一种鲜动物药药物组合物及其原料药的含量测定方法

摘要

本发明公开一种鲜动物药药物组合物及其原料药的含量测定方法，该方法为：取本发明鲜动物药药物组合物和原料药，置于量瓶中，加水溶解，超声提取，离心，取上清液，过微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；称取本发明鲜动物药药物组合物和原料药，加水充分溶解后，超声提取，离心，取上清液，置于安剖瓶中，加入盐酸，真空充氮，水解，取出，放冷至室温，加入NaOH溶液，混匀，转移至量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心，取上清液，过微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液。以色谱柱检测一级氨基酸和二级氨基酸。以乙腈：甲醇：水为流动相A，pH为7.8的Na

说明书

技术领域

本发明涉及一种测定方法，特别是涉及一种治疗原发性肝癌血瘀郁结证的鲜动物药药物组合物及其原 料药的含量测定方法。

背景技术

本发明金龙胶囊(国药准字Z10980041)是癌症治疗药物，以药用动物(鲜守宫、鲜蕲蛇、鲜金钱白花 蛇)组方的复方制剂，在抗肿瘤方面疗效确切。

金龙胶囊已颁布的药品标准(WS3-158(Z-036)-2001Z)对其产品质量的控制，包括：性状、鉴别、检 查和含量测定4项，从目前SFDA对中药质量控制标准的要求，以及金龙胶囊原料药鲜守宫、鲜金钱白花 蛇、鲜蕲蛇的化学及药理研究现状来看，目前含量测定项目采用了可见分光光度法，Folin-酚试剂测定总 蛋白，该法的特异性较差，此外对于动物药中普遍存在的氨基酸、游离单糖、多糖及内源性一些小分子生 命基本物质均未进行质量控制研究。

根据金龙胶囊质量控制标准现状，本发明以质量控制标准提高为出发点，对金龙胶囊中氨基酸进行测 定，确定了金龙胶囊氨基酸检测的色谱条件，该色谱条件采用柱前衍生化法，方法学考察中精密度、稳定 性及重现性良好。并且金龙胶囊中含有大量氨基酸，应用氨基酸测定可更好的控制药品质量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鲜动物药药物组合物的含量测定方法。本发明的另一目的在于提供一种鲜 动物药药物组合物原料药的含量测定方法。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明药物组合物的含量测定方法包括如下步骤：

1、标准品溶液的制备

a、0.1mol/L盐酸溶液：取36％-38％的浓盐酸0.83体积份于100体积份量瓶中，加水稀释并定容至 刻度；

b、17种氨基酸混合标准品溶液：17种氨基酸分别：天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨 酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨 酸、脯氨酸；

取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公司)25μL、50μL、100μL、200μL、400μL、800μL于0.5-1.5 体积份容量瓶中，以0.1mol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得25-1000pmol/μL系列浓度的氨基酸混 合标准品溶液；

c、1％苯酚的6mol/L盐酸溶液：取苯酚0.2-0.8重量份于30-70体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸15-35 体积份，加水溶解并定容至刻度；

d、10mol/L NaOH溶液：取NaOH 10-30重量份，置于30-70体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度， 混匀，转移至塑料储瓶中备用；

e、40mol/L Na₂HPO₄缓冲液：取NaH₂PO₄ 3-8重量份，加水溶解并定容于500-1500体积份量瓶中， 用10mol/L NaOH溶液调节pH值至7.8，混匀，即得；

2.供试品溶液的制备

a、游离氨基酸供试品溶液的制备：称取本发明药物组合物0.05-0.15重量份，置于25-75体积份量 瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取15-45分钟，离心5-15分钟，取上清液，过0.3-0.6μm微孔滤 膜，得游离氨基酸供试品溶液；

b、总氨基酸供试品溶液的制备：称取本发明药物组合物0.05-0.15重量份，置于10-20体积份塑料 离心管中，加水5-15体积份充分溶解后，超声提取15-45分钟，离心5-15分钟，取上清液，取0.05-1.5 体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含1％苯酚的6mol/L盐酸2-6体积份，真空充氮N₂15-45秒，迅速密 封，置于80-150℃恒温干燥箱内水解12-32小时，取出，放冷至室温，加入1.2-3.6体积份10mol/L NaOH 溶液，混匀，转移至5-15体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心5-15分钟，取上清液，过 0.45μm微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；

3、色谱条件

色谱柱：4.6×150mm，3.5μm Zorbax Eclipse-AAA柱，流速：1.5ml/min，柱温为35℃，自动进样 程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于262nm波长处检测二级氨基酸；以乙腈∶甲醇∶水 ＝25-65∶25-65∶5-15为流动相A，pH为7.8的40mmol/L Na₂HPO₄为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程 序如下：

0-2.5min流动相A为0％，流动相B为100％；

2.5-16min流动相A为30％，流动相B为70％；

16-24min流动相A为57％，流动相B为43％；

24-24.8min流动相A为100％，流动相B为0％；

24.8-29.7min流动相A为100％，流动相B为0％；

29.7-30.9min流动相A为0％，流动相B为100％；

30.9-34.7min流动相A为0％，流动相B为100％；

4、测定结果

本发明药物组合物中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1.9％-2.85％，总游离氨基酸的含量 为12.52％-18.78％，总氨基酸的含量为14.41％-21.62％；

本发明药物组合物的含量测定方法优选如下步骤：

1、标准品溶液的制备

a、0.1mol/L盐酸溶液：取37.5％浓盐酸0.83体积份于100体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度；

b、17种氨基酸混合标准品溶液的制备：17种氨基酸分别：天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、 甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、 赖氨酸、脯氨酸；

取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公司)25μL、50μL、100μL、200μL、400μL、800μL于1 体积份量瓶中，以0.1mol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得25-1000pmol/μL系列浓度的氨基酸混合 标准品溶液；

c、1％苯酚的6mol/L盐酸溶液：取苯酚0.5重量份于50体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸25体积份， 加水溶解并定容至刻度；

d、10mol/L NaOH溶液：取NaOH 20.0重量份，置于50体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混 匀，转移至塑料储瓶中备用；

e、40mol/L Na₂HPO₄缓冲液：取NaH₂PO₄ 5.5重量份，加水溶解并定容于1000体积份量瓶中，用10mol/L NaOH溶液调节pH值至7.8，混匀，即得；

2.供试品溶液的制备

a、游离氨基酸供试品溶液的制备：称取本发明药物组合物0.1重量份，置于50体积份量瓶中，加水 溶解并定容至刻度，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得游离氨基酸供 试品溶液；

b、总氨基酸供试品溶液的制备：称取本发明药物组合物0.1重量份，置于15体积份塑料离心管中， 加水10体积份充分溶解后，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，取1体积份上清液，置于安剖 瓶中，加入含1％苯酚的6mol/L盐酸4体积份，真空充氮N₂30秒，迅速密封，置于110℃恒温干燥箱内水 解22小时，取出，放冷至室温，分别加入2.4体积份10mol/L NaOH溶液，混匀，转移至10体积份量瓶 中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶 液；

3、色谱条件

色谱柱：4.6×150mm，3.5μm Zorbax Eclipse-AAA柱，流速：1.5ml/min，柱温为35℃，自动进样 程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于262nm波长处检测二级氨基酸；以乙腈∶甲醇∶水＝45∶45∶10 为流动相A，PH为7.8的40mmol/L Na₂HPO₄为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序如下：

0-2.5min流动相A浓度为0％，流动相B浓度为100％；

2.5-16min流动相A浓度为30％，流动相B浓度为70％；

16-24min流动相A浓度为57％，流动相B浓度为43％；

24-24.8min流动相A浓度为100％，流动相B浓度为0％；

24.8-29.7min流动相A浓度为100％，流动相B浓度为0％；

29.7-30.9min流动相A浓度为0％，流动相B浓度为100％；

30.9-34.7min流动相A浓度为0％，流动相B浓度为100％；

4、测定结果

本发明药物组合物中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1.9％，总游离氨基酸的含量为 12.52％，总氨基酸的含量为14.41％；

