一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌

摘要

一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌，它涉及一株苏云金芽孢杆菌。它为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AH-2，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No：5220，保藏日期为2011年9月6日。本发明中苏云金芽孢杆菌AH-2，对鳞翅目和鞘翅目主要害虫及抗Bt及Cry1Ac毒蛋白害虫，均具有较强的毒杀作用，可以利用其生产高效、广谱的杀虫剂，用于防止鳞翅目重要害虫小菜蛾及鞘翅目害虫黄粉虫，同时对抗性害虫具有很好的效果，有利于田间抗性小菜蛾的防治。

说明书

技术领域

本发明涉及一株苏云金芽孢杆菌。

背景技术

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种从土壤或死亡昆虫体内分离出 来的革兰氏阳性细菌。此类菌在芽孢形成时期产生一种或多种杀虫晶体蛋白(Insecticidal  Crystal Proteins，ICPs，又被称为δ-内毒素)，可对鳞翅目、鞘翅目、半翅目、双翅目、同 翅目、膜翅目、直翅目、等翅目、毛翅目、脉翅目、蚤目、缨翅目、食毛目、蜚蠊目、螨 类、虱目、吸虫、绦虫、鞭毛虫、变形虫和草履虫等多种昆虫及原生生物产生毒素活性， 但对人畜等非靶标生物没有效果，对环境友好安全。因此苏云金芽孢杆菌作为主要的生物 农药被广泛应用。该菌菌剂作为喷洒型杀虫剂主要成分的使用时间已经超过50年，是目 前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂，占微生物杀虫剂总量的90％-95％。

苏云金芽孢杆菌的不同杀虫毒素由不同种类的cry基因控制，各种cry基因已经被成 功克隆，并根据不同需要，利用转基因技术转入到不同作物中，用于害虫等有害生物的防 治。自1996年转Bt cry基因作物的种植开始，转Bt基因作物在世界范围内被广泛种植， 种植面积逐年增长。据2008年的统计显示，转Bt基因作物的种植面积已增长至4,600万 公顷。

苏云金芽孢杆菌菌剂的应用及转Bt cry基因作物的种植，在控制田间害虫方面效果显 著，有利于作物的产量和质量的提高，同时减少了化学农药的使用，对农林业生产和环境 保护发挥了积极的作用。

然而苏云金芽孢杆菌制剂和转Bt基因作物广泛应用，也使得部分害虫对Bt产生了一 定抗性，小菜蛾是至今唯一在田间发现对Bt产生抗性的害虫。同时，在实验室内已经筛 选出许多昆虫的不同抗性品系。而且其抗性水平有发展的势头。

Tabashnik等于1989年检测到田间种群对Bt制剂(kurstaki亚种)产生了25倍的抗 药性，首次报道了田间小菜蛾对Bt杀虫剂产生了抗药性。Tang等测定弗罗里达州田间小 菜蛾对Bt制剂(BtK NRD12)的抗药性大于1500倍。Wright等报道马来西亚田间小菜 蛾种群在室内筛选饲养7代后对BtA和BtK制剂的抗药性分别为330倍和160倍。此外， 日本、中美洲、墨西哥和印度等国家和地区也有抗Bt小菜蛾的报道。2000年Zhao等报 道从美国南卡罗尼那州田间采集的对Cry1C有31倍抗性的小菜蛾抗性品系，在实验室先 用Cry1C原毒素继续汰选，然后用表达高剂量的Cry1C毒素的转基因花椰菜汰选，26代 后，该品系对Cry1C毒素抗性高达63100倍(2龄幼虫)。

国内，冯夏等报道深圳、东莞地区等供港菜区小菜蛾对Bt的抗药性为17.2-30.2倍。 李建洪等通过对深圳、东莞和广州菜区的田间小菜蛾种群检测，发现小菜蛾对苏云金芽孢 杆菌标准品Cs3ab-1991的抗药性倍数分别为8.9、6.5、2.1倍。周程爱等报道长沙地区的 小菜蛾对Bt的抗药性由1997-1999年的敏感性由11-4.1倍发展到2000年的6.2倍的低水 平抗药性。余德亿等报道福建地区田间种群的小菜蛾对湖北Bt和福建Bt的抗药性分别由 1997年的2.1倍和3.1倍上升到1999年的8.2倍和10.1倍。郭世俭等报道浙江省杭州、 萧山、金华、温州四地的小菜蛾对Bt制剂还没有产生抗药性。王崇利等报道广东惠州田 间小菜蛾种群对Cry1Ab和Cry1Ac的抗性达到了高抗水平；对Btk制剂的抗性达到了中 抗水平；对Cry1Aa和Cry2Aa具有低水平抗性；福建福州、浙江杭州和江苏南京田间小 菜蛾种群对Cry1Ab、Cry1Ac具有低至中等水平抗性(8-28倍)，对Btk制剂具有低水平 抗性(3.5-7倍)。

