一种siRNA 转染哺乳类动物胚胎的电穿孔方法

摘要

本发明公开了一种siRNA转染胚胎的电穿孔方法，包括以下步骤：1)对胚胎透明带进行弱化处理；2)配制含siRNA的电穿孔溶液；3)将胚胎移入配制好的含siRNA的电穿孔溶液，室温静置，然后再将胚胎连同电穿孔溶液移入电转槽中进行电穿孔。本发明包括对胚胎的透明带的弱化处理和siRNA的络合处理，然后通过将胚胎置于脉冲电场作用下，导致其通透性和膜电导瞬时增大，使在正常生理情况下细胞膜难以通透的siRNA进入细胞。统计学观察分析表明，本发明存活胚胎稳定阳性转染率超过95％，采集的总胚胎实际有效利用率超过70％，是一种安全、简便、高效的siRNA转染哺乳类动物胚胎的技术。

说明书

技术领域

本发明属于胚胎转染领域，涉及siRNA介导的RNA干扰，特别涉及一种siRNA转染哺乳类动物胚胎的电穿孔方法。 

背景技术

近些年由siRNA(small interfering RNA)介导的RNA干扰(RNAi)已经逐渐成为研究基因功能的有力工具。传统的将siRNA转导至细胞中的方法有病毒介导法，显微注射法。病毒介导法可用于难转染的细胞，但要求细胞需处于分裂期，且存在安全问题。显微注射法是可以实现准确的转染，但需要昂贵的显微操作仪器，且操作复杂，对胚胎的创伤较大，转染数量也有限。因此寻找一种安全，简便，高效的胚胎转染方法成为当前胚胎学研究领域急需解决的问题。 

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种siRNA转染胚胎的电穿孔方法，实现对胚胎进行安全、简便、高效的siRNA的转染。 

本发明是通过以下技术方案来实现： 

1、一种siRNA转染胚胎的电穿孔方法，包括以下步骤： 

1)将待转染的胚胎置于台氏液中，室温孵育5～15s，然后终止消化并清洗； 

2)以opti-MEM为电转缓冲液进行稀释，用稀释好的待转染siPORT^TM与siRNA按摩尔比1∶1～2混合后室温静置10～15min，得到含有siRNA的电穿孔溶液，其中siRNA的终浓度为0.1～1μmol/L； 

3)将胚胎置于含有siRNA的电穿孔溶液，在脉冲电场下，利用电穿孔法对胚胎进行siRNA转染。 

所述的将胚胎在进行台氏液处理之前，还对胚胎用PBS-PVA溶液清洗， 所述的PBS-PVA溶液为含有体积浓度为0.2～0.5％PVA的PBS溶液。 

所述的终止消化是将胚胎从台氏液转移到含血清的胚胎体外操作液中终止消化，然后将胚胎用opti-MEM溶液清洗。 

所述的siRNA为进行了荧光标记的siRNA。 

所述的电穿孔法进行siRNA转染的参数控制为：电压20V～40V；脉冲时间1～2ms；脉冲次数3～4次。针对小鼠胚胎进一步优化为：电压30V，脉冲时间1ms，脉冲次数3次。 

所述的电穿孔完成后，将胚胎清洗并转移入提前平衡至少30min的胚胎培养液中培养。 

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果： 

本发明提供的siRNA转染哺乳动物胚胎的电穿孔方法，首先对胚胎透明带结构使用台氏液进行弱化处理，然后再将处理后的胚胎置于脉冲电场作用下，细胞膜脂双层上形成瞬时微孔，导致其通透性和膜电导瞬时增大，可以使在正常生理情况下细胞膜难以通透的siRNA进入细胞。而如果不对透明带进行弱化处理，低电压不容易穿透透明带，高电压又会使胚胎的死亡率增加。因此对胚胎透明带的消化处理，尤其是消化时间的控制是转染的关键一步。 

其次使用siPORT^TM和siRNA进行结合，siPORT^TM能够与siRNA形成络合物，在出现电穿孔的瞬时微孔时，促进siRNA高效得进入胚胎。 

为了进一步观察或跟踪转染效果，还可以对待转染的siRNA进行荧光标记，这样在电穿孔转染后通过荧光显微镜可以直观的观察。 

通过荧光倒置显微镜对胚胎进行统计学观察分析表明，本发明存活胚胎稳定阳性转染率约为95％，采集的总胚胎实际有效利用率超过70％，为采用由siRNA介导的RNA干扰技术研究基因在胚胎中的功能提供了有效的转染方法。 