本发明药物组合物中14种氨基酸分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、 丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸。

本发明药物组合物中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0.55％-0.83％、谷氨酸含量为 1.79％-2.79％、丝氨酸含量为0.54％-0.81％、组氨酸含量为0.52％-0.78％、甘氨酸含量为1.15％-1.73％、苏 氨酸含量为0.62％-0.93％、丙氨酸含量为2.01％-3.02％、缬氨酸含量为0.86％-1.29％、蛋氨酸含量为 0.36％-0.54％、苯丙氨酸含量为0.5％-0.75％、异亮氨酸含量为0.53％-0.80％、亮氨酸含量为0.96％-1.44％、 赖氨酸含量为1.30％-1.95％、脯氨酸含量为0.82％-1.23％；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为 0.80％-1.20％、谷氨酸含量为2.29％-3.44％、丝氨酸含量为0.72％-1.08％、组氨酸含量为0.73％-1.10％、甘 氨酸含量为1.53％-2.30％、苏氨酸含量为0.73％-1.10％、丙氨酸含量为2.08％-3.12％、缬氨酸含量为 0.94％-1.41％、蛋氨酸含量为0.42％-0.63％、苯丙氨酸含量为0.72％-1.08％、异亮氨酸含量为0.72％-1.08％、 亮氨酸含量为含量为1.15％-2.27％、赖氨酸含量为0.82％-1.23％、脯氨酸含量为0.76％-1.14％。

本发明药物组合物中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0.55％、谷氨酸含量为1.79％、丝氨酸 含量为0.54％、组氨酸含量为0.52％、甘氨酸含量为1.15％、苏氨酸含量为0.62％、丙氨酸含量为2.01％、 缬氨酸含量为0.86％、蛋氨酸含量为0.36％、苯丙氨酸含量为0.5％、异亮氨酸含量为0.53％、亮氨酸含量 为0.96％、赖氨酸含量为1.30％、脯氨酸含量为0.82％；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0.80％、谷 氨酸含量为2.29％、丝氨酸含量为0.72％、组氨酸含量为0.73％、甘氨酸含量为1.53％、苏氨酸含量为0.73％、 丙氨酸含量为2.08％、缬氨酸含量为0.94％、蛋氨酸含量为0.42％、苯丙氨酸含量为0.72％、异亮氨酸含量 为0.72％、亮氨酸含量为1.15含量为％、赖氨酸含量为0.82％、脯氨酸含量为0.76％；

本发明药物组合物的原料药组成为：

鲜守宫700-2300重量份    鲜金钱白花蛇400-1100重量份

鲜蕲蛇400-1100重量份。

本发明药物组合物的原料药组成优选为：

鲜守宫1500重量份、鲜金钱白花蛇750重量份、鲜蕲蛇750重量份；

或鲜守宫800重量份、鲜金钱白花蛇1000重量份、鲜蕲蛇500重量份；

或鲜守宫2000重量份、鲜金钱白花蛇500重量份、鲜蕲蛇100重量份。

本发明药物组合物的制备方法为：

将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水匀浆后，置于-25℃冷冻 24小时，取出，置于37℃水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤， 取滤液加β-环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成片剂、胶囊剂、 颗粒剂或丸剂。

本发明药物组合物的制备方法还可以为：

将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉糜，研磨成糊状，加3-5倍体积水匀浆后，置于-18 ℃至-22℃冷冻24小时，取出，置于15℃-30℃融化，滤过，滤液以12000-16000转/分离心，吸取上清液， 超滤，取滤液加β-环糊精20-60重量份包结后真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，加入淀粉66-198重量份， 混匀，低温干燥，制成片剂、胶囊剂、颗粒剂或丸剂。

本发明药物组合物的制备方法还可以优选为：

将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉糜，研磨成糊状，加4倍体积水匀浆后，置于-20℃冷 冻24小时，取出，置于25℃融化，滤过，滤液以14000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环 糊精40重量份包结后真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，加入淀粉132重量份，混匀，低温干燥，制成片剂、 胶囊剂、颗粒剂或丸剂。

本发明药物组合物原料药的含量测定方法包括如下步骤：

1、标准品溶液的制备

a、0.1mol/L盐酸溶液：取36％-38％浓盐酸0.83体积份于100体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻 度；

b、17种氨基酸混合标品准溶液：17种氨基酸分别：天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨 酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨 酸、脯氨酸；

取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公司)25μL、50μL、100μL、200μL、400μL、800μL于0.5-1.5 体积份容量瓶中，以0.1mol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得25-1000pmol/μL系列浓度的氨基酸混 合标准品溶液；

c、1％苯酚的6mol/L盐酸溶液：取苯酚0.2-0.8重量份于30-70体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸15-35 体积份，加水溶解并定容至刻度；

d、10mol/L NaOH溶液：取NaOH 10-30重量份，置于30-70体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度， 混匀，转移至塑料储瓶中备用；

e、40mol/L Na₂HPO₄缓冲液：取NaH₂PO₄ 3-38重量份，加水溶解并定容于500-1500体积份量瓶中， 用10mol/L NaOH溶液调节pH值至7.8，混匀，即得；

2.供试品溶液的制备

a、游离氨基酸供试品溶液的制备：称取鲜金钱白花蛇、鲜蕲蛇和鲜守宫各0.05-0.15重量份，置于 25-75体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取15-45分钟，离心5-15分钟，取上清液，过0.3-0.6μm 微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；

b、总氨基酸供试品溶液的制备：称取鲜金钱白花蛇、鲜蕲蛇和鲜守宫各0.05-0.15重量份，置于10-20 体积份塑料离心管中，加水5-15体积份充分溶解后，超声提取15-45分钟，离心5-15分钟，取上清液， 取0.05-1.5体积份上清液，置于安剖瓶中，加入含1％苯酚的6mol/L盐酸2-6体积份，真空充氮N₂15-45 秒，迅速密封，置于80-150℃恒温干燥箱内水解12-32小时，取出，放冷至室温，分别加入1.2-3.6体 积份10mol/L NaOH溶液，混匀，转移至5-15体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心5-15 分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；

3、色谱条件

色谱柱：4.6×150mm，3.5μm Zorbax Eclipse-AAA柱，流速：1.5ml/min，柱温为35℃，自动进样 程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于262nm波长处检测二级氨基酸。以乙腈∶甲醇∶水 ＝25-65∶25-65∶5-15为流动相A，pH为7.8的40mmol/L Na₂HPO₄为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱程 序如下：

0-2.5min流动相A为0％，流动相B为100％；

2.5-16min流动相A为30％，流动相B为70％；

16-24min流动相A为57％，流动相B为43％；

24-24.8min流动相A为100％，流动相B为0％；

24.8-29.7min流动相A为100％，流动相B为0％；

29.7-30.9min流动相A为0％，流动相B为100％；

30.9-34.7min流动相A为0％，流动相B为100％；

4、测定结果

本发明原料药鲜守宫中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1.77％-2.66％，总游离氨基酸的含 量为22.50％-33.75％，总氨基酸的含量为24.26％-36.39％；

或鲜金钱白花蛇中检测到12种氨基酸，其中总蛋白质的含量为0.13％-0.20％，总游离氨基酸的含量为 6.02％-9.03％，总氨基酸的含量为6.15％-9.23％；

或鲜蕲蛇中检测到15种氨基酸，其中总蛋白质的含量为18.03％-27.05％，总游离氨基酸的含量为 5.09％-7.64％，总氨基酸的含量为23.12％-34.68％；

本发明药物组合物的含量测定方法优选如下步骤：

1、标准品溶液的制备

a、0.1mol/L盐酸溶液：取37.5％浓盐酸0.83体积份于100体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度；

b、17种氨基酸混合标准品溶液的制备：17种氨基酸分别：天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、 甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、 赖氨酸、脯氨酸；