以上可以看出，小菜蛾对Bt产生的抗性问题已经十分突出，因此筛选到对抗Bt小菜 蛾高活性的菌株，用于防治抗Bt害虫已迫在眉睫。

发明内容

本发明提供了一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌。

一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌，它为苏云金芽孢杆菌(Bacillus  thuringiensis)AH-2，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号.中国科学院微生物研 究所，保藏编号为CGMCC No：5220，保藏日期为2011年9月6日；它为革兰氏阳性好 氧杆菌，长为3.2μm～4.8μm，宽为1.2μm～1.8μm，一个营养细胞只有一个芽孢，芽孢为 中生、次端生或端生，孢子囊不膨大，伴孢晶体为菱形，有鞭毛；在牛肉膏蛋白胨培养基 上形成白色圆形菌落，菌落扁平，表面干燥无光泽，边缘缺刻。

本发明中一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌，它为苏云金芽孢杆菌(Bacillus  thuringiensis)AH-2，其菌膜试验阳性、伏普试验阳性、卵磷脂酶阳性、不利用水杨苷、不 利用蔗糖、利用纤维二糖、不利用甘露糖、不利用七叶灵、甲基红阳性、脲酶试验阳性、 明胶液化阳性、不利用乳糖、不利用山梨醇、利用果糖、利用阿拉伯糖、利用麦芽糖、不 利用木糖、利用葡萄糖、利用几丁质酶，生长pH值为6.9～7.2，生长温度为10～45℃。

本发明中一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌，它为苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)AH-2，其携带的杀虫晶体蛋白基因有cry1Ac、cry2A、cry7和cry9。

本发明一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌，它为苏云金芽孢杆菌(Bacillus  thuringiensis)AH-2，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No：5220，保藏日期为2011年9月6日。

本发明选择了鳞翅目主要害虫(小菜蛾)、鞘翅目害虫(黄粉虫)为靶标昆虫，同时汰 选得到了对Bt(Kurstaki亚种)粉剂具有高抗的抗Bt小菜蛾种群和对Cry1Ac毒蛋白具有 高抗的抗Cry1Ac毒蛋白小菜蛾种群，作为靶标昆虫，本发明中苏云金芽孢杆菌(Bacillus  thuringiensis)AH-2同时对上述鳞翅目和鞘翅目主要害虫及抗Bt及Cry1Ac毒蛋白害虫，均 具有较强的毒杀作用。

本发明中苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AH-2，可以利用其生产高效、广谱的 杀虫剂，用于防止鳞翅目重要害虫小菜蛾及鞘翅目害虫黄粉虫，同时对抗性害虫具有很好 的效果，有利于田间抗性小菜蛾的防治，提高了经济价值，切对人、畜及其他动物无害， 不污染环境，具有良好经济、生态效益，具有良好的应用推广前景。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌，它为苏 云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AH-2，属于芽孢杆菌属(Bacillus)，已在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院.中国 科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No：5220，保藏日期为2011年9月6日；它 为革兰氏阳性好氧杆菌，长为3.2μm～4.8μm，宽为1.2μm～1.8μm，一个营养细胞只有一 个芽孢，芽孢为中生、次端生或端生，孢子囊不膨大，伴孢晶体为菱形，有鞭毛；在牛肉 膏蛋白胨培养基上形成白色圆形菌落，菌落扁平，表面干燥无光泽，边缘缺刻。

本实施方式中苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AH-2，对其进行常规生理生化鉴 定，实验结果为：菌膜试验阳性、伏普试验阳性、卵磷脂酶阳性、不利用水杨苷、不利用 蔗糖、利用纤维二糖、不利用甘露糖、不利用七叶灵、甲基红阳性、脲酶试验阳性、明胶 液化阳性、不利用乳糖、不利用山梨醇、利用果糖、利用阿拉伯糖、利用麦芽糖、不利用 木糖、利用葡萄糖、利用几丁质酶。