附图说明

图1为小鼠受精卵透明带经不同消化时间，电穿孔转染Cy3标记的阴性对照siRNA后，胚胎在相同曝光时间(200ms)下的红色荧光水平； 

图2为应用本发明转染小鼠不同发育时期胚胎的显微照片。 

具体实施方式

本发明提供一种siRNA转染胚胎的电穿孔方法，尤其适用于哺乳类动物的胚胎转染，包括对胚胎的透明带的弱化处理和siRNA的络合处理。下面结合具体的电穿孔过程和转染结果对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。 

所述的siRNA转染是基于siRNA通过胚胎透明带和细胞膜在脉冲电场下形成的瞬时微孔进入胚胎，是一种生物物理的转染方法，所以待转染的胚胎并无特殊的种属要求。由于形态结构差异较大的胚胎进行电穿孔时的透明带弱化时间和电穿孔参数可能会有一些差别，然而本领域技术人员是能够通过本专利所提供的方法进行很少次数的实验从而对于这些具体的参数进行筛选和优化，即可确定相应胚胎的最优参数，完成胚胎转染。 

下面具体以哺乳类动物特别是小鼠胚胎作为实施对象，详细说明siRNA转染哺乳类动物胚胎的电穿孔方法，此类胚胎形态差异小，透明带结构成分相似，因此转染条件和电穿孔参数设置变化不大。 

siRNA转染小鼠胚胎的电穿孔方法，包括以下步骤： 

首先对小鼠胚胎进行透明带弱化的预处理： 

a、将采集的小鼠胚胎在PBS-PVA溶液中转移3-5次，每次更换新的溶液；所述的PBS-PVA溶液为含有体积浓度为0.2％PVA(polyvinyl alcohol，聚乙烯醇)的PBS溶液； 

b、将小鼠胚胎转移到台氏液(Sigma，美国)中于室温静置10s，进行透明带弱化处理；而对于弱化处理的时间的选择，后续以对照实验数据来进一步说明； 

c、计时结束后立即将胚胎转移到小鼠胚胎体外操作液Hepes-KSOM溶液中终止消化； 

100ml Hepes-KSOM工作液配方为：NaCl，0.5552g；KCl，0.0186g；KH₂PO₄，0.0047；D-葡萄糖，0.0036；NaHCO₃，0.0336g；丙酮酸钠，0.0022g；L-谷氨酰胺，0.0146g；EDTA-Na₂，0.0014g；CaCl·2H₂O，0.0250g；MgSO₄，0.0024g；HEPES，0.2384g；必需氨基酸(EAA，invitrogen，50×)，2ml；非必需氨基酸(NEAA，invitrogen，100×，1ml；60％乳酸钠，350μl；牛血清白蛋白(BSA)，0.6g； 

d、将胚胎在opti-MEM(Invitrogen，美国)溶液中转移3-5次，每次更换新的溶液，完成电穿孔前对胚胎的预处理。 

完成对胚胎的预处理之后，对胚胎进行电穿孔，具体操作包括以下步骤： 

1)配制包含Cy3标记的siRNA(#AM4621，ambion，美国)的电穿孔溶液：以opti-MEM为电转缓冲液进行稀释(用opti-MEM将siPORT^TM与siRNA稀释到合适的浓度)，将稀释后的siPORT^TM与稀释siRNA的按摩尔比1∶1～2混合，室温静置10min；稀释的siRNA为50μl opti-MEM加5μl siRNA，稀释的siPORT^TM(#AM4502，introgen，美国)为50μl opti-MEM加3μlsiPORT^TM，电穿孔溶液中最终siRNA稀释浓度为0.5μmol/L；由于不同siRNA发挥干扰功效的浓度不尽相同，所以在进行siRNA浓度的稀释时要根据具体情况调整稀释倍数； 

为了便于观察siRNA转染胚胎后的情况，因此将其用荧光标记Cy3进行标记，而所选用的siRNA是一种阴性对照siRNA，它是由19bp随机序列组成，与已知的小鼠，大鼠和人基因组无同源性，因此转入胚胎后对胚胎的正常发育不会造成影响。 