取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公司)25μL、50μL、100μL、200μL、400μL、800μL于1 体积份容量瓶中，以0.1mol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得25-1000pmol/μL系列浓度的氨基酸混 合标准品溶液；

c、1％苯酚的6mol/L盐酸溶液：取苯酚0.5重量份于50体积份棕色量瓶中，加入浓盐酸25体积份， 加水溶解并定容至刻度；

d、10mol/L NaOH溶液：取NaOH 20.0重量份，置于50体积份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混匀， 转移至塑料储瓶中备用；

e、40mol/L Na₂HPO₄缓冲液：取NaH₂PO₄ 5.5重量份，加水溶解并定容于1000体积份量瓶中，用10mol/L NaOH溶液调节pH值至7.8，混匀，即得；

2.供试品溶液的制备

a、游离氨基酸供试品溶液的制备：称取鲜金钱白花蛇、鲜蕲蛇和鲜守宫各0.1重量份，置于50体积 份量瓶中，加水溶解并定容至刻度，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜， 得游离氨基酸供试品溶液；

b、总氨基酸供试品溶液的制备：称取鲜金钱白花蛇、鲜蕲蛇品和鲜守宫各0.1重量份，置于15体积 份塑料离心管中，加水10体积份充分溶解后，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，取1体积份 上清液，置于安剖瓶中，加入含1％苯酚的6mol/L盐酸4体积份，真空充氮N₂30秒，迅速密封，置于110℃ 恒温干燥箱内水解22小时，取出，放冷至室温，分别加入2.4体积份10mol/L NaOH溶液，混匀，转移 至10体积份量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得 总氨基酸供试品溶液；

3、色谱条件

色谱柱：4.6×150mm，3.5μm Zorbax Eclipse-AAA柱，流速：1.5ml/min，柱温为35℃，自动进样 程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于262nm波长处检测二级氨基酸；以乙腈∶甲醇∶水＝45∶45∶10 为流动相A，PH为7.8的40mmol/L Na₂HPO₄为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序如下：

0-2.5min流动相A浓度为0％，流动相B浓度为100％；

2.5-16min流动相A浓度为30％，流动相B浓度为70％；

16-24min流动相A浓度为57％，流动相B浓度为43％；

24-24.8min流动相A浓度为100％，流动相B浓度为0％；

24.8-29.7min流动相A浓度为100％，流动相B浓度为0％；

29.7-30.9min流动相A浓度为0％，流动相B浓度为100％；

30.9-34.7min流动相A浓度为0％，流动相B浓度为100％；

4、测定结果

本发明原料药鲜守宫中检测到14种氨基酸，其中总蛋白质的含量为1.77％，总游离氨基酸的含量为 22.50％，总氨基酸的含量为24.26％；

或鲜金钱白花蛇中检测到12种氨基酸，其中总蛋白质的含量为0.13％，总游离氨基酸的含量为6.02％， 总氨基酸的含量为6.15％；

或鲜蕲蛇中检测到15种氨基酸，其中总蛋白质的含量为18.03％，总游离氨基酸的含量为5.09％，总 氨基酸的含量为23.12％。

本发明原料药鲜守宫中的14种氨基酸分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨 酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸；

或鲜金钱白花蛇中的12种氨基酸分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、 缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸；

或鲜蕲蛇中的15种氨基酸分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、 酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；

本发明原料药鲜守宫中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为1.33％-2.00％、谷氨酸含量为 3.29％-4.94％、丝氨酸含量为0.95％-1.43％、组氨酸含量为0.72％-1.08％、甘氨酸含量为1.64％-2.46％、苏 氨酸含量为0.98％-1.47％、丙氨酸含量为2.48％-3.72％、缬氨酸含量为1.36％-2.04％、蛋氨酸含量为 0.68％-1.02％、苯丙氨酸含量为0.93％-1.40％、异亮氨酸含量为1.00％-1.50％、亮氨酸含量为1.67％-2.51％、 赖氨酸含量为4.13％-6.20％、脯氨酸含量为1.36％-2.04％；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为 1.92％-2.88％、谷氨酸含量为4.39％-6.59％、丝氨酸含量为1.19％-1.79％、组氨酸含量为0.95％-1.43％、甘 氨酸含量为2.16％-3.24％、苏氨酸含量为1.22％-1.83％、丙氨酸含量为2.62％-3.93％、缬氨酸含量为含量为 1.60％-2.40％、蛋氨酸含量为0.71％-1.07％、苯丙氨酸含量为1.20％-1.80％、异亮氨酸含量为1.20％-1.80％、 亮氨酸含量为1.89％-2.84％、赖氨酸含量为2.06％-3.09％、脯氨酸含量为1.17％-1.76％；

或鲜金钱白花蛇中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0.25％-0.38％、谷氨酸含量为 0.57％-0.86％、丝氨酸含量为0.15％-0.23％、甘氨酸含量为0.68％-1.02％、苏氨酸含量为0.39％-0.59％、丙 氨酸含量为1.48％-2.22％、缬氨酸含量为0.62％-0.93％、蛋氨酸含量为0.24％-0.36％、苯丙氨酸含量为 0.51％-0.77％、异亮氨酸含量为0.40％-0.60％、亮氨酸含量为0.60％-0.90％、脯氨酸含量为0.15％-0.23％； 总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0.39％-0.59％、谷氨酸含量为0.70％-1.05％、丝氨酸含量为 0.30％-0.45％、甘氨酸含量为0.74％-1.11％、苏氨酸含量为0.39％-0.59％、丙氨酸含量为1.20％-1.80％、缬 氨酸含量为0.53％-0.80％、蛋氨酸含量为0.28％-0.42％、苯丙氨酸含量为0.39％-0.59％、异亮氨酸含量为 0.40％-0.60％、亮氨酸含量为0.59％-0.89％、脯氨酸含量为0.23％-0.35％；

或鲜蕲蛇中总游离氨基酸的含量中谷氨酸含量为0.17％-0.26％、丝氨酸含量为0.12％-0.18％、组氨酸 含量为0.18％-0.27％、甘氨酸含量为0.51％-0.77％、苏氨酸含量为0.38％-0.57％、丙氨酸含量为1.13％-1.70％、 缬氨酸含量为0.40％-0.60、异亮氨酸含量为0.22％-0.33％、亮氨酸含量为0.34％-0.51％、赖氨酸含量为 1.64％-2.72％；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为2.28％-3.42％、谷氨酸含量为3.17％-4.76％、丝氨酸含 量为1.18％-1.77％、组氨酸含量为1.09％-1.64％、甘氨酸含量为1.52％-2.28％、苏氨酸含量为1.39％-2.39％、 丙氨酸含量为2.16％-3.24％、酪氨酸含量为0.91％-1.37、缬氨酸含量为1.60％-2.40％、蛋氨酸含量为 0.51％-0.77％、苯丙氨酸含量为1.11％-1.67％、异亮氨酸含量为1.22％-1.83％、亮氨酸含量为2.17％-3.26％、 赖氨酸含量为2.11％-3.17％、脯氨酸的含量为0.74％-1.11％。

本发明原料药鲜守宫中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为1.33％、谷氨酸含量为3.29％、丝氨 酸含量为0.95％、组氨酸含量为0.72％、甘氨酸含量为1.64％、苏氨酸含量为0.98％、丙氨酸含量为2.48％、 缬氨酸含量为1.36％、蛋氨酸含量为0.68％、苯丙氨酸含量为0.93％、异亮氨酸含量为1.00％、亮氨酸含量 为1.67％、赖氨酸含量为4.13％、脯氨酸含量为1.36％；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为1.92％、谷氨 酸含量为4.39％、丝氨酸含量为1.19％、组氨酸含量为0.95％、甘氨酸含量为2.16％、苏氨酸含量为1.22％、 丙氨酸含量为2.62％、缬氨酸含量为含量为1.60％、蛋氨酸含量为0.71％、苯丙氨酸含量为1.20％、异亮氨 酸含量为1.20％、亮氨酸含量为1.89％、赖氨酸含量为2.06％、脯氨酸含量为1.17％；

