的大的遗传异质性。

实验部分

在rd10突变小鼠模型中进行设计探讨多球壳菌素治疗RP的功效的研 究。该小鼠体现了视杆细胞特异性磷酸二酯酶基因的β亚基的错义突变， 并模拟了常染色体隐性的人RP形式。视杆细胞死亡开始于生活史的约第 12天(P12)，峰值在P24，如这样的事实所证实的，所述事实是视杆细 胞产生的ERG(视网膜电图)可以记录至P25。关于视网膜视锥细胞的死 亡，反应在P45消失。

视杆细胞变性体现了凋亡的特征。

使用基于生物化学、形态学和电生理学的多学科方法，在rd10突变小 鼠中建立了光受体死亡作为通过鞘脂信号传导的目标，并获得下列结果：

A.内源性神经酰胺水平

在从各年龄组的麻醉的rd10突变和野生型(wt)小鼠中分离视网膜后， 测试鞘脂内源性神经酰胺的水平。处理分离的视网膜进行脂类抽提，用二 酰甘油激酶测试来确定总内源性神经酰胺/无机磷酸盐的比例。发现在大量 的光受体变性之时，rd10突变小鼠的视网膜中的内源性神经酰胺水平增 加，并且在所有的测试年龄都保持恒定的升高。相反，在具有相同的遗传 背景的野生型(wt)对照动物中，在整个视网膜成熟后，视网膜神经酰胺 的水平不发生改变。

这些结果表示，神经酰胺在影响光受体的凋亡过程中扮演了病因性的 角色，导致光受体死亡。因此，已知将进行性变性的剩余视网膜细胞(例 如，视锥细胞、双极细胞和水平视杆细胞)也将由于神经酰胺依赖性过程 而死亡。

B.多球壳菌素治疗后的内源性神经酰胺水平的降低

向P19龄的rd10和wt小鼠的右眼施用单次玻璃体内注射500纳升多 球壳菌素(188mM)。在同一动物的左眼只注射载体(DMSO)。在P21 分离左右视网膜，如上所述分别处理进行生物化学的神经酰胺测试。

因此在用多球壳菌素处理的rd10小鼠的眼中发现比对照眼中显著更 低的神经酰胺水平。该神经酰胺水平的降低对应于rd10突变小鼠中致密型 (濒死)光受体数量的显著降低，根据下列定量的形态学方法证实。

相反，多球壳菌素注射没有显著降低wt小鼠中的视网膜神经酰胺水 平。

C.致密型光受体计数

在P21收集P19时注射的动物，摘出其眼睛并固定。分离左右视网膜， 用荧光DNA结合分子染色，放于玻片上。沿着视网膜的四条子午线以相 等的间隔在共聚焦显微镜下对含有光受体核的外核层采样。图像输出到计 算机工作站，对每个扫描视野中的致密型光受体计数。计算每对治疗的和 对照的视网膜的致密型光受体的总数。

发现多球壳菌素注射降低了光受体死亡率约50％(使用的rd10小鼠 n＝17，注射和计数了34只眼睛)。在仅用DMSO处理的视网膜中的致密 型光受体的评估数仍然落入用于其他研究的未治疗rd10小鼠的视网膜中 之前观察到的相同范围内。

D.组织学观察

从组织学的观点看，观察到用多球壳菌素注射的rd10和wt小鼠都呈 现出正常的视网膜形态。此外，经过与其他相类似注射的、在神经节细胞 中含GFP(绿色荧光蛋白)的小鼠(Thy 1-GFP小鼠)的视网膜表现出优 秀的维持了神经节细胞的形态和结构，且视网膜的分层整体良好。

E.毒性研究

在上文示例的研究之前和过程中进行的对照实验证实，眼内注射多球 壳菌素没有对rd10或wt小鼠产生副作用。应该注意到，迄今为止，多球 壳菌素极少在体内使用，并从未眼内注射过。剂量是基于可获得的关于培 养细胞的文献而选定的，由于玻璃状液，计算7/8倍的稀释度。出于阻止 大部分光受体进入凋亡周期的关键性原因，眼内施用的所选择的时间窗是 在凋亡性光受体的死亡峰值之前。最后，在这样的事实的基础上排除了毒 性效应，所述事实是在处理的动物中没有观察到普遍的或局部的炎症应答 症状(例如巨噬细胞侵入)或增加的眼部反应。

F.光受体的功能恢复

通过记录瞬间的视网膜电图(ERG)研究光受体的功能恢复，这是普 遍用于测试人类患者的视网膜生理学的技术，所述患者特别是患RP的患 者。

在两组如上所述眼内注射的rd10小鼠中，相比用载体注射的另一眼 睛，用多球壳菌素注射的眼中的ERG应答/反应没有呈现出恢复，提示用 单次注射施用的多球壳菌素的剂量太低，不足以在光受体对光的显著反应 中产生可检测的改变。即使重复的玻璃体内注射多球壳菌素，也没用建立 起适合小鼠眼睛的小尺寸的规程(同样地小鼠约P19)：重复的全麻和眼 内注射分别涉及动物的高死亡风险和出现白内障的高风险。