本实施方式中苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AH-2的生长pH值为6.9～7.2， 生长温度为10～45℃。

对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌的筛选方法按以下步骤实现：一、取土样1g 加入100ml无菌水中，30℃振荡培养30min，在75～80℃水浴中热处理14～20min，得培 养液；二、采用倍比稀释法将培养液进行梯度稀释，并涂于分离培养基上，置于28～30℃ 恒温培养箱中培养3～4d，然后挑选培养特征类似苏云金杆菌的菌株涂片，用石碳酸复红 染色镜检，检出产生芽孢和伴孢晶体的菌株，纯化后即获得一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏 云金芽孢杆菌；其中步骤一中分离培养基由3g的牛肉膏、5g的蛋白胨、10g的葡萄糖、15～20g 琼脂的和1000ml的水组成，pH值为7.0；步骤一中所述土样来自安徽省池州市森林中，去 掉表层杂物取土。

对筛选所得一株对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌进行常规生理生化及携带的 杀虫晶体蛋白基因的鉴定，发现与本属其它菌种有区别，确定为芽孢杆菌属的一个新菌种， 命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AH-2。

对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌的发酵液的制备：一、取一环纯化后的菌株接 种到5ml的LB液体培养基中，置于29～31℃的复式摇床中，在200r/min下培养10～12h， 获得种子液；二、向500ml锥形瓶内装入100ml的LB液体培养基，然后接种2ml的种子 液，置于29～31℃的复式摇床中，在200r/min下培养36～45h，取样涂片至伴孢晶体50％ 脱落，即获得对抗Bt小菜蛾有活性的苏云金芽孢杆菌的发酵液；其中LB液体培养基由10g 的蛋白胨、5g的酵母粉、10g的NaCl和1000mL的水组成，pH值为7.0。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AH-2(简称为Bt.AH-2)对黄粉虫的生物测 定：

①供试昆虫

黄粉虫：在实验室内，利用木屑饲养，饲养温度是15-25℃，光周期为光照∶黑暗＝16h∶ 8h；

②菌株活性测定

挑单菌落接种于LB液体培养基中，在30℃恒温摇床上200rpm培养48h；离心收集 孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物；称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成 1000mg/L的溶液或悬浮液，置4℃备用；

③取5ml孢晶混合液与50μl 5％的Triton100混合均匀(Triton100终浓度为0.05％)， 选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液(含Triton100终浓 度为0.05％)中，浸泡10s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100 (Triton100终浓度为0.05％)浸泡叶片作为对照；选取2-3龄黄粉虫幼虫，每个处理10 头，设3个重复，25℃下饲养3d，将幼虫转移到装有等量木屑的培养皿中饲养4d；记录 幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率；

④测定结果

经过测定菌株Bt.AH-2的发酵液对鞘翅目害虫黄粉虫(Tenebrio molitor)的致死率为 75％～90％。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AH-2(简称为Bt.AH-2)对敏感小菜蛾的生 物测定：

①供试昆虫

小菜蛾相对敏感种群：在室内用干净无虫的萝卜苗和甘蓝苗饲养，期间从未施用过任 何杀虫剂。小菜蛾种群在室内进行隔离饲养，将蛹放入成虫饲养笼中(R＝10cm，L＝40cm)， 饲养笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10％蜂蜜糖水的脱脂棉球一个， 为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度 是25±1℃，相对湿度为60％～70％，光周期为光照∶黑暗＝16h∶8h。

②菌株活性测定

挑单菌落接种于LB液体培养基中，在30℃恒温摇床上200rpm培养48h。离心收集 孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物。称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成 1000mg/L的溶液或悬浮液，置4℃备用。

取5ml孢晶混合液与50μl 5％的Triton100混合均匀(Triton100终浓度为0.05％)， 选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液(含Triton100终浓 度为0.05％)中，浸泡10s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100 (Triton100终浓度为0.05％)浸泡叶片作为对照。选取2-3龄小菜蛾幼虫，每个处理10 头，设3个重复，25℃下饲养3d。记录幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。