或鲜金钱白花蛇中总游离氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0.25％、谷氨酸含量为0.57％、丝氨酸含 量为0.15％、甘氨酸含量为0.68％、苏氨酸含量为0.39％、丙氨酸含量为1.48％、缬氨酸含量为0.62％、蛋 氨酸含量为0.24％、苯丙氨酸含量为0.51％、异亮氨酸含量为0.40％、亮氨酸含量为0.60％、脯氨酸含量为 0.15％；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为0.39％、谷氨酸含量为0.70％、丝氨酸含量为0.30％、甘氨酸 含量为0.74％、苏氨酸含量为0.39％、丙氨酸含量为1.20％、缬氨酸含量为0.53％、蛋氨酸含量为0.28％、 苯丙氨酸含量为0.39％、异亮氨酸含量为0.40％、亮氨酸含量为0.59％、脯氨酸含量为0.23％；

或鲜蕲蛇中总游离氨基酸的含量中谷氨酸含量为0.17％、丝氨酸含量为0.12％、组氨酸含量为0.18％、 甘氨酸含量为0.51％、苏氨酸含量为0.38％、丙氨酸含量为1.13％、缬氨酸含量为0.40％、异亮氨酸含量为 0.22％、亮氨酸含量为0.34％、赖氨酸含量为1.64％；总氨基酸的含量中天门冬氨酸含量为2.28％、谷氨酸 含量为3.17％、丝氨酸含量为1.18％、组氨酸含量为1.09％、甘氨酸含量为1.52％、苏氨酸含量为1.39％、 丙氨酸含量为2.16％、酪氨酸含量为0.91％、缬氨酸含量为1.60％、蛋氨酸含量为0.51％、苯丙氨酸含量为 1.11％、异亮氨酸含量为1.22％、亮氨酸含量为2.17％、赖氨酸含量为2.11％、脯氨酸的含量为0.74％。

本发明药物组合物中原料药鲜守宫的制备方法为：取鲜守宫3000重量份，斩剁成肉糜，研磨成糊状， 加等量水匀浆后，置于-25℃冷冻24小时，取出，置于37℃水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000 转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒， 低温干燥，制成粉末。

或鲜金钱白花蛇的制备方法为：取鲜金钱白花蛇3000重量份，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水 匀浆后，置于-25℃冷冻24小时，取出，置于37℃水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心， 吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥， 制成粉末。

或鲜蕲蛇的制备方法为：取鲜蕲蛇3000重量份，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水匀浆后，置于 -25℃冷冻24小时，取出，置于37℃水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液， 超滤，取滤液加β-环糊精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末。

本发明所述的重量份与体积份的关系为g/ml或kg/l。

本发明药物组合物的制备方法是先将氨基酸转化成衍生物，再进行色谱分离，操作相对简单，高分辨 率、高灵敏度，并可在12～40min短时间内分离12～26种氨基酸的一种可靠方法。

附图说明

图1为17种氨基酸标准品HPLC图；

图2为混合原料HPLC图；

图3为守宫HPLC图

图4为白花蛇HPLC图

图5为蕲蛇HPLC图。

其中：1、天门冬氨酸，2、谷氨酸，3、丝氨酸，4、组氨酸，5、甘氨酸，6、苏氨酸，7、精氨酸， 8、丙氨酸，9、酪氨酸，10、胱氨酸，11、缬氨酸，12、蛋氨酸，13、苯丙氨酸，14、异亮氨酸，15、亮 氨酸，16、赖氨酸，17、脯氨酸。

下述实验例用于进一步说明本发明，但不限于本发明。

实验例：本发明药物组合物金龙胶囊以及各原料药中氨基酸的定量分析

1.实验材料与仪器设备

1.1实验材料：17种氨基酸(天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、 丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸)混合标准 品溶液、硼酸缓冲液、OPA及FMOC衍生化试剂均购于安捷伦公司；甲醇及乙腈由B&J公司提供，色谱纯； 磷酸二氢钠、盐酸及氢氧化钠均为分析纯，购于北京化工厂；本发明药物组合物金龙胶囊(按照实施例1 的方法制备)及其本发明药物组合物原料药鲜金钱白花蛇(按照实施例2的方法制备)、鲜蕲蛇(按照实 施例3的方法制备)、鲜守宫(按照实施例4的方法制备)由北京建生药业有限公司提供。

1.2仪器设备：高效液相色谱仪为Agilent 1100 HPLC，配备紫外检测器、自动进样器、柱温箱及四 元梯度洗脱泵。

2.溶液配制

2.10.1mol/L盐酸溶液：取37.5％浓盐酸0.83mL于100mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度。

2.2系列浓度17种氨基酸混合标准品溶液的制备：取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公 司)25μL、50μL、100μL、200μL、400μL、800μL于1mL容量瓶中，以0.1mol/L盐酸水溶液稀释并定容至 刻度，得25-1000pmol/μL系列浓度的氨基酸混合标准品溶液。

2.31％苯酚的6mol/L盐酸溶液：取苯酚约0.5g于50mL棕色量瓶中，加入浓盐酸25mL，加水溶解并 定容至刻度。

2.410mol/LNaOH溶液：取NaOH约20.0g，置于50mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混匀，转 移至塑料储瓶中备用。

2.540mmol/L Na₂HPO₄缓冲液(pH7.8)：取NaH₂PO₄约5.5g，加水溶解并定容于1L量瓶中，用10mol/L NaOH溶液调节pH值至7.8，混匀，即得。

3.供试品溶液的制备

3.1游离氨基酸供试品溶液的制备：取本发明药物组合物(按照实施例1方法制备)和本发明药物组 合物原料药鲜金钱白花蛇粉末(按照实施例2的方法制备)、鲜蕲蛇样品粉末(按照实施例3的方法制备)、 鲜守宫样品粉末(按照实施例4的方法制备)，分别取0.1g，依次置于50mL、25mL、25mL、50mL量瓶中， 加水溶解并定容至刻度，超声提取30min，离心10min，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，分别得游离氨基 酸供试品溶液。

3.2总氨基酸供试品溶液的制备：取本发明药物组合物(按照实施例1方法制备)和本发明药物组合 物原料药鲜金钱白花蛇粉末(按照实施例2的方法制备)、鲜蕲蛇粉末(按照实施例3的方法制备)、鲜守 宫粉末(按照实施例4的方法制备)，分别取0.1g，分别置于15mL塑料离心管中，加水10mL充分溶解后， 超声提取30min，离心10min，取上清液，分别吸取上清液1mL，置于安剖瓶中，加入含1％苯酚的6mol/L 盐酸4mL，真空充N₂30s，迅速密封，置于110℃恒温干燥箱内水解22hr，取出，放冷至室温，分别加入 2.4mL10mol/L NaOH溶液，混匀，转移至10mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心10min，取 上清液，过0.45μm微孔滤膜，分别得总氨基酸供试品溶液。

4.色谱条件

色谱柱：Zorbax Eclipse-AAA柱(4.6×150mm，3.5μm)，流速：1.5ml/min，柱温为35℃，自动进样 程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于262nm波长处检测二级氨基酸。以(乙腈∶甲醇∶水 ＝45∶45∶10)(A)和40mmol/L Na₂HPO₄(pH 7.8)(B)为流动相进行梯度洗脱，梯度洗脱程序如下：

  时间   A(％)   B(％)   0   0   100   2.5   0   100   16   30   70   24   57   43   24.8   100   0   29.7   100   0   30.9   0   100   34.7   0   100

5、衍生化反应

分别取系列浓度的标准品溶液或供试品溶液各0.5μL，加硼酸缓冲液2.5μL，然后依次加入OPA衍生 化试剂0.5μL及FMOC衍生化试剂0.5μL，反应1-2分钟，注入高效液相色谱仪进行色谱分析。

