一株恶臭假单胞菌及其转化生产烟酸或异烟酸方法

摘要

公开了一株新菌株恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)及应用该菌株催化生产烟酸、异烟酸的方法。本发明以3-氰基吡啶、4-氰基吡啶为原料，以发酵培养获得的具有高腈水解酶活性的恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)为催化剂进行水解反应，得到产物烟酸、异烟酸。采用流加的方式加入底物于反应器中，反应6-10h，可得到147g/L-221g/L的烟酸或异烟酸。恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)具有生长周期短、生命力强、转化效率高、转化周期短等特点，能大大降低了烟酸、异烟酸的生产成本；本工艺具有反应条件温和、能耗低、产率高、环境友好等特点。

说明书

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，涉及一株恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)及用该菌株转化3-氰基吡啶制备烟酸和转化4-氰基吡啶制备异烟酸的方法。 

背景技术

烟酸，又称为3-吡啶甲酸，是人体必需的13种维生素之一，人和动物缺乏烟酸所表现的症状主要为癞皮病症状，故烟酸又称为抗癞皮病维生素。烟酸在医学上主要用于合成烟酸片用于防治糙皮病。现烟酸也用于粮食制品，肉品添加剂和饲料添加剂以预防糙皮病。特别是饲料中添加烟酸后可提高畜禽的抗病能力，加快生长速度，提高饲料的利用率，可大量节省饲料，降低饲养成本。美国曾喂养添加烟酸饲料的奶牛与对照组相比，产奶量可提高15％-20％。烟酸在医学上还可作为医药中间体用于合成治疗各种高血压症和冠心病等的药物。另外烟酸还可作为形成活性污泥的生化激素、空气和废气的除臭剂。烟酸在染料工业、感光材料工业、染发助剂、洗涤剂等方面也有一定的应用。 

异烟酸，又称为4-吡啶甲酸，是一种重要的医药中间体，主要用于制备一线治疗结核病的药物异烟肼(雷米封)，异烟肼对结核杆菌有良好的抗菌作用，用量小，毒性相对较低，可用于治疗各个时期的肺结核，也可用于结核性脑膜炎和其他肺结核等。异烟酸也可用于合成特非那丁和异烟腺、丙硫烟胺、异烟酰腙等衍生药物。在农业上，异烟酸作为合成植物生长调节剂抗倒胺的前体物质。异烟酸在工业上也可作为抗腐蚀剂、电镀添加剂、感光树脂稳定剂、聚氯乙烯热稳定剂和有色金属浮选药剂等，应用领域十分广泛。 

烟酸的生产目前工业上应用的主要为化学法，所用原料为3-甲基吡啶、2-甲基-5-乙基吡啶、3-氰基吡啶以及哇琳等。从合成方法看，一般分为试剂氧化法、氨氧化法、气相氧化法、电解氧化法、生物氧化法和吡啶羟基化法等。目前最常用的方法是以3-甲基吡啶为原料空气氧化法合成烟酸。将3-甲基吡啶、空气和氨气按比例通入流化床反应器中，在290～360℃、V₂O₅催化下反应生成烟腈；再于氢氧化钠水溶液中、160℃下高压水解生成烟酸钠，最后用盐酸酸化得烟酸。在这个合成过程中需要经过烟腈这一部中间产物，烟腈水解为烟酸需要高温高压、强酸强碱，对设备具有一定的要求而且也会腐蚀设备，且对环境也不友好。清华紫光公司的专利CN114288A报道了用3-甲基吡啶一步催化生成烟酸，其过程为将3-甲基吡啶与硫酸反应生成甲基吡啶硫酸盐，然后在氧化剂硝酸的作用下氧化生成烟酸硫酸盐，烟酸硫酸盐加入碱溶液中和制得烟酸，原料收率为90％左右。此过程中需要硫酸、硝酸、碱溶液等强酸 强碱物质，污染严重。 