因此开发了多球壳菌素施用的新型非侵入性方法，基于使用脂类纳米 球。这些是由脂类组成的颗粒，具有优选在40和240纳米之间的平均直径， 根据EP 526666和WO 2004039351生产。使用所述制剂的结果是能够将脂 类纳米球负载多球壳菌素，获得水性分散体，其浓度与用于眼内注射的浓 度相当。

首先评估了荧光纳米球到达眼内部的能力，所述纳米球负载了荧光染 料且未负载活性成分(空的)。基于用共聚焦显微镜观察，发现在眼表面 施用这类纳米球24小时后，荧光颗粒高度浓缩在视网膜上，尤其是与色素 上皮的界面上。

将负载了浓度为0.27mg/mL的多球壳菌素的脂类纳米球施用于rd10 突变小鼠的幼崽。当它们的眼睛睁开(P14)时，将每只幼崽分为2组： 第一组以每天眼用药水的形式接受负载了多球壳菌素的纳米球(每只眼睛 750纳升)，第二组接受未负载(空的)的纳米球，使用相同的化学制剂 但不含多球壳菌素。从P21天起(该突变体中可记录的ERG最大时的年 龄)，采用ERG记录来评估光受体的可能的功能恢复，并持续至P30。在 未治疗的rd10动物中，此年龄时由视杆细胞诱导的ERG已消失。在用负 载了多球壳菌素的纳米球治疗的rd10动物中，特别在P24(光受体的死亡 峰值)和P28-P30间隔观察到药物的治疗效果。在该后一年龄，相比对照 组，在用多球壳菌素治疗的动物中持续清楚的视锥细胞诱导的应答。

在ERG总体消失的时间后，rd10突变小鼠中持续视锥细胞诱导的应 答是非常重要的结果。人RP患者的剩余的视觉是基于视锥细胞的，所述 细胞在视杆细胞死亡后是无情地注定会死亡的。

在ERG记录后，摘出动物的眼睛，固定并切片，用荧光核染料染色 视网膜切片，用于评估外核层(ONL)的厚度和视网膜的整体形态学。

图1a显示了从中获得ERG的同一视网膜的组织切片。

从两只年龄P24的rd10小鼠获得了对增加强度的光的闪烁的ERG应 答。较大的灰色痕迹是来自一只MYR-SLN(多球壳菌素-固体脂类纳米球) 处理小鼠的应答，同时黑色痕迹是来自对照动物的。

在多球壳菌素治疗的小鼠中，ONL中保留的核带(nuclear row)的数 目显著高于对照小鼠。

图1b中给出了在MYR-SLN和U-SLN(未负载固体脂类纳米球)处 理的小鼠的ONL中的平均核带数的定量分析。

显示了从一群年龄为P21-P35的rd10小鼠中获得的暗视ERG应答的 图。正值表示ERG的b波，而负值表示a-波振幅。在时间窗P27-P35中， 以MYR-SLN处理的小鼠(灰色图)显示出更好的a-波应答(^＊：p＜0.05； Wilcoxson-Mann-Whitney测试)。

图1c显示了来自2只SLN处理的小鼠的视网膜垂直切片，从所述小 鼠中记录了左侧的ERG痕迹。MYR-SLN处理动物中的光受体带 (photoreceptor row)的数目高于对照中的，表示增加的存活。

图1d中，T测试分析显示了在P24-P30时间间隔中，在MYR-SLN 处理的视网膜中，光受体核带的数目更高。

因此，以脂类纳米球形式持续施用多球壳菌素构建了保护色素性视网 膜炎中光受体免受进行性变性的非侵入性方式。

G.讨论

上述结果证实，通过抑制神经酰胺的从头生物合成，降低视网膜的神 经酰胺水平，可以降低光受体的凋亡性死亡速率。

所获得的结果因而证实了在施用多球壳菌素后，可以维持光受体变性 的降低。因此，使用根据本发明的多球壳菌素可被认为是帮助保持光受体 (否则注定死亡的光受体)存活更长时间的有效治疗对策。

考虑这一事实是特别有趣的，所述事实是中等侵犯性的(aggressive) 表型和rd10突变小鼠的典型视网膜结构的维持鉴别出患隐性磷酸二酯酶 突变的患者，作为基因治疗的潜在候选对象。

一般还认为视杆细胞存活速率的少量增加可能导致成比例更长的视锥 细胞活力。

关于推荐的治疗用途，根据本发明的组合物可优选的如上述配制成供 局部眼睛施用的脂类纳米球形式，构成本发明的一个方面。如上所述，制 备所述纳米球的方法公开在EP 526666和WO 2004039351中。

根据本发明的组合物还可以配制成适合局部眼睛施用的其他方式，例 如供眼部使用的眼用药水或注射液的形式，如玻璃体内的、结膜下的、房 内或眼球后的注射，允许的条件下可使用合适的赋形剂，并可根据药物技 术领域普遍已知的常规方法来制备，例如在“Remington’s Pharmaceutical  Handbook”，Mack Publishing Co.，N.Y.，USA中公开的方法。