6.方法学验证

6.1方法特异性：将17种氨基酸混合标准品溶液及金龙胶囊各原料药，衍生化后进行HPLC分析，色 谱图见图1-图5，各氨基酸得到较好分离。

6.2线性：分别取系列浓度的标准品溶液各0.5μL，加硼酸缓冲液2.5μL，然后依次加入OPA衍生化 试剂0.5μL及FMOC衍生化试剂0.5μL，反应1-2分钟，注入高效液相色谱仪进行色谱分析，记录氨基酸的 峰面积响应值，以浓度对峰面积作标准曲线，进行线性回归，得到线性回归方程见表1。

6.3标准品溶液的精密度考察

在检测过程中通过光谱只检测到15种氨基酸，其中精氨酸和胱氨酸未检测到，取100、200、400pmol/μL 的除精氨酸和胱氨酸外的15种氨基酸混合标准品溶液，分别进行上述的衍生化反应，然后注入高效液相 色谱仪进行分析，重复6次，记录15种氨基酸的峰面积响应值，计算峰面积的RSD，结果见表2至表4， 三种浓度的15种氨基酸混合标准品溶液的峰面积精密度的RSD均小于5％，能够满足分析的要求。

表1氨基酸的线性方程及相关系数

表2标准品溶液的精密度考察(100pmol/μL)

表3标准品溶液的精密度考察(200pmol/μL)

表4标准品溶液的精密度考察(400pmol/μL)

6.4标准品溶液的稳定性考察

分别取100、200、400pmol/μL除精氨酸和胱氨酸外的15种氨基酸混合标准品溶液0.5μL，分别于 0h、4h、8h、12h、16h、24h进行上述的衍生化反应，然后注入高效液相色谱仪进行分析，记录15种氨基 酸的峰面积响应值，计算峰面积的RSD，得标准品日内稳定性结果，见表5至表7，15种氨基酸峰面积的 RSD小于5％，表明15种氨基酸混合标准品溶液在24h以内是稳定的；分别于制备第一天、第二天、第三 天、第四天、第五天进行上述的衍生化反应，注入高效液相色谱仪进行分析，记录15种氨基酸的峰面积 响应值，计算峰面积的RSD，得标准品日间稳定性结果，见表8至表10，15种氨基酸峰面积的RSD小于 5％表明15种氨基酸混合标准品溶液在五天以内是稳定的。

表5标准品溶液的日内稳定性考察(100pmol/μL)

表6标准品溶液的日内稳定性考察(200pmol/μL)

表7标准品溶液的日内稳定性考察(400pmol/μL)

表8标准品溶液的日间稳定性考察(100pmol/μL)

表9标准品溶液的日间稳定性考察(200pmol/μL)

表10标准品溶液的日间稳定性考察(400pmol/μL)

6.5供试品中游离氨基酸测定重复性的考察

重复制备6份本发明药物组合物(按照实施例1的方法制备)样品的游离氨基酸供试品溶液，取每份 供试品溶液0.5μL，进行上述的衍生化反应，注入高效液相色谱仪进行分析，检测到14种氨基酸，记录 14种氨基酸的峰面积响应值，计算峰面积的RSD，结果见表11，14种氨基酸的峰面积响应值的RSD小于 5％，能够满足分析要求。

表11本发明药物组合物供试品中游离氨基酸测定重复性的考察

6.6供试品溶液中游离氨基酸的稳定性

取本发明药物组合物(按照实施例1的方法制备)和本发明原料药鲜守宫粉末(按照实施2的方法制 备)、鲜金钱白花蛇粉末(按照实施3的方法制备)、鲜蕲蛇粉末(按照实施4的方法制备)原料药的游离 氨基酸供试品溶液0.5μL，分别于制备后0h、2h、4h、8h、12h、24h进行上述的衍生化反应，然后注入高 效液相色谱仪进行分析，记录氨基酸的峰面积响应值，计算峰面积的RSD，结果见表12至表15，本发明 药物组合物供试品溶液及原料药鲜金钱白花蛇供试品溶液中氨基酸的峰面积响应值的RSD小于5％，说明所 测氨基酸在24小时内是稳定的。原料药鲜蕲蛇供试品溶液中氨基酸的峰面积响应值在8小时以内的RSD 小于5％，说明所测氨基酸只在8小时内稳定(特别是赖氨酸)。原料药鲜守宫供试品溶液中氨基酸的峰面 积响应值在12小时以内的RSD小于5％，说明所测氨基酸只在12小时内稳定(特别是赖氨酸)。鉴于日内 稳定性考察结果，分别于制备后第一天、第二天、第三天、第四天将本发明药物组合物供试品及原料药鲜 金钱白花蛇供试品溶液进行上述的衍生化反应，注入高效液相色谱仪进行分析，记录氨基酸的峰面积响应 值，计算峰面积的RSD，结果见表16-表17，本发明药物组合物中氨基酸只在一天内是稳定的(特别是 赖氨酸和脯氨酸)，原料药鲜金钱白花蛇供试品溶液中氨基酸的峰面积响应值在四天内的RSD小于5％，说 明所测氨基酸只在四天内稳定。

表12本发明药物组合物供试品溶液中游离氨基酸的日内稳定性考察

表13原料药鲜金钱白花蛇供试品溶液中游离氨基酸的日内稳定性考察

表14原料药鲜蕲蛇供试品溶液中游离氨基酸的日内稳定性考察

表15原料药鲜守宫供试品溶液中游离氨基酸的日内稳定性考察

表16本发明药物组合物供试品溶液中游离氨基酸的日间稳定性考察

表17原料药鲜金钱白花蛇供试品溶液中游离氨基酸的日间稳定性考察

6.7供试品中总氨基酸的稳定性考察

取本发明药物组合物(按照实施例1的方法制备)和本发明原料药鲜金钱白花蛇粉末(按照实施例2 的方法制备)、鲜蕲蛇粉末(按照实施例3的方法制备)、鲜守宫粉末(按照实施例4的方法制备)总氨基 酸供试品溶液0.5μL，分别于制备后0h、2h、4h、8h、12h、24h进行上述的衍生化反应，注入高效液相色 谱仪进行分析，记录氨基酸的峰面积响应值，计算峰面积的RSD，得供试品中总氨基酸的日内稳定性结果， 结果见表18-表21，本发明药物组合物供试品溶液、本发明原料药鲜蕲蛇供试品溶液及鲜守宫供试品溶液 中总氨基酸的测定均需在开启安瓶后立即进行，赖氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸及异亮氨酸的稳定性较差；本 发明原料药鲜金钱白花蛇供试品溶液中总氨基酸的峰面积响应值的RSD在12小时内小于5％，说明在12小 时内是稳定的。

表18本发明药物组合物供试品溶液中总氨基酸的日内稳定性考察

表19鲜守宫供试品溶液中总氨基酸的日内稳定性考察

表20鲜蕲蛇供试品溶液中总氨基酸的日内稳定性考察

表21鲜金钱白花蛇供试品溶液中总氨基酸的日内稳定性考察

6.8供试品溶液游离氨基酸的精密度考察

取本发明药物组合物游离氨基酸的供试品溶液0.5μL，进行上述的衍生化反应，注入高效液相色谱仪 进行分析，重复进样6次，记录氨基酸的峰面积响应值，计算峰面积的RSD，结果见表22，所测氨基酸的 峰面积RSD小于5％，能够满足氨基酸分析的要求。

表22供试品溶液游离氨基酸的精密度考察

6.9回收率考察

取本发明药物组合物样品的游离氨基酸供试品溶液0.5mL于1mL量瓶中，加入17种氨基酸标准品混 合储备液200μL，以水稀释并定容，混匀，重复制备6份，进行上述的衍生化反应，注入高效液相色谱仪 进行色谱分析，记录氨基酸的峰面积响应值，代入标准曲线计算供试品中氨基酸的含量，计算回收率，结 果见表23。

表23回收率测定结果

7、供试品的测定

分别取本发明药物组合物(按照实施例1的制备方法制备)和本发明药物组合物原料药鲜金钱白花蛇 粉末(按照实施例2的制备方法制备)、鲜蕲蛇粉末(按照实施例3的制备方法制备)、鲜守宫粉末(按照 实施例4的制备方法制备)游离氨基酸及总氨基酸的供试品溶液0.5μL，进行上述的衍生化反应，注入高 效液相色谱仪进行分析，记录相应氨基酸的峰面积响应值，代入标准曲线，计算氨基酸的含量，结果见表 24至表27。