异烟酸的生产目前工业上是用化学法合成。合成异烟酸的主要原料有4-甲基吡啶、4-氰基吡啶、聚4-吡啶乙烯、4-羟甲基吡啶、4-醛基吡啶等。合成方法有高锰酸钟氧化法、硝酸氧化法、氨氧化水解法等。其中氨氧化水解法是在工业上普遍应用的方法。氨氧化-水解法主要是以4-甲基吡啶为原料，在以五氧化二钒为主的催化剂作用下，与氨和空气的混合物进行高温氧化，生成4-氰基吡啶，然后4-氰基吡啶在碱性条件下高温高压水解得到酸。该工艺过程方法存在反应时间长、需高温高压、产品收率较低、产品回收纯化工艺较复杂、对环境污染等缺点。在工业也可以通过以4-甲基吡啶一步氧化成异烟酸。由于4-基吡啶α碳上的氢受芳环的影响变化比较活泼，容易被氧化，因此氧化4-甲基吡啶制备异烟酸的方法也是目前工业上常用的方法。但是4-甲基吡啶的甲基不仅可氧化成羧基，还可氧化成羟甲基、醛基甚至深度氧化成二氧化碳，而且吡啶环上的氮原子也易被氧化成氮氧化物，目标产物的选择性低。浙江大学吕秀阳专利CN101463004A报导了近临界水介质中异烟腈无催化水解制备异烟酸的方法，其过程为在高压反应釜中加入去离子水和4-氰基吡啶，常压下升温至沸腾排气，然后关闭排气阀，继续升温至200-300℃水解30-600min得到异烟酸，收效为73％-90.4％。此过程中无需催化剂，但需要高温，此过程尚处于研究阶段。 

在烟酸、异烟酸化学合成过程中，都必须具备特定的高温高压环境或者采用强酸、强碱或化学催化剂处理，反应选择性不高，副产物多，产品的收率不高，环境污染大。相对而言，生物催化法具有底物选择性高、催化效率高、反应条件温和、环境污染小等特点。此外，生物催化剂的制备易放大，成本低，适合于大规模工业化生产应用。目前所报道能用于生物催化3-氰基吡啶制备烟酸的菌株有枯草芽孢杆菌、玫瑰色红球菌、诺卡氏菌、茄病镰刀菌，催化4-氰基吡啶转化为异烟酸的菌株有茄病镰刀菌和黑曲霉，但无报道恶臭假单胞菌应用于产烟酸和异烟酸。 

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一株新的菌株恶臭假单胞菌恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)以及在一定条件下应用恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)全细胞催化3-氰基吡啶制备烟酸和催化4-氰基吡啶得到异烟酸。 

本发明所述的一株高效催化3-氰基吡啶产烟酸和高效催化4-氰基吡啶产异烟酸的菌株，该菌株分类命名为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.3830，保藏日期2010年5月11日。 

本发明所提供的菌株通过以下方法筛选获得： 

采集腈类化合物生产厂房周围5-15cm处的土样。取1g土样放入三角瓶中，加入15ml生理盐水，加入玻璃珠，放在摇床上振荡30min。取0.2ml土壤悬液，涂布于以3-氰基吡啶为唯一氮源固体筛选培养基，固体筛选培养基的组成为：葡萄糖0.5％-2％、磷酸二氢钾0.01-0.1％、硫酸镁0.005-0.02％、硫酸亚铁0.001-0.005％、氯化钙0.001-0.005％、氯化钠0.05-0.5％、3-氰基吡啶0.05％-0.2％、琼脂2％、pH 7.0。30℃培养3天，挑取不同菌的菌落继续划线分离至单菌落。挑取20株纯化好的菌株转接至液体培养基中进行培养复筛。 

液体筛选培养基的组成为：蛋白胨0.5％-1％，酵母粉0.25％-0.75，NaCl0.1-1％，pH7.0。摇床转速120rpm，30℃培养3天。培养结束后，取该培养液10000rpm离心10min收集菌体用于转化3-氰基吡啶，用高效液相色谱法检测反应体系中烟酸浓度，最终筛选得到得到产量最高的一株菌株即恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)。 

本发明所提供的恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)具有以下分类学特征： 

菌落呈圆形，乳黄色，表面湿润，光滑，有光泽，粘稠，中央隆起，边缘整齐并呈半透明状，不产生水溶性色素。经显微镜观察，菌体形态较小，呈短杆状，经透射镜观察具端生鞭毛。革兰氏染色呈阴性，有荧光，氧化型，过氧化氢酶试验阳性、VP试验阴性、MR试验阴性、吲哚试验阴性、柠檬酸盐利用试验阳性、明胶液化试验阴性、淀粉水解试验阴性、硝酸盐还原试验阴性、精氨酸双水解试验阳性。结合形态和生理生化特征，确定该菌株为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。 

本发明采用的技术方案是： 

一种微生物催化水解3-氰基吡啶、4-氰基吡啶产分别产烟酸、异烟酸的方法，所述方法包括：以3-氰基吡啶、4-氰基吡啶为底物，以发酵培养获得的含高腈水解酶活性的恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)细胞作为催化剂，于pH6.0-10.0、0.1-1L的磷酸盐缓冲体系中，10-40℃下进行水解反应，通过流加的方式添加底物，反应一段时间后得到所述的烟酸、异烟酸。 

恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)可发酵产腈水解酶，腈水解酶可水解3-氰基吡啶、4-氰基吡啶的氰基为羧基，从而得到烟酸和异烟酸。 

含酶细胞由如下方法制备得到：恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)由种子培养基中接种至发酵培养基，在25-35℃培养24-48h，培养得到的发酵液经离心洗涤，得到所述含酶细胞。 

本发明中，所述适用于恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)的发酵培养基组成如下：甘油0.5％-2％，胰蛋白胨0.5％-2％，酵母膏0.25％-1％，磷酸二氢钾0.05％-2％，氯化钠0.1％-1％，尿素0.5％-2％，pH 5.6-8.4。 

若没有特别说明，本发明中百分比浓度均是质量百分比浓度(W/V)，某组分百分比浓度为1％是指100mL溶液中含有该组分1g。 

发酵培养可在摇瓶中进行，也可在发酵罐中进行。 

发酵培养可采用培养方式有：摇床培养、通气搅拌培养。 

摇瓶培养：在三角瓶中装入适量的发酵培养基，将菌体从种子培养基中接种至发酵培养基中，25-35℃，旋转式摇床(100-220rpm)培养24-48h，得到含腈水解酶的菌体发酵液。 

发酵罐培养：在5-10L的发酵罐中装入适量的发酵培养基，将菌体从种子培养基中接种至发酵培养基中，通气量0.5-3mL/min，控制pH在6.5-7.0，搅拌速度100-600rpm，25-35℃，经过24-48h培养获得含腈水解酶的菌体发酵液。 

将发酵液10000rpm离心10min收集菌体，菌体用磷酸盐缓冲液洗涤两次后，菌体用磷酸盐缓冲液(pH6-10)重悬。 

酶活的定义：在反应条件下，10min转化3-氰基吡啶/4-氰基吡啶生成1μM烟酸/异烟酸所需的酶量定义为一个酶活单位。 

3-氰基吡啶、4-氰基吡啶的生物催化反应：在pH6-10磷酸盐缓冲液介质中加入生物催化剂，初始加入底物3-氰基吡啶或4-氰基吡啶0.05M-0.2M进行反应，间隙补加底物，反应温度25-35℃之间，搅拌速度控制在50-300rpm之间，总加入底物浓度控制在1.2M-1.8M。 

具体应用过程如下： 

(1)恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)接种至种子培养基，30℃、120rpm下培养24h，得到种子液；所述种子培养基组成如下：蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，NaCl0.5％，pH7.0。 

(2)发酵培养基以1％体积比接种量接种至发酵培养基，30℃下培养24-48h，得到发酵液。所述发酵培养基组成如下：甘油0.5％-2％，胰蛋白胨0.5％-2％，酵母膏0.25％-1％，磷酸二氢钾0.05％-2％，氯化钠0.1％-1％，尿素0.5％-2％，pH 5.6-8.4。 

(3)取发酵液，高速离心得到的菌体细胞用磷酸盐缓冲液洗涤2次，再用磷酸缓冲液重悬细胞，取细胞液以磷酸盐缓冲液稀释细胞至0.5-5g/L(细胞干重)，加入3-氰基吡啶或4-氰基吡啶0.05M-0.2M，于10-40℃，50-300rpm下进行反应，待底物浓度低于0.01M时，补底物至0.05M-0.2M，水解反应结束后，于水解液中得到所述烟酸或异烟酸。 

本发明中产物的分析测定方法： 

取2ml反应液，加入200μl 2M HCl终止反应，用0.45μm滤膜过滤后，进行HPLC分析检测，色谱柱：Atlantis dC18色谱柱，5μm，4.5×150mm；流动相：乙腈：0.025％磷酸水溶液(60∶40，V/V)；流速：0.7mL/min；检测波长268nm；柱温30℃。 

本发明的优点和有益效果是：在自然界中筛选得到能够催化3-氰基吡啶、4-氰基吡啶为烟酸、异烟酸的菌株，经鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。在优化发酵条件下制备高催化活性高生物量的恶臭假单胞菌游离细胞。通过底物流加的方式，用游离的恶臭假单胞菌连续催化3-氰基吡啶能得到147-209g/L的烟酸，连续催化4-氰基吡啶能得到172-221g/L的异烟酸，转化效率接近100％。这是首次报道用恶臭假单胞菌作为生物催化剂催化产烟酸和异烟酸。该菌株具有生长周期短，转化效率高，转化周期短等特点，大大降低了烟酸、异烟酸的生产成本，特别适合烟酸、异烟酸的大规模生产；本工艺还具有反应条件温和，产率高，对环境友好等特点。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步描述： 

