Roundup Ready转基因大豆检测用引物组及其检测试剂盒

摘要

本发明公开Roundup Ready转基因大豆检测用引物组及其检测试剂盒。本试剂盒由引物组、BstDNA聚合酶、稳定液、反应液、显色液和阳性对照液组成，该试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，具有高特异性。本发明的快速诊断试剂盒快速、高效、灵敏度高，只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低，而且鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种Roundup Ready转基因大豆检测用引物组及其诊断试剂盒。

背景技术

孟山都公司于1994年研制的抗草甘膦品种大豆，转化了来自于微生物Agrobacterium tumefaciens的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（CP4 EPSPS）编码基因，能够抵抗除草剂草甘膦对莽草酸合成途径的抑制，使转基因大豆在喷洒除草剂之后能够正常生长。该品种的受体是大豆品种A5403，转基因大豆基因组中整合了外源的 CP4 EPSPS 基因、E35S 启动子和NOS 终止子。该品种是目前种植面积最大的转基因大豆品种，广泛应用在食用油和食品的加工生产当中。

为了加强对转基因产品的监督和管理，目前发展了多种转基因成分检测方法，从基于蛋白质的 ELISA 检测技术到基于核酸的聚合酶链式反应（PCR）技术以及快速发展的基因芯片技术。其中 PCR 检测技术以其灵敏性、特异性、高效性而最为通用，这种技术通过检测转基因产品中含有的外源核酸片段来鉴定，随着荧光实时定量聚合酶链式反应（real time PCR）的出现，不仅能够进行转基因产品的定性鉴定，而且可以对转基因成分进行定量。

以 PCR 技术为代表的转基因产品检测技术在实际应用中也存在一些问题，如普通 PCR 技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而 Real time PCR 技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。基因芯片技术能够实现快速和高通量的检测，然而价格昂贵，检测成本高。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足转基因产品检测要求的不断提高具有重要意义。其中等温扩增（Isothermal Amplification）核酸快速检测技术是转基因产品检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplication of DNA, 简称LAMP）具有很多的优越性，且目前也未见有用环介导等温扩增技术检测 转基因大豆快速诊断试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种对可用于环介导等温扩增技术检测Roundup Ready转基因大豆EPSPS-NOS基因，且对该EPSPS-NOS基因具有高特异性的检测用引物组。

本发明的另一个目的在于提供一种检测成本低、使用方便、检测速度快、特异性高的基于环介导等温扩增技术的转基因大豆快速诊断试剂盒。

本发明的上述目的是通过如下技术方案予以实现的：

一、本发明的Roundup Ready转基因检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术，根据已公开的Roundup Ready转基因大豆EPSPS -NOS基因序列，选取Roundup Ready转基因大豆EPSPS-NOS基因的特异性序列，然后分析设计出的，能专一性鉴别Roundup Ready转基因大豆EPSPS-NOS基因的特异性引物组，通过LAMP法来鉴定Roundup Ready转基因大豆EPSPS-NOS基因，该EPSPS-NOS基因引物组由如下四条引物组成：

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

或者，

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

或者，

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

或者，

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；

或者，

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。

二、本发明的大豆内源性基因lectin基因检测用引物组，是基于环介导等温扩增技术，根据已公开的lectin基因序列，选取lectin基因的特异性序列，然后分析设计出的，通过LAMP法来鉴定lectin基因，该内源性基因lectin引物组由如下四条引物组成：

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示；

或者，

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。

三、本发明的Roundup Ready转基因大豆快速诊断试剂盒，是由EPSPS-NOS基因引物、lectin基因引物、BstDNA 聚合酶、反应液、稳定液、显色液和阳性对照液组成，以上七种液体分别置于容器中，其中：

上述每1L反应液中含有1.6～2mmol dNTP、20～25mmol Tris-HCl、10～12.5mmol氯化钾、10～12.5mmol硫酸铵、8～10mmol硫酸镁、1～1.25ml TritonX-100、0.8～1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6～2mol和外引物 F3/B3各0.2～0.25mol；优选的比例是每1L反应液中含有2mmol dNTP、25mmol Tris-HCl、12.5mmol氯化钾、12.5mmol硫酸铵、10mmol硫酸镁、1.25ml TritonX-100、1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol和外引物 F3/B3各0.25mol。 