表24本发明药物组合物供试品的含量测定

表25原料药鲜守宫供试品的含量测定

表26原料药鲜金钱白花蛇供试品的含量测定

表27原料药鲜蕲蛇供试品的含量测定

六、结论

本发明鲜药金龙胶囊中含有大量氨基酸，应用本发明含量测定方法测定氨基酸可更好控制鲜药制剂的 质量，并且本发明含量测定方法的色谱条件可有效将17中氨基酸进行分离。同时本发明含量测定方法的 方法学考察中精密度、稳定性及重现性良好。鲜药尤其是鲜动物药中氨基酸含量大，本发明奠定了鲜药氨 基酸含量测定的方法，为鲜药质量标准提高奠定了基础。

下述实施例均能实现上述实验例的效果。

实施例1本发明药物组合物胶囊剂的含量测定方法

1、胶囊剂的制备

鲜守宫1500kg、鲜金钱白花蛇750kg、鲜蕲蛇750kg，将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉 糜，研磨成糊状，加等量水匀浆后，置于-25℃冷冻24小时，取出，置于37℃水浴中融化，反复三次，滤 过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊精172kg包结，滤液真空冷冻干燥， 粉碎成细颗粒，低温干燥，制成胶囊剂；

2、含量测定

(1)标准品溶液的制备：

a、0.1mol/L盐酸溶液：取37.5％浓盐酸0.83mL于100mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度；

b、17种氨基酸混合标准品溶液的制备：17种氨基酸分别：天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、 甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、 赖氨酸、脯氨酸；

取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公司)25μL、50μL、100μL、200μL、400μL、800μL于1mL 容量瓶中，以0.1mol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得25-1000pmol/μL系列浓度的氨基酸混合标准 品溶液；

c、1％苯酚的6mol/L盐酸溶液：取苯酚0.5g于50mL棕色量瓶中，加入浓盐酸25mL，加水溶解并定容 至刻度；

d、10mol/L NaOH溶液：取NaOH 20.0g，置于50mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混匀，转移至 塑料储瓶中备用；

e、40mol/L Na₂HPO₄缓冲液：取NaH₂PO₄ 5.5g，加水溶解并定容于1L量瓶中，用10mol/L NaOH溶 液调节pH值至7.8，混匀，即得；

(2)供试品溶液的制备

a、游离氨基酸供试品溶液的制备：取本发明胶囊0.1g，置于50mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度， 超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；

b、总氨基酸供试品溶液的制备：取本发明胶囊0.1g，置于15mL塑料离心管中，加水10mL充分溶解 后，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，取1mL上清液，置于安剖瓶中，加入含1％苯酚的6mol/L 盐酸4mL，真空冲氮N₂30秒，迅速密封，置于110℃恒温干燥箱内水解22小时，取出，放冷至室温，分 别加入2.4mL10mol/L NaOH溶液，混匀，转移至10mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心10 分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；

(3)色谱条件

色谱柱：4.6×150mm，3.5μm Zorbax Eclipse-AAA柱，流速：1.5ml/min，柱温为35℃，自动进样 程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于262nm波长处检测二级氨基酸；以乙腈∶甲醇∶水＝45∶45∶10 为流动相A，PH为7.8的40mmol/L Na₂HPO₄为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序如下：

0-2.5min流动相A浓度为0％，流动相B浓度为100％；

2.5-16min流动相A浓度为30％，流动相B浓度为70％；

16-24min流动相A浓度为57％，流动相B浓度为43％；

24-24.8min流动相A浓度为100％，流动相B浓度为0％；

24.8-29.7min流动相A浓度为100％，流动相B浓度为0％；

29.7-30.9min流动相A浓度为0％，流动相B浓度为100％；

30.9-34.7min流动相A浓度为0％，流动相B浓度为100％；

(4)测定结果

本发明药物组合物胶囊中检测到14种氨基酸，分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨 酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸；其中总蛋白质 的含量为1.9％，总游离氨基酸的含量为12.52％，其中天门冬氨酸含量为0.55％、谷氨酸含量为1.79％、丝 氨酸含量为0.54％、组氨酸含量为0.52％、甘氨酸含量为1.15％、苏氨酸含量为0.62％、丙氨酸含量为2.01％、 缬氨酸含量为0.86％、蛋氨酸含量为0.36％、苯丙氨酸含量为0.5％、异亮氨酸含量为0.53％、亮氨酸含量 为0.96％、赖氨酸含量为1.30％、脯氨酸含量为0.82％；总氨基酸的含量为14.41％，其中天门冬氨酸含量 为0.80％、谷氨酸含量为2.29％、丝氨酸含量为0.72％、组氨酸含量为0.73％、甘氨酸含量为1.53％、苏氨 酸含量为0.73％、丙氨酸含量为2.08％、缬氨酸含量为0.94％、蛋氨酸含量为0.42％、苯丙氨酸含量为0.72％、 异亮氨酸含量为0.72％、亮氨酸含量为1.15％、赖氨酸含量为0.82％、脯氨酸含量为0.76％。

实施例2本发明药物组合物原料药鲜金钱白花蛇的含量测定方法

1、鲜金钱白花蛇粉末的制备

取鲜金钱白花蛇3000g，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水匀浆后，置于-25℃冷冻24小时，取出， 置于37℃水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊 精172g包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末。

2、含量测定

(1)标准品溶液的制备：(同实施例1)

(2)供试品溶液的制备

a、游离氨基酸供试品溶液的制备：取本发明原料药鲜金钱白花蛇样品粉末0.1g，置于25mL量瓶中， 加水溶解并定容至刻度，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得游离氨基 酸供试品溶液；

b、总氨基酸供试品溶液的制备：取本发明原料药鲜金钱白花蛇样品粉末0.1g，置于15mL塑料离心管 中，加水10mL充分溶解后，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，取1mL上清液，置于安剖瓶中， 加入含1％苯酚的6mol/L盐酸4mL，真空冲氮N₂30秒，迅速密封，置于110℃恒温干燥箱内水解22小时， 取出，放冷至室温，分别加入2.4mL10mol/L NaOH溶液，混匀，转移至10mL量瓶中，加水稀释并定容 至刻度，混匀，离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；

(3)色谱条件(同实施例1)

(4)测定结果

本发明原料药鲜金钱白花蛇中检测到12种氨基酸，分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、 苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸；其中总蛋白质的含量为0.13％， 总游离氨基酸的含量为6.02％，其中天门冬氨酸含量为0.25％、谷氨酸含量为0.57％、丝氨酸含量为0.15％、 甘氨酸含量为0.68％、苏氨酸含量为0.39％、丙氨酸含量为1.48％、缬氨酸含量为0.62％、蛋氨酸含量为0.24％、 苯丙氨酸含量为0.51％、异亮氨酸含量为0.40％、亮氨酸含量为0.60％、脯氨酸含量为0.15％；总氨基酸的 含量为6.15％，其中天门冬氨酸含量为0.39％、谷氨酸含量为0.70％、丝氨酸含量为0.30％、甘氨酸含量为 0.74％、苏氨酸含量为0.39％、丙氨酸含量为1.20％、缬氨酸含量为0.53％、蛋氨酸含量为0.28％、苯丙氨 酸含量为0.39％、异亮氨酸含量为0.40％、亮氨酸含量为0.59％、脯氨酸含量为0.23％。

实施例3本发明药物组合物原料药鲜蕲蛇的含量测定方法

1、鲜蕲蛇粉末的制备

取鲜蕲蛇3000g，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水匀浆后，置于-25℃冷冻24小时，取出，置于 37℃水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊精172g 包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末。

2、含量测定

(1)标准品溶液的制备：(同实施例1)

