制备聚乙二醇化碱性成纤维细胞生长因子的方法

摘要

本发明属于蛋白质修饰领域，具体而言，本发明提供了在色谱柱上制备聚乙二醇化碱性成纤维细胞生长因子（PEG-bFGF）的方法，其包括，将bFGF溶液上样于肝素-Sepharose亲和层析柱；用mPEG-丁醛溶液在避光状态下冲洗；用低盐缓冲液洗去杂质；用高盐缓冲液洗脱，收集含PEG-bFGF的流出液；将获得的流出液上样于分子筛层析柱，并用低盐缓冲液洗脱，收集含PEG-bFGF的流出液；和将获得的流出液上样于阳离子交换层析柱，收集用含NaCl的缓冲液洗脱的流出液。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质修饰制备领域，具体而言，本发明涉及完全在色谱柱上制备碱性成纤维细胞生长因子的方法。 

背景技术

碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）是FGF家族的一个成员，是一种来源于中胚层及神经外胚层的细胞因子，在人体组织包括皮肤、血管、神经纤维、骨组织和软骨组织等细胞上含有丰富的受体，具有广泛的促进生长等方面的活性，它可以促进血管内皮细胞、表皮细胞、软骨细胞和神经纤维等细胞的生长，在临床上具有巨大的应用价值。 

但大量研究和临床实践表明，bFGF在体内作用的发挥需持续长时间与靶细胞受体结合，但bFGF存在稳定性差、体内半衰期短以及存在免疫原性等缺陷日益成为制约bFGF药物广泛应用的工程化瓶颈问题。因此可以通过聚乙二醇（PEG）化来提高bFGF稳定性、延长其体内半衰期。 

常规的聚乙二醇化bFGF是在液相环境中使得PEG与bFGF缀合，然后通过诸如色谱柱等纯化。在缀合过程中，液相条件不太稳定，容易在修饰过程中使蛋白失去活性，形成二聚体等，而且PEG-bFGF本身的层析峰较品平缓而且保留时间较短，这些多聚化的PEG-bFGF也会存在于这些峰中从而影响均一性；修饰位点不好控制，容易形成随机、多位点修饰，结果导致产物不均一性能不稳定；分离纯化比较困难：往往需要多个步骤才能将单位点修饰产物和多位点修饰的产物分离开。 

为此，本发明人经过大量研究，从众多的修饰和纯化的步骤和材料中选择并组合出了完全在色谱柱上修饰碱性成纤维细胞生长因子并纯化的方法，可以节约液相缀合步骤，而且所有步骤和材料均与该方法相适应，从而使得该方法能够得以实现。该bFGF经固相PEG修饰后得到的产物均一性好、分离纯化工艺简单，且修饰产物不但保留了很好的生物学活性，同时其热稳定性和抗酶解能力显著提高、体内半衰期显著延长、免疫原性低显著降低，从而可以推广产业化。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供完全在色谱柱上修饰碱性成纤维细胞生长因子并纯化的方法。 

       具体而言，本发明提供了在色谱柱上制备聚乙二醇化碱性成纤维细胞生长因子（PEG-bFGF）的方法，其包括， 

（1）将bFGF溶液上样于肝素-Sepharose亲和层析柱；

（2）用mPEG-丁醛溶液在避光状态下冲洗肝素-Sepharose亲和层析柱；

（3）用低盐缓冲液洗去肝素-Sepharose亲和层析柱中的杂质；

（4）用高盐缓冲液对肝素-Sepharose亲和层析柱洗脱，收集含PEG-bFGF的流出液；

（5）将步骤（4）获得的流出液上样于分子筛层析柱，并用低盐缓冲液洗脱，收集含PEG-bFGF的流出液；和

（6）将步骤（5）获得的流出液上样于阳离子交换层析柱，收集用含NaCl的缓冲液洗脱的流出液。

优选本发明的方法，其中步骤（5）中的分子筛层析柱是Sephadex G-25层析柱。 

优选本发明的方法，其中步骤（6）中的阳离子交换层析柱是SP-Sepharose阳离子交换层析柱。 

优选本发明的方法，其中低盐缓冲液是10~30mM磷酸缓冲液，优选是20mM磷酸缓冲液。 

进一步优选本发明的方法，其中高盐缓冲液是含1.5~2.5M NaCl的10~30mM磷酸缓冲液，优选是含2M NaCl的20mM磷酸缓冲液。 

进一步优选本发明的方法，其中含NaCl的缓冲液中NaCl含量是200~500mM，优选是350mM。 

进一步优选本发明的方法，其中bFGF和mPEG-丁醛的摩尔比范围介于1：1.25-1：30，如1：2.5、1:5、1:10、或1:20，优选是1：10。 

进一步优选本发明的方法，其中步骤（2）中冲洗的时间为100~600分钟，优选为200~400分钟。同时优选步骤（2）的pH介于4.5-8.5，如5、6、6.5、7、或8，最优选是6.0-6.5。 