上述显色液优选为荧光染料 SYBR Green I或EvaGreen。

上述稳定液优选为石蜡油。

上述阳性对照为 EPSPS-NOS 基因 DNA 片段。

四、本发明基因快速诊断试剂盒的生产工艺

1、分别将EPSPS-NOS基因和lectin基因内引物FIP/BIP和外引物 F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；

2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；

3、将稳定液无菌分装，抽样质检；

4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

5、组装试剂盒。

五、本发明基因快速诊断试剂盒的检测方法

1、样品处理

待测样品中DNA的提取和含量测定按国标按照GB/T 19495.3-2004中的规定执行。对样品进行DNA 提取时要保证DNA的质量和浓度的稳定，以保证PCR 反应的可重复性。要确保提取的DNA 片段大于扩增片段。

2、环介导等温扩增技术反应过程

在反应管中加入反应液38～40体积％，Bst DNA聚合酶大片段0.9～1.8体积％，稳定液52～54.5体积％，样品模板DNA 4.5～9体积％，63～65℃恒温反应45～90min。所述体积百分比是指占四个组分总体积的体积百分比。

3、反应后处理

在上述反应管和阳性对照组中分别加入显色液，混匀，样品组显色与对照组相同则为阳性，否则为阴性。

本发明的原理是利用BstDNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物（即内引物FIP/BIP和外引物 F3/B3），特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。LAMP反应过程中，从dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温（63～65℃）条件下45～90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP 法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术（包括荧光实时定量PCR技术）进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试剂盒出售。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明的基因快速诊断试剂盒只需一个恒定温度就能扩增反应，不需要特殊试剂与设备，检测成本低；

2.本发明的基因快速诊断试剂盒应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，因此具有高特异性；

3.本发明的基因快速诊断试剂盒扩增快速且高效，在不到1小时即可完成扩增，且产率高；

4.本发明的基因快速诊断试剂盒灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少；

5.本发明的基因快速诊断试剂盒鉴定简便，从dNTP 析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物—焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，验证率高，更加明显可靠。

附图说明

图1为试剂盒特异性检测结果图（目的基因EPSPS-NOS）；

图2为试剂盒特异性检测结果图（目的基因lectin）；

其中，1为TE缓冲液，2为ddH₂O，3为油菜非转基因样品DNA，4为玉米非转基因样品 DNA，5为大米非转基因样品 DNA，6为大豆非转基因样品DNA，7为50ng大豆转基因样品DNA，8为100ng大豆转基因样品 DNA，9为250ng大豆转基因样品DNA。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步地阐述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1  Roundup Ready转基因大豆快速诊断试剂盒的制备

（1）按以下序列经DNA合成仪合成EPSPS-NOS基因引物：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

（2）按以下序列经DNA合成仪合成lectin基因引物：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。

（3）购置DNA聚合酶：Bst DNA polymerase （大片段），置于容器。

（4）分别配制EPSPS-NOS基因和lectin基因反应液：反应液的配方按每1L溶液含有2mmol dNTP、25mmol Tris-Cl、12.5mmol氯化钾、12.5mmol 硫酸铵、10mmol 硫酸镁、1.25ml TritonX-100、1mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol和外引物 F3/B3各0.25mol配制，置于容器。

（5）购置稳定液：石蜡油，置于容器。 

（6）购置显色液： SYBR Green I，置于容器。

（7）提取阳性对照：制备 EPSPS 基因 DNA 片段分别置于容器。

（8）将上述 6 个容器装成试剂盒，封装。

制备工艺简述如下：

1、将内引物FIP/BIP和外引物 F3/B3合成纯化后，定量配制，浓度检测，抽样质检；

2、将反应液无菌分装，并按照实验用进行浓度确定，抽样质检；

3、将稳定液分装，抽样质检；

4、将阳性对照标本制备，分装，抽样质检；

5、组装试剂盒。

实施例2  Roundup ready转基因大豆快速诊断试剂盒的制备

EPSPS-NOS基因两对引物为：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

Lectin基因两对引物为：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。

反应液的配方为：每1L反应液中含有1.6mmol dNTP、20mmol Tris-HCl、10mmol氯化钾、10mmol硫酸铵、8mmol硫酸镁、1ml TritonX-100、0.8mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6mol和外引物 F3/B3各0.2mol；