(2)供试品溶液的制备

a、游离氨基酸供试品溶液的制备：取鲜蕲蛇样品粉末0.1g，置于25mL量瓶中，加水溶解并定容至刻 度，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；

b、总氨基酸供试品溶液的制备：取鲜蕲蛇样品粉末0.1g，分别置于15mL塑料离心管中，加水10mL 充分溶解后，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，取1mL上清液，置于安剖瓶中，加入含1％苯酚 的6mol/L盐酸4mL，真空冲氮N₂30秒，迅速密封，置于110℃恒温干燥箱内水解22小时，取出，放冷至 室温，分别加入2.4mL10mol/L NaOH溶液，混匀，转移至10mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀， 离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；

(3)色谱条件(同实施例1)

(4)测定结果

本发明原料药鲜蕲蛇中检测到15种氨基酸，分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、 苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；其中总蛋 白质的含量为18.03％，总游离氨基酸的含量为5.09％，其中谷氨酸含量为0.17％、丝氨酸含量为0.12％、 组氨酸含量为0.18％、甘氨酸含量为0.51％、苏氨酸含量为0.38％、丙氨酸含量为1.13％、缬氨酸含量为0.40％、 异亮氨酸含量为0.22％、亮氨酸含量为0.34％、赖氨酸含量为1.64％；总氨基酸的含量为23.12％，其中天 门冬氨酸含量为2.28％、谷氨酸含量为3.17％、丝氨酸含量为1.18％、组氨酸含量为1.09％、甘氨酸含量为 1.52％、苏氨酸含量为1.39％、丙氨酸含量为2.16％、酪氨酸含量为0.91％、缬氨酸含量为1.60％、蛋氨酸 含量为0.51％、苯丙氨酸含量为1.11％、异亮氨酸含量为1.22％、亮氨酸含量为2.17％、赖氨酸含量为2.11％、 脯氨酸的含量为0.74％。

实施例4本发明药物组合物原料药鲜守宫的含量测定方法

1、鲜守宫粉末的制备

取鲜守宫3000g，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水匀浆后，置于-25℃冷冻24小时，取出，置于 37℃水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊精172g 包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末。

2、含量测定

(1)标准品溶液的制备：(同实施例1)

(2)供试品溶液的制备

a、游离氨基酸供试品溶液的制备：取鲜守宫粉末0.1g，置于50mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度， 超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；

b、总氨基酸供试品溶液的制备：取鲜守宫粉末0.1g，置于15mL塑料离心管中，加水10mL充分溶解 后，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，取1mL上清液，置于安剖瓶中，加入含1％苯酚的6mol/L 盐酸4mL，真空冲氮N₂30秒，迅速密封，置于110℃恒温干燥箱内水解22小时，取出，放冷至室温，分 别加入2.4mL10mol/L NaOH溶液，混匀，转移至10mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心10 分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；

(3)色谱条件(同实施例1)

(4)测定结果

本发明药物组合物原料药鲜守宫中检测到14种氨基酸，分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨 酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸；其中 总蛋白质的含量为1.77％；总游离氨基酸的含量为22.50％，其中天门冬氨酸含量为1.33％、谷氨酸含量为 3.29％、丝氨酸含量为0.95％、组氨酸含量为0.72％、甘氨酸含量为1.64％、苏氨酸含量为0.98％、丙氨酸 含量为2.48％、缬氨酸含量为1.36％、蛋氨酸含量为0.68％、苯丙氨酸含量为0.93％、异亮氨酸含量为1.00％、 亮氨酸含量为1.67％、赖氨酸含量为4.13％、脯氨酸含量为1.36％；总氨基酸的含量为24.26％，其中天门 冬氨酸含量为1.92％、谷氨酸含量为4.39％、丝氨酸含量为1.19％、组氨酸含量为0.95％、甘氨酸含量为2.16％、 苏氨酸含量为1.22％、丙氨酸含量为2.62％、缬氨酸含量为含量为1.60％、蛋氨酸含量为0.71％、苯丙氨酸 含量为1.20％、异亮氨酸含量为1.20％、亮氨酸含量为1.89％、赖氨酸含量为2.06％、脯氨酸含量为1.17％。

实施例5本发明药物组合物片剂的含量测定

1、本发明药物组合物片剂的制备

鲜守宫800kg、鲜金钱白花蛇1000kg、鲜蕲蛇500kg，将鲜守宫、鲜金钱白花蛇和鲜蕲蛇共斩剁成肉 糜，研磨成糊状，加4倍体积水匀浆后，置于-20℃冷冻24小时，取出，置于25℃融化，滤过，滤液以 14000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊精40kg包结后真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒， 加入淀粉132kg，混匀，低温干燥，制成片剂。

2、含量测定

(1)标准品溶液的制备：

a、0.1mol/L盐酸溶液：取36.5％浓盐酸0.83mL于100mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度；

b、系列浓度17种氨基酸混合标准品溶液的制备：17种氨基酸分别：天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、 组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；

取17种氨基酸混合标准品溶液(购于安捷伦公司)25μL、50μL、100μL、200μL、400μL、800μL于1mL 容量瓶中，以0.1mol/L盐酸水溶液稀释并定容至刻度，得251000pmol/μL系列浓度的氨基酸混合标准 品溶液；

c、1％苯酚的6mol/L盐酸溶液：取苯酚0.5g于50mL棕色量瓶中，加入浓盐酸25mL，加水溶解并定容 至刻度；

d、10mol/L NaOH溶液：称取NaOH 20.0g，置于50mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混匀，转移 至塑料储瓶中备用；

e、40mol/L Na₂HPO₄缓冲液：称取NaH₂PO₄ 5.5g，加水溶解并定容于1L量瓶中，用10mol/L NaOH 溶液调节pH值至7.8，混匀，即得；

(2)供试品溶液的制备

a、游离氨基酸供试品溶液的制备：取本发明片剂0.1g，依次置于25mL量瓶中，加水溶解并定容至刻 度，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；

b、总氨基酸供试品溶液的制备：取本发明片剂0.1g，分别置于15mL塑料离心管中，加水10mL充分 溶解后，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，取1mL上清液，置于安剖瓶中，加入含1％苯酚的 6mol/L盐酸4mL，真空冲氮N₂30秒，迅速密封，置于110℃恒温干燥箱内水解22小时，取出，放冷至室 温，分别加入2.4mL10mol/L NaOH溶液，混匀，转移至10mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀， 离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；

(3)色谱条件

色谱柱：4.6×150mm，3.5μm Zorbax Eclipse-AAA柱，流速：1.5ml/min，柱温为35℃，自动进样 程序，紫外检测器于338nm处检测一级氨基酸，于262nm波长处检测二级氨基酸；以乙腈∶甲醇∶水＝45∶45∶10 为流动相A，PH为7.8的40mmol/L Na₂HPO₄为流动相B，进行梯度洗脱，洗脱程序如下：

0-2.5min流动相A浓度为0％，流动相B浓度为100％；

2.5-16min流动相A浓度为30％，流动相B浓度为70％；

16-24min流动相A浓度为57％，流动相B浓度为43％；

24-24.8min流动相A浓度为100％，流动相B浓度为0％；

24.8-29.7min流动相A浓度为100％，流动相B浓度为0％；

29.7-30.9min流动相A浓度为0％，流动相B浓度为100％；

30.9-34.7min流动相A浓度为0％，流动相B浓度为100％；

(4)、测定结果

本发明药物组合物片剂中检测到14种氨基酸，分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨 酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸；其中总蛋白质 的含量为2.8％，总游离氨基酸的含量为15.73％，其中天门冬氨酸含量为0.75％、谷氨酸含量为1.99％、丝 氨酸含量为0.74％、组氨酸含量为0.62％、甘氨酸含量为1.30％、苏氨酸含量为0.84％、丙氨酸含量为2.61％、 缬氨酸含量为1.06％、蛋氨酸含量为0.40％、苯丙氨酸含量为0.6％、异亮氨酸含量为0.73％、亮氨酸含量 为1.26％、赖氨酸含量为1.71％、脯氨酸含量为1.12％；总氨基酸的含量为17.05％，其中天门冬氨酸含量 为1.10％、谷氨酸含量为2.39％、丝氨酸含量为1.02％、组氨酸含量为1.03％、甘氨酸含量为1.63％、苏氨 酸含量为0.75％、丙氨酸含量为3.08％、缬氨酸含量为1.04％、蛋氨酸含量为0.62％、苯丙氨酸含量为0.92％、 异亮氨酸含量为0.94％、亮氨酸含量为含量为1.65％、赖氨酸含量为0.92％、脯氨酸含量为0.96％。 实施例6本发明药物组合物中原料药鲜金钱白花蛇粉末的含量测定