进一步优选本发明的方法，其中步骤（2）中冲洗的温度为1~35℃，优选是4~25℃。 

进一步优选本发明的方法，其中mPEG的分子量为10~80kDa，优选是20kDa。 

本发明的有益效果包括，获得一种高效的蛋白定点修饰方法和便捷的修饰产物分离纯化工艺，蛋白的修饰产率超过60%，纯化工艺不超过三步且纯度超过90%；修饰产物相比修饰前蛋白其生物学活性保存率不低于80%，修饰产物稳定性显著改善、体内半衰期显著延长、免疫原性显著降低等。 

附图说明

图1表示本发明的固相PEG化反应方法得到的产物;

图2表示用现有技术在液相条件下进行PEG化反应后得到的产物的SDS-PAGE电泳分析图。

图3显示了检测实施例1的各个SP-Sepharose阳离子交换层析柱洗脱峰的之外检测图谱。 

图4为实施例1-5最终收集到的产物的SDS-PAGE电泳分析图。 

图5显示了实施例1中制备得到的聚乙二醇化bFGF（PEG-bFGF，三角）和收集的未修饰的bFGF（bFGF，方块）与市售的bFGF标准品（bFGF标准品，圆）对3T3细胞的促增值作用的结果图。 

图6显示了本发明的PEG-bFGF在大鼠血清中热稳定性能够显著提高。 

图7显示了本发明的PEG-bFGF的抗胰蛋白酶解能力显著提高。 

具体实施方式

以下将以实施例以人bFGF和20kDa mPEG-丁醛来举例说明，如有未尽之处，可以参考《色谱分析概论》（化学工业出版社，2005）等手册或教科书。

实施例1制备聚乙二醇化bFGF的过程

将10mg的bFGF以20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）溶解制成蛋白浓度为1mg/ml的溶液，然后将该溶液上样于柱体积为2ml的肝素-Sepharose亲和层析柱（可购自GE Healthcare公司），控制流速为0.5ml/min。

上样完后，以20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）配制mPEG-丁醛溶液，mPEG-丁醛的浓度为10mg/ml，将该mPEG-丁醛溶液作为流动相，以0.01ml/min的流速冲洗肝素-Sepharose亲和柱，柱温维持为室温，同时将肝素-Sepharose亲和柱用锡箔纸包裹以避光，持续冲洗200分钟。 

之后，将流动相换成20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）继续冲洗肝素柱，以1ml/min的流速冲洗20分钟。 

然后，用含2M NaCl的20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）以1ml/min的流速洗脱肝素-Sepharose亲和层析柱，收集聚乙二醇化bFGF所对应的洗脱峰（可以在对照组中将聚乙二醇化bFGF直接上样洗脱以显示洗脱峰的位置）的流出液。 

再将上述流出液上样于柱体积为100ml的Sephadex G-25层析柱（可购自GE Healthcare公司），然后用20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）以1ml/min的流速洗脱除盐，收集聚乙二醇化bFGF所对应的洗脱峰（可以在对照组中将聚乙二醇化bFGF直接上样洗脱以显示洗脱峰的位置）的流出液。 

然后，将上述流出液上样于柱体积为1ml的SP-Sepharose阳离子交换层析柱（可购自GE Healthcare公司），用含0-2mM NaCl的20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）以1ml/min的流速梯度洗脱阳离子交换柱，收集其中以含350mM NaCl的20mM磷酸缓冲（pH 6.5）洗脱的峰，即得到聚乙二醇化bFGF。 

实施例2 以低PEG浓度制备聚乙二醇化bFGF的过程

将10mg的bFGF以20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）溶解制成蛋白浓度为1mg/ml的溶液，然后将该溶液上样于柱体积为2ml的肝素-Sepharose亲和层析柱（可购自GE Healthcare公司），控制流速为0.5ml/min。

上样完后，以20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）配制mPEG-丁醛溶液，mPEG-丁醛的浓度为5mg/ml，将该mPEG-丁醛溶液作为流动相，以0.01ml/min的流速冲洗肝素-Sepharose亲和层析柱，柱温维持为室温，同时将肝素-Sepharose亲和层析柱用锡箔纸包裹以避光，持续冲洗200分钟。 