显色液为EvaGreen。

其他同实施例1。

实施例3  Roundup ready转基因大豆快速诊断试剂盒的制备

EPSPS-NOS基因两对引物为：

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

Lectin基因两对引物为：

外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；

外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；

内引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；

内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。

反应液的配方为：每1L反应液中含有2mmol dNTP、25mmol Tris-HCl、11mmol氯化钾、12mmol硫酸铵、9mmol硫酸镁、1.25 ml TritonX-100、1 mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各2mol和外引物 F3/B3各0.25mol；

显色液为EvaGreen。

其他同实施例1。

实施例4  Roundup ready转基因大豆快速诊断试剂盒的制备

EPSPS-NOS基因两对引物为：

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；

Lectin基因两对引物为：

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示。

反应液的配方为：每1L反应液中含有1.6mmol dNTP、22mmol Tris-HCl、10mmol氯化钾、10mmol硫酸铵、8mmol硫酸镁、1ml TritonX-100、0.8mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6mol和外引物 F3/B3各0.2mol；

显色液为EvaGreen。

其他同实施例1。

实施例5  Roundup ready转基因大豆快速诊断试剂盒的制备

EPSPS-NOS基因两对引物为：

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。

Lectin基因两对引物为：

外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；

外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示；

内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示；

内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示。

反应液的配方为：每1L反应液中含有1.6mmol dNTP、21mmol Tris-HCl、10mmol氯化钾、10mmol硫酸铵、8mmol硫酸镁、1ml TritonX-100、0.8mol甜菜碱、内引物FIP/BIP各1.6mol和外引物 F3/B3各0.2mol；

显色液为EvaGreen。

其他同实施例1。

实施例6  Roundup ready转基因大豆快速诊断试剂盒的应用

本实施例采用实施例1制备的Roundup ready转基因大豆快速诊断试剂盒进行待测样品中的快速诊断。

1、样品处理（模板DNA提取）

1）将 100mg经预处理的试样，在液氮中充分研磨成粉末后加人700μ L CTAB提取缓冲液                                                中(不需研磨的试样直接加入)，振荡后混匀，65℃保温30 min，其间不时轻缓颠倒混匀2-3次。

2）加人700μ L三氯甲烷-异戊醇，轻缓颠倒混匀溶液2-3次。12000g离心5 min至分相。

3） 将上清液转移至干净的离心管中，加人0.6倍体积的4℃预冷的异丙醇，于-20℃静置5min，12 000 g离心5 min。

 4） 弃上清液，加入1000μL 70%乙醇，轻轻转动离心管，4℃下8000g离心1 min，弃上清液后，再加入20μ L Rnase A 酶（10μ g /μ L），37℃温浴30min。

5）加入600μL 氯化钠溶液，65℃温浴10min。加入600μL 三氯甲烷-Tris饱和酚，颠倒混匀后，12000g离心5 min，转移上清液至1.5mL离心管中。

6）加人0.6倍体积的4℃预冷的异丙醇，于4℃静置30min，12 000 g离心10 min，弃去上清液。

7）加入1000 μL 4℃预冷70%乙醇，轻轻转动离心管，4℃下12 000 g离心10 min，弃上清液。重复一次操作。室温下挥发液体。

8）沉淀干燥后，加入50μL TE缓冲液充分溶解DNA，-20℃保存备用。

2、环介导等温扩增技术的反应过程

1）在200μL 反应管配制反应体系：反应液 22μL，Bst DNA聚合酶0.5μL（4U），模板DNA 2.5μL。

2）将配制好的反应管于64℃恒温反应1h。

3、反应后处理

向上述PCR反应产物中加入2μL SYBR Green I，混匀，同时也向阳性对照管中加入SYBR Green I混匀，若反应管与对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管显现橙色则为阴性。

实施例7  Roundup Ready转基因大豆快速诊断试剂盒的特异性验证

本实施例采用实施例2制备的Roundup Ready转基因大豆快速诊断试剂盒进行试剂盒的特异性检测。

采用实施例2制备的Roundup Ready转基因大豆快速诊断试剂盒，分别对大豆转基因样品、大豆非转基因样品、油菜非转基因样品、玉米非转基因样品、大米非转基因样品、ddH₂O和TE缓冲液进行扩增，非转基因样品DNA分别加入250ng，大豆转基因样品DNA分别加入250ng、100ng和50ng，每个样品设置2个重复。