由于采用的siRNA为Cy3荧光标记的siRNA，因此稀释和电穿孔过程都需要尽量避光，以免造成荧光萃灭，而当不需要对siRNA进行荧光标记时，那么就不用避光操作。 

2)将预处理完成的胚胎移入配制好的含Cy3标记的siRNA的电穿孔溶液，此步骤要求尽可能少吸液体，以免稀释配制好的电穿孔溶液，胚胎移入后室温避光孵育1～3min，这会使siRNA附着于胚胎表面，利于电穿孔过程中微孔产生时siRNA的进入，但是长时间暴露在环境中容易造成siRNA的降解，并且胚胎在室温环境下过长时间对胚胎发育的不利影响是显著的，因此孵育时间不宜过长； 

3)将胚胎连同电穿孔溶液移入电转槽中(电极间距为1mm)，使用电穿孔仪(ECM 2001Electro Cell Manipulator，BTX，美国)进行电穿孔，电穿孔参数为电压20～40V；脉冲时间1～2ms；脉冲次数3～4次；经过分组实验对参数进行优化，得到针对小鼠胚胎的最优电穿孔参数为电压30V；脉冲时间1ms；脉冲次数3次； 

4)电穿孔完成后，从电转槽中转移胚胎至Hepes-KSOM中清洗，转移3-5次，每次更换新的溶液； 

5)将清洗后胚胎移入提前平衡至少30min的KSOM培养液中培养观察，进行后续干扰检测实验。100ml KSOM培养液配方如下：NaCl，0.5552g；KCl，0.0186g；KH₂PO₄，0.0047g；D-葡萄糖，0.0036g；NaHCO₃，0.21g；丙酮酸钠，0.0022g；L-谷氨酰胺，0.0146g；EDTA-Na₂，0.0014g；CaCl·2H₂O，0.0250g；MgSO₄，0.0024g；必需氨基酸(EAA，Invitrogen，50×)，2ml；非必需氨基酸(NEAA，Invitrogen，100×，1ml；60％乳酸钠，350μl；牛血清白蛋白(BSA)，0.6～0.8g。 

为了更好的说明电穿孔转染胚胎的结果，具体结合统计数据和附图对转染效果进行说明。 

透明带消化时间对电穿孔效率的影响： 

按照上述转染方法，以消化0s作为对照，以转染效果为评价指标，对消化10s、20s、30s实验组进行统计分析，具体的结果如表1所示： 

表1 透明带消化时间对电穿孔效率的影响 

统计学分析采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)，不含相同小写字母上标的数据间具有显著性差异，p＜0.05。 

数据显示在台氏液中消化30s后，胚胎存活率显著下降，未经消化的胚胎存活率很高，但是荧光观察转染后的荧光照片(图1)表明透明带未经弱化处理的胚胎进行电穿孔时，siRNA在透明带上形成聚集颗粒，极少进入胚胎细胞内，消化10s与20s胚胎的阳性转染率无显著差异，但是消化20s胚胎存活率低于消化10s实验组，且差异显著，从而确定消化5～15s为较优时间，10s为最佳时间。 

图1为小鼠胚胎透明带经不同消化时间后电穿孔转染Cy3标记的siRNA后胚胎在相同曝光时间(200ms)下的红色荧光水平。横向并排的三张图片，第一张为明场下的胚胎，第二张为红色荧光照片，第三张为明场下胚胎和荧光胚胎合并的结果；纵向分别为处理0s、10s、20s、30s的结果。图1直观显示了siRNA进入胚胎的实际情况，说明对胚胎透明带的适当弱化处理之后，siRNA进入胚胎明显得到提升。 

图2为应用本发明转染小鼠不同时期胚胎的荧光显微照片；横向并排的三张图片，第一张为明场下的胚胎，第二张为红色荧光照片，第三张为明场下胚胎和荧光胚胎合并的结果；纵向为不同发育时期胚胎，从上到下依次为2细胞胚胎、4细胞胚胎、8细胞胚胎、桑椹胚和囊胚。结果显示，在不同时期 的胚胎转染都达到了良好的转染效果。 

siRNA介导的RNA干扰技术可以实现在实验计划时间段内，对基因转录的mRNA进行特异性降解，进而监测干扰后胚胎发育形态学变化和mRNA或者蛋白质水平的变化。本发明为采用由siRNA介导的RNA干扰技术研究基因在胚胎中的功能提供了有效的转染方法。