之后，将流动相换成20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）继续冲洗肝素-Sepharose亲和层析柱，以1ml/min的流速冲洗20分钟。 

然后，用含2M NaCl的20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）以1ml/min的流速洗脱肝素-Sepharose亲和层析柱，收集聚乙二醇化bFGF所对应的洗脱峰（可以在对照组中将聚乙二醇化bFGF直接上样洗脱以显示洗脱峰的位置）的流出液。 

再将上述流出液上样于柱体积为100ml的Sephadex G-25层析柱（可购自GE Healthcare公司），然后用20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）以1ml/min的流速洗脱除盐，收集聚乙二醇化bFGF所对应的洗脱峰（可以在对照组中将聚乙二醇化bFGF直接上样洗脱以显示洗脱峰的位置）的流出液。 

然后，将上述流出液上样于柱体积为1ml的SP-Sepharose阳离子交换层析柱（可购自GE Healthcare公司），用含0-2mM NaCl的20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）以1ml/min的流速梯度洗脱阳离子交换柱，收集其中以含350mM NaCl的20mM磷酸缓冲（pH 6.5）洗脱的峰，即得到聚乙二醇化bFGF。 

实施例3 以流加PEG的低速度制备聚乙二醇化bFGF的过程

将10mg的bFGF以20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）溶解制成蛋白浓度为1mg/ml的溶液，然后将该溶液上样于柱体积为2ml的肝素-Sepharose亲和层析柱（可购自GE Healthcare公司），控制流速为0.5ml/min。

上样完后，以20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）配制mPEG-丁醛溶液，mPEG-丁醛的浓度为10mg/ml，将该mPEG-丁醛溶液作为流动相，以0.005ml/min的流速冲洗肝素-Sepharose亲和层析柱，柱温维持为室温，同时将肝素-Sepharose亲和层析柱用锡箔纸包裹以避光，持续冲洗400分钟。 

之后，将流动相换成20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）继续冲洗肝素-Sepharose亲和层析柱，以1ml/min的流速冲洗20分钟。 

然后，用含2M NaCl的20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）以1ml/min的流速洗脱肝素-Sepharose亲和层析柱，收集聚乙二醇化bFGF所对应的洗脱峰（可以在对照组中将聚乙二醇化bFGF直接上样洗脱以显示洗脱峰的位置）的流出液。 

再将上述流出液上样于柱体积为100ml的Sephadex G-25层析柱（可购自GE Healthcare公司），然后用20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）以1ml/min的流速洗脱除盐，收集聚乙二醇化bFGF所对应的洗脱峰（可以在对照组中将聚乙二醇化bFGF直接上样洗脱以显示洗脱峰的位置）的流出液。 

然后，将上述流出液上样于柱体积为1ml的SP-Sepharose阳离子交换层析柱（可购自GE Healthcare公司），用含0-2mM NaCl的20mM磷酸缓冲液（pH 6.5）以1ml/min的流速梯度洗脱阳离子交换柱，收集其中以含350mM NaCl的20mM磷酸缓冲（pH 6.5）洗脱的峰，即得到聚乙二醇化bFGF。 

实施例4 以流加低浓度PEG的低速度制备聚乙二醇化bFGF的过程

将10mg的bFGF以20mM磷酸缓冲液（pH 6.0）溶解制成蛋白浓度为1mg/ml的溶液，然后将该溶液上样于柱体积为2ml的肝素-Sepharose亲和层析柱（可购自GE Healthcare公司），控制流速为0.5ml/min。

上样完后，以20mM磷酸缓冲液（pH 6.0）配制mPEG-丁醛溶液，mPEG-丁醛的浓度为5mg/ml，将该mPEG-丁醛溶液作为流动相，以0.005ml/min的流速冲洗肝素-Sepharose亲和层析柱，柱温维持为室温，同时将肝素-Sepharose亲和层析柱用锡箔纸包裹以避光，持续冲洗400分钟。 

之后，将流动相换成20mM磷酸缓冲液（pH 6.0）继续冲洗肝素-Sepharose亲和层析柱，以1ml/min的流速冲洗20分钟。 

然后，用含2M NaCl的20mM磷酸缓冲液（pH 6.0）以1ml/min的流速洗脱肝素-Sepharose亲和层析柱，收集聚乙二醇化bFGF所对应的洗脱峰（可以在对照组中将聚乙二醇化bFGF直接上样洗脱以显示洗脱峰的位置）的流出液。 

