膀胱癌患者尿液特异性代谢物谱、建立方法及用途

摘要

本发明提供了膀胱癌患者尿液特异性代谢物谱、建立方法及用途，特别是一种建立膀胱癌患者尿液中特异性代谢物谱的方法，以及筛选相关特异性生物标记物的方法。本发明通过代谢组学，特别是基于液相色谱质谱联用分析技术的代谢组学，建立了膀胱癌患者尿液特异性代谢物谱。本发明为早期诊断膀胱癌以及不同病理分期的膀胱癌疾病提供了依据，并提供了膀胱癌患者尿液中特异性代谢物谱以及相关特异性生物标记物。本发明所提供的方法具有无创，方便快捷的特点，并且能够准确反映膀胱癌患者与正常人的代谢谱差异，特异性高。

说明书

技术领域

本发明涉及癌症，特别是膀胱癌。本发明还涉及代谢组学，特别是基于液相色谱质谱联用分析技术的代谢组学。本发明为早期诊断膀胱癌以及不同病理分期的膀胱癌疾病提供了依据，并提供了膀胱癌患者尿液中特异性代谢物谱以及相关特异性生物标记物。并且本发明还提供了建立膀胱癌患者尿液中特异性代谢物谱以及筛选相关特异性生物标记物的方法。 

背景技术

膀胱癌是临床上常见的肿瘤之一，世界范围内，膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第九位[1]。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童，但是主要发病年龄为中年以后，并且其发病随着年龄的增长而增加。在我国，男性膀胱癌发病率居全身肿瘤的第八位，女性排在十二位以后，发病率远低于西方国家。近年来，我国部分城市肿瘤发病率报告显示成升高趋势，膀胱癌男性发病率为女性的3～4倍[2]。目前对于膀胱癌的诊断缺乏比较统一的标准并且现有的诊断方法如症状观察(血尿)、超声检查、CT检查、细胞学检查以及膀胱镜等都具有一定的缺陷，例如，症状的观察则主观性太强，超声检查、CT检查、细胞学检查以及膀胱镜等均为侵入式诊断，给患者带来额外的痛苦；现已发现的尿液中单一的肿瘤标志物诊断则存在敏感性和特异性差，假阳性率较高等缺点，开发一种无创、特异性、准确的膀胱癌诊断方法具有重要的意义[3、4]。 

代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后发展起来的一门系统生物学学科，研究生物体在内在或者外在因素影响后其内源性代谢物种类、数量以及变化规律。代谢组学对有机体的整个代谢谱进行分析， 探寻代谢物与生理病理变化之间的对应关系，从而为疾病诊断提供依据。Pasikanti等采用气相色谱质谱联用分析了尿液中的代谢物谱，其代谢组学的方法具有100％的灵敏度，可用于膀胱癌的早期诊断和疾病分期[5]。然而，气相色谱质谱联用分析仅能够分析极性较低的代谢物，并且该方法需要衍生化步骤，操作繁琐，重现性较差，成本高。 

发明内容

针对现有膀胱癌诊断方法的有创伤性，侵入性等缺点，本发明所要解决的问题是提供一种代谢组学技术为膀胱癌早期诊断提供依据，该方法具有灵敏度高，特异性好，无创等优点。 

本发明采用液相色谱质谱联用的分析方法，对尿液仅需简单处理，成本低廉，适合大规模筛查，并且同样具有良好的特异性和灵敏度，具有非常好的应用前景。 

本发明为早期诊断膀胱癌以及不同病理分期的膀胱癌疾病提供了依据。通过寻找膀胱癌患者尿液中特异性代谢物谱以及相关特异性生物标记物，建立检测该生物标记物的方法。 

本发明运用基于液相色谱质谱联用分析技术成批分析正常人群和膀胱癌患者群的尿液样本的代谢物谱，并用模式识别进行分析比较正常人群与膀胱癌患者群的代谢物谱，确定特异性液相色谱质谱数据，定性或者定量分析膀胱癌患者得特异性代谢物谱数据，为后续理论研究和临床诊断提供依据。 

本发明提供了一种代谢组学技术在膀胱癌疾病中的应用，其步骤为： 

(1)样本的收集与处理：收集临床病人或者模型动物的尿液样本；样本经过有机溶剂进行液液萃取，有机溶剂包括但不限于乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙腈等；或者经过蛋白沉淀，蛋白沉淀方法包括加入有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇)、各类酸碱盐沉淀、加热沉淀、过滤/超滤、固相萃取，离心等方法单独或者综合的方式进行处理；样本进行干燥或者不进行干燥再利用各 种有机溶剂(例如甲醇，乙腈，异丙醇，氯仿等，优选为甲醇、乙腈)或者水(单独或者组合，不含盐或者含盐)溶解；样本不进行衍生化或者利用试剂(例如三甲基硅烷，氯甲酸乙酯，N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺等)进行衍生化处理。 