③LC₅₀测定

通过预试验测定小菜蛾在90％和10％死亡率的孢晶混合物的浓度，在其范围内设计 5-7个浓度梯度，每个浓度4个重复，每重复10头2-3龄幼虫，25℃饲养48h，记录幼虫 死亡情况，利用POLO软件计算菌株的LC₅₀值。

④结果

经过测定，Bt.AH-2对鳞翅目害虫小菜蛾(Plutella xylostalla)相对敏感种群的致死中 浓度(LC₅₀)为4.94mg/L。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AH-2(简称为Bt.AH-2)对抗Bt小菜蛾的生 物测定：

①供试昆虫：

小菜蛾抗Bt种群：采自上海田间，在室内进行隔离饲养，将蛹放入成虫饲养笼中 (R＝10cm，L＝40cm)，饲养笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10％ 蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜 的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25±1℃，相对湿度为60％-70％，光周期为光照∶黑暗＝16h∶ 8h。利用Bt(Kurstaki亚种)制剂进行抗性选育。对Bt粉剂已有近千倍抗性。

②菌株活性测定

挑单菌落接种于LB液体培养基中，在30℃恒温摇床上200rpm培养48h。离心收集 孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物。称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成 1000mg/L的溶液或悬浮液，置4℃备用。

取5ml孢晶混合液与50μl 5％的Triton100混合均匀(Triton100终浓度为0.05％)， 选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液(含Triton100终浓 度为0.05％)中，浸泡10s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100 (Triton100终浓度为0.05％)浸泡叶片作为对照。选取2-3龄小菜蛾幼虫，每个处理10 头，设3个重复，25℃下饲养3d。记录幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。

③LC₅₀测定

通过预试验测定小菜蛾在90％和10％死亡率的孢晶混合物的浓度，在其范围内设计 5-7个浓度梯度，每个浓度4个重复，每重复10头2-3龄幼虫，25℃饲养48h，记录幼虫 死亡情况，利用POLO软件计算菌株的LC₅₀。

④结果

经过测定，Bt.AH-2对鳞翅目害虫小菜蛾(Plutella xylostalla)抗Bt种群的致死中浓 度(LC₅₀)为7.44mg/L。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)AH-2(简称为Bt.AH-2)对抗Cry1Ac毒蛋 白小菜蛾的生物测定：

①供试昆虫

小菜蛾抗Cry1Ac毒蛋白种群：采自深圳田间，在养虫室内，利用甘蓝苗结合养虫纱 笼法在室内饲养，将蛹放入成虫饲养笼中(R＝10cm，L＝40cm)，笼四周以80目的纱网包 围，成虫羽化后，笼内挂浸过10％蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在 甘蓝苗上产卵，卵孵化后再转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25±1℃，相对湿度为 60％-70％，光周期为光照∶黑暗＝16h∶8h。其间只施用Cry1Ac毒蛋白进行汰选，不施用 其它任何药剂。其对Cry1Ac毒蛋白的LC₅₀大于4000mg/L，抗性高于1500倍。

②菌株活性测定

挑单菌落接种于LB液体培养基中，在30℃恒温摇床上200rpm培养48h。离心收集 孢晶混合物，洗涤后真空抽干，得到干粉混合物。称取孢晶混合物，加入定量无菌水配成 1000mg/L的溶液或悬浮液，置4℃备用。

取5ml孢晶混合液与50μl 5％的Triton100混合均匀(Triton100终浓度为0.05％)， 选老嫩适中的甘蓝叶片洗净晾干，剪成直径2cm大小，放入孢晶悬液(含Triton100终浓 度为0.05％)中，浸泡10s晾干，放入铺有湿润滤纸的平皿中。以无菌水混合Triton100 (Triton100终浓度为0.05％)浸泡叶片作为对照。选取2-3龄小菜蛾幼虫，每个处理10 头，设3个重复，25℃下饲养3d。记录幼虫死亡情况，计算死亡率和校正死亡率。

③LC₅₀测定

通过预试验测定小菜蛾在90％和10％死亡率的孢晶混合物的浓度，在其范围内设计 5-7个浓度梯度，每个浓度4个重复，每重复10头2-3龄幼虫，25℃饲养48h，记录幼虫 死亡情况，利用POLO软件计算菌株的LC₅₀。

④结果

经过测定，Bt.AH-2对鳞翅目害虫小菜蛾(Plutella xylostalla)抗Cry1Ac毒蛋白种 群的致死中浓度(LC₅₀)为5.90mg/L。