再将上述流出液上样于柱体积为100ml的Sephadex G-25层析柱（可购自GE Healthcare公司），然后用20mM磷酸缓冲液（pH 6.0）以0.5ml/min的流速洗脱除盐，收集聚乙二醇化bFGF所对应的洗脱峰（可以在对照组中将聚乙二醇化bFGF直接上样洗脱以显示洗脱峰的位置）的流出液。 

然后，将上述流出液上样于柱体积为1ml的SP-Sepharose阳离子交换层析柱（可购自GE Healthcare公司），用含0-2mM NaCl的20mM磷酸缓冲液（pH 6.0）以1ml/min的流速梯度洗脱阳离子交换柱，收集其中以含350mM NaCl的20mM磷酸缓冲（pH 6.0）洗脱的峰，即得到聚乙二醇化bFGF。 

 实施例5 以低温制备聚乙二醇化bFGF的过程

将10mg的bFGF以20mM磷酸缓冲液（pH 6.0）溶解制成蛋白浓度为1mg/ml的溶液，然后将该溶液上样于柱体积为2ml的肝素-Sepharose亲和层析柱（可购自GE Healthcare公司），控制流速为0.5ml/min。

上样完后，以20mM磷酸缓冲液（pH 6.0）配制mPEG-丁醛溶液，mPEG-丁醛的浓度为10mg/ml，将该mPEG-丁醛溶液作为流动相，以0.01ml/min的流速冲洗肝素-Sepharose亲和层析柱，柱温维持为4℃，同时将肝素-Sepharose亲和层析柱用锡箔纸包裹以避光，持续冲洗200分钟。 

之后，将流动相换成20mM磷酸缓冲液（pH 6.0）继续冲洗肝素-Sepharose亲和层析柱，以1ml/min的流速冲洗20分钟。 

然后，用含2M NaCl的20mM磷酸缓冲液（pH 6.0）以1ml/min的流速洗脱肝素-Sepharose亲和层析柱，收集聚乙二醇化bFGF所对应的洗脱峰（可以在对照组中将聚乙二醇化bFGF直接上样洗脱以显示洗脱峰的位置）的流出液。 

再将上述流出液上样于柱体积为100ml的Sephadex G-25层析柱（可购自GE Healthcare公司），然后用20mM磷酸缓冲液（pH 6.0）以0.5ml/min的流速洗脱除盐，收集聚乙二醇化bFGF所对应的洗脱峰（可以在对照组中将聚乙二醇化bFGF直接上样洗脱以显示洗脱峰的位置）的流出液。 

然后，将上述流出液上样于柱体积为1ml的SP-Sepharose阳离子交换层析柱（可购自GE Healthcare公司），用含0-2mM NaCl的20mM磷酸缓冲液（pH 6.0）以1ml/min的流速梯度洗脱阳离子交换柱，收集其中以含350mM NaCl的20mM磷酸缓冲（pH 6.0）洗脱的峰，即得到聚乙二醇化bFGF。 

实施例6 聚乙二醇化bFGF的纯度鉴定

用本发明的固相PEG化反应方法（即，本发明实施例1中自起始步骤至洗脱肝素-Sepharose亲和层析柱并收集聚乙二醇化bFGF所对应的洗脱峰的步骤）得到的产物与用现有技术在液相条件下进行PEG化反应后得到的产物进行SDS-PAGE电泳（分离胶12％，浓缩胶5％），采用卡马斯亮蓝法染色，观察纯度。结果如图1所示，其中图1在液相条件下进行PEG化反应后得到的反应液的图谱，其中M泳道为分子量标记，a泳道为修饰前的野生型bFGF，b~e泳道依次为PEG与bFGF以摩尔比为10：1、pH6.5条件下室温反应1h、2h、4h、8h的反应液，明显可以看出有多聚化的副反应产物产生；图2为本发明的固相PEG化反应方法得到的流出液的图谱，其中M泳道为分子量标记，f泳道为修饰前野生型bFGF，g泳道为肝素柱洗脱流出液。从图1和图2比较，可以发现液相修饰修饰率相对降低，如果通过延长时间来提高修饰产率则修饰条带出现多条，为非单一性修饰的副反应产物；而在色谱柱固相修饰不仅修饰产率高而且为单一修饰。