反应体系为：反应液22μl、BstDNA 聚合酶0.5μl、稳定液30μl和DNA模板 2.5μl。

反应程序：金属浴中65℃，1小时。

反应完毕后加入显色液2.0μl，观察结果，如表1、表2和图1、图2所示。

 

表 1 试剂盒特异性检测结果（目的基因EPSPS-NOS）

   上述表1中，P代表扩增阳性；N代表扩增阴性。

表 2 试剂盒特异性检测结果（目的基因lectin）

上述表2中，P代表扩增阳性；N代表扩增阴性。

从表1的结果可以看出，在含有50ng、100ng和250ng大豆转基因样品DNA的反应中能够扩增出EPSPS-NOS基因的产物，呈现扩增阳性，而在含有大豆非转基因样品DNA、大米非转基因样品DNA和油菜非转基因DNA以及ddH₂O和TE中都不能扩增出产物，呈现扩增阴性，由此说明，本发明的转基因作物EPSPS-NOS基因快速诊断试剂盒具有高特异性，能够正确的鉴定出转基因大豆样品。从表二的结果可以看出，在大豆转基因样品DNA和大豆非转基因样品DNA的反应中均能扩增出lectin基因的产物，呈现扩增阳性，说明无假阴性的存在，确保结果的可靠性。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  广州华峰生物科技有限公司

 

<120>  Roundup Ready转基因大豆检测用引物组及其检测试剂盒

 

<130> 

 

<160>  26    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

catgagcttc ctcgtcatgg                                                   20

 

 

<210>  2

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

cgggaattgg atccggtac                                                    19

 

 

<210>  3

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

atgaactccg ggaagctcgt gctcgtgtcg gaaaaccctg                            40

 

 

<210>  4

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gctgggcgcg aagatcgaac gctcgaattc gagctcatca                           40

 

 

<210>  5

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

gccacccatc tcgatcac                                                  18

 

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

gctcgaattc gagctcatca                                              20

 

 

<210>  7

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

tcgtccaccg tgacagggtt catcgccatg agcttcctc                         39

 

 

<210>  8

<211>  41

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

acgagcttcc cggagttcat gagccttcgt atcggagagt t                        41

 

 

<210>  9

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

catcgccatg agcttcctc                                                   19

 

 

<210>  10

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

gtccatgaac tccgggaagc tcaaaaccct gtcacggtgg                             40

 

 

<210>  11

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

ggagttcatg gacctgatg                                                   19

 

 

<210>  12

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

cccatctcat aaataacgtc atg                                               23

 

 

<210>  13

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

tccggtaccg agctcgaatt gaagatcgaa ctctccgat                              39

 

 

<210>  14

<211>  49

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  14

ttcttaagat tgaatcctgt tgccgcatgc ttaacgtaat tcaacagaa                  49

 

 

<210>  15

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  15

gttcatggac ctgatggc                                                  18

 

 

<210>  16

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  16

atctcataaa taacgtcatg ca                                             22

 

 

<210>  17

<211>  39

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  17

attggatccg gtaccgagct gaactctccg atacgaagg                            39

 

 

<210>  18

<211>  47

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  18

ttcttaagat tgaatcctgt tgccgtgctt aacgtaattc aacagaa                   47

 

 

<210>  19

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  19

accagcaagg caaactcag                                                  19

 

 

<210>  20

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  20

ttgaaggaag cggcgaag                                                  18

 

 

<210>  21

<211>  46

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  21

ccgaggaggt cacaatagcg tctttttcag ctggaacaag ttcgtg                  46

 

 

<210>  22

<211>  44

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  22

aacggcaccc caaaaccctc ttttctaccg gtttctttgt ccca                     44

 

 

<210>  23

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  23

gccgaagcaa ccaaacatg                                                   19

 

 

<210>  24

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  24

ggggcataga aggtgaagtt                                                  20

 

 

<210>  25

<211>  45

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  25

tggggtgccg ttttcgtcaa cttttgagac gctattgtga cctcc                      45

 

 

<210>  26

<211>  42

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  26

accctcgtct cttggtcgcg ttttggcaac gctaccggtt tc                          42