1、原料药鲜金钱白花蛇的制备

取鲜金钱白花蛇3000g，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水匀浆后，置于-25℃冷冻24小时，取出， 置于37℃水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊 精172重量份包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末。

2、含量测定

(1)标准品溶液的制备：(同实施例5)

(2)供试品溶液的制备

a、游离氨基酸供试品溶液的制备：取鲜金钱白花蛇粉末0.1g，置于50mL量瓶中，加水溶解并定容至 刻度，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；

b、总氨基酸供试品溶液的制备：取鲜金钱白花蛇粉末0.1g，分别置于15mL塑料离心管中，加水10mL 充分溶解后，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，取1mL上清液，置于安剖瓶中，加入含1％苯酚 的6mol/L盐酸4mL，真空冲氮N₂30秒，迅速密封，置于110℃恒温干燥箱内水解22小时，取出，放冷至 室温，分别加入2.4mL10mol/L NaOH溶液，混匀，转移至10mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀， 离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；

(3)色谱条件(同实施例5)

(4)测定结果

上述原料药鲜金钱白花蛇中检测到12种氨基酸，分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏 氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸；其中总蛋白质的含量为0.18％， 总游离氨基酸的含量为7.79％，其中天门冬氨酸含量为0.43％、谷氨酸含量为0.78％、丝氨酸含量为0.20％、 甘氨酸含量为0.98％、苏氨酸含量为0.19％、丙氨酸含量为1.93％、缬氨酸含量为0.62％、蛋氨酸含量为0.33％、 苯丙氨酸含量为0.71％、异亮氨酸含量为0.55％、亮氨酸含量为0.87％、脯氨酸含量为0.20％；总氨基酸的 含量为8.19％，其中天门冬氨酸含量为0.55％、谷氨酸含量为0.98％、丝氨酸含量为0.44％、甘氨酸含量为 1.02％、苏氨酸含量为0.51％、丙氨酸含量为1.68％、缬氨酸含量为0.73％、蛋氨酸含量为0.40％、苯丙氨 酸含量为0.41％、异亮氨酸含量为0.35％、亮氨酸含量为0.79％、脯氨酸含量为0.33％。

实施例7本发明药物组合物中原料药鲜蕲蛇粉末的含量测定

1、原料药鲜蕲蛇粉末的制备

取鲜蕲蛇3000g，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水匀浆后，置于-25℃冷冻24小时，取出，置于 37℃水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊精172g 包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，制成粉末。

2、含量测定

(1)标准品溶液的制备：(同实施例5)

(2)供试品溶液的制备

a、游离氨基酸供试品溶液的制备：取原料药鲜蕲蛇粉末0.1g，置于50mL量瓶中，加水溶解并定容至 刻度，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶液；

b、总氨基酸供试品溶液的制备：取原料药鲜蕲蛇粉末0.1g，置于15mL塑料离心管中，加水10mL充 分溶解后，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，取1mL上清液，置于安剖瓶中，加入含1％苯酚的 6mol/L盐酸4mL，真空冲氮N₂30秒，迅速密封，置于110℃恒温干燥箱内水解22小时，取出，放冷至室 温，加入2.4mL10mol/LNaOH溶液，混匀，转移至10mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度，混匀，离心 10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；

(3)色谱条件(同实施例5)

(4)测定结果

上述原料药鲜蕲蛇中检测到15种氨基酸，分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、 苏氨酸、丙氨酸、酪氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸；其中总蛋 白质的含量为25.13％，总游离氨基酸的含量为6.9％，其中谷氨酸含量为0.21％、丝氨酸含量为0.17％、组 氨酸含量为0.25％、甘氨酸含量为0.68％、苏氨酸含量为0.42％、丙氨酸含量为1.53％、缬氨酸含量为0.58％、 异亮氨酸含量为0.30％、亮氨酸含量为0.42％、赖氨酸含量为2.34％；总氨基酸的含量为32.88％，其中天 门冬氨酸含量为3.21％、谷氨酸含量为4.37％、丝氨酸含量为1.56％、组氨酸含量为1.43％、甘氨酸含量为 2.23％、苏氨酸含量为1.89％、丙氨酸含量为3.06％、酪氨酸含量为1.31％、缬氨酸含量为2.35％、蛋氨酸 含量为0.70％、苯丙氨酸含量为1.88％、异亮氨酸含量为1.68％、亮氨酸含量为3.07％、赖氨酸含量为3.02％、 脯氨酸的含量为1.12％。

实施例8本发明药物组合物中原料药鲜守宫粉末的含量测定

1、原料药鲜守宫粉末的制备

取鲜守宫3000g，斩剁成肉糜，研磨成糊状，加等量水匀浆后，置于-25℃冷冻24小时，取出，置于 37℃水浴中融化，反复三次，滤过，滤液以8000转/分离心，吸取上清液，超滤，取滤液加β-环糊精172g 包结，滤液真空冷冻干燥，粉碎成细颗粒，低温干燥，按照常规工艺加入常规辅料制成片剂。

2、含量测定

(1)标准品溶液的制备：(同实施例5)

(2)供试品溶液的制备：

a、游离氨基酸供试品溶液的制备：取本发明原料药鲜守宫粉末0.1g，置于50mL量瓶中，加水溶解并 定容至刻度，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得游离氨基酸供试品溶 液；

b、总氨基酸供试品溶液的制备：取本发明原料药鲜守宫粉末0.1g，置于15mL塑料离心管中，加水 10mL充分溶解后，超声提取30分钟，离心10分钟，取上清液，取1mL上清液，置于安剖瓶中，加入含 1％苯酚的6mol/L盐酸4mL，真空冲氮N₂30秒，迅速密封，置于110℃恒温干燥箱内水解22小时，取出， 放冷至室温，分别加入2.4mL10mol/LNaOH溶液，混匀，转移至10mL量瓶中，加水稀释并定容至刻度， 混匀，离心10分钟，取上清液，过0.45μm微孔滤膜，得总氨基酸供试品溶液；

(3)色谱条件(同实施例5)

(4)测定结果

本发明原料药鲜守宫中检测到14种氨基酸，分别为天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、 苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸和脯氨酸；其中总蛋白质的含 量为2.42％；总游离氨基酸的含量为29.94％，其中天门冬氨酸含量为1.95％、谷氨酸含量为4.19％、丝氨 酸含量为1.22％、组氨酸含量为0.82％、甘氨酸含量为1.98％、苏氨酸含量为1.35％、丙氨酸含量为3.28％、 缬氨酸含量为1.86％、蛋氨酸含量为0.83％、苯丙氨酸含量为1.25％、异亮氨酸含量为1.32％、亮氨酸含量 为1.98％、赖氨酸含量为6.03％、脯氨酸含量为1.88％；总氨基酸的含量为32.33％，其中天门冬氨酸含量 为1.98％、谷氨酸含量为6.29％、丝氨酸含量为1.59％、组氨酸含量为0.99％、甘氨酸含量为3.12％、苏氨 酸含量为1.42％、丙氨酸含量为3.72％、缬氨酸含量为含量为1.95％、蛋氨酸含量为0.81％、苯丙氨酸含量 为1.76％、异亮氨酸含量为1.65％、亮氨酸含量为2.32％、赖氨酸含量为3.05％、脯氨酸含量为1.68％。