检测实施例1的各个SP-Sepharose阳离子交换层析柱洗脱峰并将上述实施例1-5最终收集到的产物进行SDS-PAGE电泳分析（分离胶12％，浓缩胶5％，采用卡马斯亮蓝法染色）。结果如图2所示，其中图3显示了实施例1中不同盐离子浓度下洗脱SP-Sepharose阳离子交换层析柱所对应的洗脱峰，峰1为含0.35M NaCl的洗脱液的洗脱峰（PEG化的bFGF），峰2为含1.0M NaCl洗脱液的洗脱峰（未修饰的bFGF），表明通过本发明的方法可以有效分离PEG化的bFGF和未修饰的bFGF，而且两者都可方便地收集（前者作为最终产品，后者可以循环参与反应）；图4为实施例1-5收集的最终产物的SDS-PAGE电泳分析图：a泳道为未修饰的bFGF，M泳道为分子量标记，b-f泳道依次为实施例1-5收集的最终流出液，g泳道为实施例1的未修饰的bFGF所对应的洗脱峰的浓缩液，表明本发明的方法可以在多种浓度、速度和温度的条件下进行而无显著区别，另外未修饰的bFGF所对应的洗脱峰含有的未修饰的bFGF纯度很高，因而无需纯化就可循环利用。 

实施例7 聚乙二醇化bFGF的促细胞增殖活性分析

活性测定采用常规的MTT 法。简而言之，将3T3 细胞转接于含10%小牛血清的1640培养液置于二氧化碳培养箱，37℃培养5d，用0.25%的胰酶消化培养瓶中的3T3细胞，再用含10%小牛血清的1640培养液稀释至细胞浓度为107～108 个/ml，加入96 孔细胞培养板中(100μl/孔)，37℃培养24h。换含0.4%小牛血清的1640 培养液(100μl/孔)，37℃继续培养24h，去板中培养液，依次加入150 μl待测样品(用含0.4%小牛血清的1640培养液稀释，按第1孔浓度为100ng/ml, 以下各孔依次4倍稀释)，37 ℃ 培养24h，每孔各加入MTT(5mg/mL)20μl，继续培养4h，去培养液，每孔加入二甲基亚砜100μl，室温放置30min，MK-3 酶标仪双波长(570、630nm)检测各孔样品的OD 值，分别与阴性对照(含0.4%小牛血清的1640 培养液)比较, 计算半数增长率(ED50)，再根据下列公式算出各样品的活性：样品效价=(样品ED50/标准品ED50)×标准品效价×样品稀释倍数结果表明，bFGF经PEG修饰后，实施例1-5收集到的聚乙二醇化bFGF的生物活性保存率均达到90%以上，其中实施例1制备的聚乙二醇化bFGF的生物活性与修饰前的野生型bFGF基本相似（见图3）。

实施例8 聚乙二醇化bFGF的热稳定性研究

取大鼠血液，4℃、8000 r/min离心，取上清制得大鼠血清，分别取含等物质量FGF-2和PEG-FGF-2各0.6 ml，与大鼠血清2.4 ml混匀，37℃保温；分别于2、4、8、24和48 h取样，– 20℃保存，以空白大鼠血清作为对照，采用上述实施例7描述的方法测定实施例1-5的PEG-bFGF生物活性，并以修饰前蛋白（bFGF）为对照，计算活性保存率。以实施例1获得的PEG-bFGF为例，结果如图4所示，可以显著提升活性保存率。

另取实施例1-5的PEG-bFGF以及bFGF在37℃保温96小时后，与未经过保温的bFGF比较，计算活性保存率。以实施例3制备的PEG-bFGF为例，活性保存率为61.7%；而未修饰的bFGF的活性保存率仅为23.4%。 

以上结果充分说明bFGF经过色谱柱固相化学修饰并纯化后在大鼠血清中热稳定性明显提高。 

实施例9 聚乙二醇化bFGF的抗酶解能力检测

分别取含等物质量的bFGF和实施例1制备的PEG-bFGF各0.5ml，与2 mmol/L胰蛋白酶溶液0.5ml混匀，最终蛋白与胰蛋白酶的物质量比为100 : 1，37℃保温，于0、1、5、10、15、20、40和60 min取混合样0.1 ml，立即与无血清RPMI 1640培养基混匀（样品体积：培养基体积 = 1 : 10），以终止胰蛋白酶的作用。

将处理后的各样品进行SDS-PAGE电泳分析，并将获得的凝胶采用凝胶扫描分析，观察蛋白质被胰蛋白酶的降解情况。结果如图5所示，表明保温20min后，修饰产物PEG-FGF-21的含量与酶解前相比仍然存留31.3%，而未修饰产物基本被完全降解，由此可见，bFGF经过色谱柱固相化学修饰并纯化后抗胰蛋白酶水解能力明显增加。