(2)液相色谱质谱分析测定(HPLC-MS)：采用基于液相色谱和质谱的方法得到尿液中的代谢物谱，代谢物谱经过处理得到各个峰的峰高或者峰面积以及质量数和保留时间等数据。 

(3)模式识别分析尿液中代谢物谱：上述数据采用多变量数据统计软件，可以为R、MATLAB、SPSS、SIMCA-P等，选用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法(PLS)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法(OPLS)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)、聚类分析等方法建立数学模型，对步骤(2)中产生的代谢物谱进行分析，比较正常人与膀胱癌患者代谢物谱的差异，从而确定特异性代谢物谱。 

(4)生物标记物：发现了一组尿液中的生物标记物用于膀胱癌疾病的诊断或者为膀胱癌早期诊断提供依据。 

机体内源性小分子是生命活动的基础，疾病的状态与机体功能的变化必然会引起内源性小分子在体内代谢的变化，研究表明，正常人与膀胱癌病人的代谢谱存在明显的差异，并且处于不同病理期膀胱癌患者的代谢谱同样存在着明显的差异，代谢组学技术有助于膀胱癌等疾病的诊断。 

1.检测尿液中的代谢物谱和相关的生物标记物，与目前常用膀胱镜检查、细胞学检查等侵入性方法相比，具有无创，方便快捷的特点。 

2.准确反映膀胱癌患者与正常人的代谢谱差异，特异性高。 

不希望受任何理论的限制，发明人指出这些生物标志物是存在于人体中的内源性化合物。通过本发明所述的方法对受试者尿液的代谢物谱进行分析，代谢物谱中的质量数值指示相应生物标志物的存在及在代谢物谱中的对应位置。同时，膀胱癌患者的所述生物标志物在其代谢物谱中表现出一定的含量范围值。 

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。 

本发明一方面提供了一种建立受试者尿液代谢物谱的方法，包括以下步骤： 

(1)样本的收集与处理：收集受试者的尿液样本，经处理去除蛋白质等大分子； 

(2)液相色谱质谱分析测定：采用基于液相色谱和质谱的方法得到尿液中的代谢物谱，并对代谢谱进行分析。 

本发明另一方面提供了一种建立膀胱癌患者尿液特异性代谢物谱的方法，包括以下步骤： 

(1)样本的收集与处理：收集临床病人与正常人的尿液样本，经处理去除蛋白质等大分子； 

(2)液相色谱质谱分析测定：采用基于液相色谱和质谱的方法得到尿液中的代谢物谱，并对代谢谱进行分析； 

(3)模式识别分析尿液中代谢物谱：上述数据采用多变量数据统计软件建立数学模型，对步骤(2)中产生的代谢物谱进行分析，比较正常人与膀胱癌患者代谢物谱的差异，从而确定特异性代谢物谱。 

在本发明所述的一种建立受试者尿液代谢物谱的方法或一种建立膀胱癌患者尿液特异性代谢物谱的方法中，步骤(1)中的处理包括样本经过有机溶剂进行液液萃取；或者经过蛋白沉淀；样本进行干燥或者不进行干燥，再利用单独或者组合的有机溶剂或者水进行溶解，所述水不合盐或者含盐，盐包括氯化钠，磷酸盐，碳酸盐等；样本不进行衍生化或者利用试剂进行衍生化处理。 

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(1)有机溶剂进行液液萃取中，所述有机溶剂包括但不限于乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙腈。 

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(1)蛋白沉淀中，包括但不限于加入有机溶剂、各类酸碱盐沉淀、加热沉淀、过滤/超滤、固相萃取、离心方法单独或者组合的方式进行处理，其中所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、异丙醇。 

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(1)中优选地包括使用蛋白沉淀方法进行处理，优选地使用乙醇进行蛋白沉淀。 

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(1)样本进行干燥或者不进行干燥，再利用有机溶剂或者水溶解中，所述有机溶剂包括甲醇、乙腈、异丙醇、氯仿，优选为甲醇、乙腈。 

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(1)样本利用试剂进行衍生化处理中，所述试剂包括三甲基硅烷，氯甲酸乙酯，N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺。 

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(2)中代谢物谱经过处理得到原始数据，所述原始数据优选地是各个峰的峰高或者峰面积以及质量数和保留时间等数据。 

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(2)中，对原始数据进行峰检测和峰匹配，优选地采用XCMS软件进行所述峰检测和峰匹配。

在本发明的一个具体实施方式中，步骤(3)中的多变量数据统计软件包括R、MATLAB、SPSS、SIMCA-P，选用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法(PLS)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘法(OPLS)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)、聚类分析方法或这些方法的一种或多种建立数学模型，优选地使用XCMS软件行峰检测和峰匹配，采用R软件采用O-PLS-DA对正常组代谢物谱和膀胱癌组代谢物谱进行差异性变量进行模式识别分析，建立O-PLS-DA数学模型； 

本发明另一方面包括使用本发明所提供的种建立膀胱癌患者尿液特异性代谢物谱的方法建立的膀胱癌患者尿液特异性代谢物谱。 

本发明进一步提供了所述代谢物谱的用途，其用于判断所述受试者是否患有膀胱癌，其中包括以下步骤：将受试者样本根据本发明所 述的方法进行分析，并将结果与本发明所述的膀胱癌患者尿液特异性代谢物谱进行比较，优选地利用多元统计模型归类进行比较，从而判断所述受试者是否患有膀胱癌。 

本发明还包括筛选尿液中的生物标记物的方法，除了上述步骤(1)-(3)外，其进一步包括以下步骤用于筛选膀胱癌患者尿液中的生物标记物，所述生物标记物用于膀胱癌疾病的诊断或者为膀胱癌早期诊断提供依据： 

采用主成分分析方法和OPLS-DA对正常组代谢物谱和膀胱癌组代谢物谱进行差异性变量进行模式识别分析，优选地采用SIMCA-P+12.0.1软件，进一步通过VIP值和S-plot筛选潜在的生物标志物。 

在本发明所述筛选尿液中的生物标记物的方法中，根据模式识别模型OPLS-DA的VIP值筛选潜在标志物，在OPLS-DA模型中提取VIP值大于3的变量，并进一步根据荷载图和S-plot图进一步选择具有较大偏差和相关性的变量，以及结合P值小于0.05的变量。 

本发明还包括根据上述筛选尿液中的生物标记物的方法，得到的膀胱癌的生物标志物，所述生物标志物是在OPLS-DA模型中提取VIP值大于3的变量，并在荷载图和S-plot图中具有较大偏差和相关性的变量，以及结合P值小于0.05的变量。 

本发明所述的生物标志物优选地包括表1所示21种生物标记物中的一种或多种，优选地至少包括表1中的CHO₈N，并且包括表1中的至少1种，2种，3种，4种，5种，6种，7种，8种，9种，10种，15种，或21种。 

本发明另一方面还涉及使用本发明所述的生物标志物用于诊断膀胱癌的用途，其中受试者尿液经本发明所述的种建立受试者尿液代谢物谱的方法进行分析，并根据所得受试者尿液代谢物谱确定本发明所述的生物标志物。 

本发明进一步包括所述的生物标志物在制备用于诊断膀胱癌的试剂盒中的用途。 

附图说明

图1.膀胱癌患者组(a)和正常人组(b)质谱总离子流图. 

图2.K-O-PLS-DA模型。PZC-train为正常组训练集，PZC-test正常组预测集；PGC-train为膀胱癌组训练集，PGC-test膀胱癌组预测集。 

图3.主成分分析得分图。菱形代表正常组，正方形代表膀胱癌组。 

图4.主成分分析荷载图。带框三角形代表VIP值大于3的变量。 

图5.OPLS-DA得分图。菱形代表正常组，正方形代表膀胱癌组。 

图6.S-plot图。带框三角形代表VIP值大于3的变量。 

实施例

实施例1 

1.1样本收集：收集志愿者的晨尿，立即置于-80℃低温冰箱中储存。正常组共收集34份尿液样本，膀胱癌组共收集48份尿液样本。 

1.2样本的处理：冰冻的样本置于室温下解冻，取尿液样本500μL至于2.0mL离心管中，加入甲醇500μL稀释，10000rpm离心5min，备用。 

1.3液相色谱质谱联用分析 

仪器设备 

HPLC-MS-LTQ Orbitrap Discovery(Thermo，Germany) 

色谱条件 

色谱柱：C18柱(150mm×2.1mm，5μm)；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～3min，5％B，3～36min，5％～80％B，36～40min，80％～100％B，40～45min，100％B，45～50min，100％～5％B，50～60min，5％B；流速：0.2mL/min；进样体积20μL。 

质谱条件 

ESI离子源，正离子模式采集数据，扫描质量m/z 50～1000。离子源参数ESI：鞘气为10，辅气为5，毛细管温度为350℃，锥孔电压4.5KV。 

1.4数据处理 

采用XCMS软件(例如得自http://metlin.scripps.edu/xcms/)对原始数据进行峰检测和峰匹配，采用R软件采用O-PLS-DA(Orthogonalprojections to latent structures discriminant analysis)对正常组代谢物谱(图1b)和膀胱癌组代谢物谱(图1a)进行差异性变量进行模式识别分析，建立O-PLS-DA数学模型。 

1.5比较和确定特征性代谢物谱 

通过比较正常组与膀胱癌组的尿液代谢物谱图，建立膀胱癌患者尿液代谢物谱(图1)，并通过K-O-PLS-DA模型，对未知样本进行预测，有助于膀胱癌疾病的诊断。初步研究结果，正常和膀胱癌组在tp方向上能够被较好的区分；通过选取80％正常组与膀胱癌组代谢物谱数据采用K-O-PLS-DA建模作为训练集(PZC-train和PGC-train)，该模型能够100％准确预测20％剩余测试样本的分组(PZC-test和PGC-test)，具有较高的准确度和特异性，具有良好的开发为诊断方法的前景，从而为膀胱癌疾病的诊断提供依据(图2)。 

实施案例2 

2.1样本收集：收集志愿者的晨尿，立即置于-80℃低温冰箱中储存。正常组共收集34份尿液样本，膀胱癌组共收集48份尿液样本。 

2.2样本的处理：冰冻的样本置于室温下解冻，取尿液样本500μL至于2.0mL离心管中，加入甲醇500μL稀释，10000rpm离心5min，备用。 

2.3液相色谱质谱联用分析 

仪器设备 

HPLC-MS-LTQ Orbitrap Discovery(Thermo，Germany) 

色谱条件 

色谱柱：C18柱(150mm×2.1mm，5μm)；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～3min，5％B，3～36min，5％～80％B，36～40min，80％～100％B，40～45min，100％ B，45～50min，100％～5％B，50～60min，5％B；流速：0.2mL/min；进样体积20μL。 

质谱条件 

ESI离子源，正离子模式采集数据，扫描质量m/z 50～1000。离子源参数ESI：鞘气为10，辅气为5，毛细管温度为350℃，锥孔电压4.5KV。 

2.4数据处理 

采用XCMS软件对原始数据进行相关前处理，得到二维矩阵数据，T-test统计代谢物峰的显著性差异；采用SIMCA-P+12.0.1软件采用主成分分析方法(PCA)和OPLS-DA(Orthogonal partial least squaresproject to latent structures-discriminant analysis)对正常组代谢物谱(图1b)和膀胱癌组代谢物谱进行差异性变量进行模式识别分析，结合VIP和S-plot图筛选出潜在的生物标志物。 

2.5代谢谱分析和潜在的生物标志物 

2.5.1主成分分析(PCA) 

PCA是一种无师监督模式识别方法，可以直观地在多维空间上描述样本间的差异。从图2可知，在PCA模型中，两组在第一主成分方向上基本分开，表明正常组和膀胱癌组的尿液代谢谱存在明显的区别。膀胱癌组样本分布在正常组的两端，表明膀胱癌组样本自身存在明显的差异，见图3、4。 

2.5.2正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA) 

采用OPLS-DA方法来区分正常组和膀胱癌组，进一步通过VIP值和S-plot筛选潜在标志物。从图4可知，正常组和膀胱癌组在t[1]方向上得到明显的区分。如图5所示，S-plot图中每个点代表一个变量，S-plot图表明变量与模型的相关性。带框三角形标记的变量为VIP大于3的变量，它们具有较大的偏差并且与模型有良好的相关性，见图5、6。 

2.5.3潜在生物标记物 

根据模式识别模型OPLS-DA的VIP值筛选潜在标志物，在OPLS-DA模型中提取VIP值大于3的变量，并进一步根据荷载图和S-plot图进一步选择具有较大偏差和相关性的变量，以及结合P值小于 0.05的变量，共得到21个潜在的生物标记物，如表1所示。 

表1潜在的生物标记物 

参考文献： 

1.Parkin MD，Bray F，Ferlay J，et al.Global Cancer Statistics，2002.A Cancer Journal for Clinicians，2005，55，74-108 

2.徐桂兰，奉兆民，段纪俊，等.武汉市1995年-1997年恶性肿瘤发病分析.中国肿瘤，2002，11，455-456 

3.Schroeder GL，Lorenzo Gomez MF，Hautmann SH，et al.Aside by side comparison of cytology and biomarkers for bladder cancer detection.The Journal of Urology，2004，172，1123-1126 

4.Glas AS，Roos D，Deutekom M，Zwinderman AH，Bossuyt PM，Kurth KH.Tumor markers in the diagnosis of primary bladdercancer.a systematic review.The Journal of Urology，2003，169，1975-1982 

5.Kishore Kumar Pasikanti，Kesavan Esuvaranathan，Paul C.Ho，et al.Noninvasive urinary metabonomic diagnosis of humanbladder cancer.Journal of Proteome Research，2010，9，2988-2995。