实施例1：恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)的分离鉴定 

(1)恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)的富集筛选过程。 

采集腈类化合物生产厂房周围5-15cm处的土样。取1g土样放入三角瓶中，加入15ml生理盐水，加入玻璃珠，放在摇床上振荡30min。取0.2mL土壤悬液，涂布于以3-氰基吡啶为唯一氮源固体筛选培养基，固体筛选培养基的组成为：葡萄糖0.5％、磷酸二氢钾0.1％、硫酸镁0.01％、硫酸亚铁0.002％、氯化钙0.002％、氯化钠0.1％、3-氰基吡啶0.1％、琼脂2％、pH 7.0。30℃培养3d，挑取不同菌的菌落继续划线分离至单菌落。 

挑取20株纯化好的菌株转接至液体培养基中进行培养复筛。液体筛选培养基的组成为：蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，NaCl0.5％，pH7.0摇床转速120rpm，30℃培养3d。培养结束后，取该培养液10000rpm离心10min，收集菌体用于转化3-氰基吡啶，用高效液相色谱法检测反应体系中烟酸浓度。得到产量最高的一株菌。 

(2)恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)的形态和生理生化特征 

P.putida CGMCC3830在LB培养基上菌落呈圆形，乳黄色，表面湿润，光滑，有光泽，粘稠，中央隆起，边缘整齐并呈半透明状，不产生水溶性色素。经显微镜观察，菌很小，呈短杆状，经透射镜观察端生鞭毛。革兰氏染色呈阴性，在KB培养基上培养至长出菌落后在紫外光照射下观察到有荧光，葡萄糖氧化实验中发现其为氧化型，过氧化氢酶试验阳性、VP试验阴性、MR试验阴性、吲哚试验阴性、柠檬酸盐利用试验阳性、明胶液化试验阴性、淀粉水解试验阴性、硝酸盐还原试验阴性、精氨酸双水解试验阳性。根据伯杰细菌手册，对照生理生化特征确定该菌的种属为恶臭假单胞菌。 

实施例2：恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)的摇瓶发酵培养 

分别配制摇瓶发酵培养基 

A：葡萄糖1％、大豆蛋白胨0.5％、酵母粉0.3％、麦芽提取物0.3％、NaCl5％，pH7.2。 

B：甘油1％、胰蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl0.5％，pH7.2。 

C：甘油1％、胰蛋白胨1％、酵母粉0.5％、NaCl0.1％、KH₂PO₄10.1％，pH7.2。 

D：甘油1％、胰蛋白胨1％、酵母粉0.5、NaCl 0.1％、KH₂PO₄10.1％、尿素1％，pH6.0。 

分别将配置以上培养基进行分装，每种各三个平行，121℃灭菌20min。将恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)接种到各发酵培养基中，30℃、120rpm下培养，36h结束发酵。发酵结束后10000rpm离心10min收集菌体，菌体用磷酸盐洗涤两次。10ml反应体系中细胞0.5g/L、3-氰基吡啶50mM、磷酸盐缓冲液0.1M(pH7.2)，在30℃摇床反应10min，加入1ml2MHCl终止反应，通过HPLC测定反应液中的产物，计算出酶活，得到的结果见表1。 

表1摇瓶发酵菌体酶活 

实施例3：恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)的发酵罐发酵培养 

恶臭假单胞菌CGMCC3830(Pseudomonas putida)接种至种子培养基，30℃、120rpm下培养24h，得到种子液；所述种子培养基组成如下：蛋白胨0.5％，酵母粉0.5％，NaCl0.5％，pH7.0. 

发酵培养基以1％体积比接种量接种至发酵培养基，30℃下培养36h，得到发酵液。所述发酵培养基组成如下：甘油1％，胰蛋白胨1％，酵母膏0.5％，磷酸二氢钾0.1％，氯化钠0.1％，尿素0.1％。30℃，搅拌速度150rpm-600rpm，通气量0.5-3mL/min，用酸碱控制pH在7.0，培养24h后收集发酵液中的菌体用于反应。 

实施例4 

按照实例3收集得到的含腈水解酶的细胞0.3g(干重)，加入0.1M、pH7.5的磷酸盐缓冲液至100mL。在反应体系中首次加入3-氰基吡啶的浓度为0.1M，30℃、50rpm搅拌反应，通过HPLC色谱跟踪分析底物和产物，当体系中3-氰基吡啶低于0.01M时，补加底物3-氰基吡啶至0.1M，底物累计加入12次时，不再进行补料，待反应液中的3-氰基吡啶全部被转化为烟酸后，终止反应，反应历时6h，产物浓度147g/L。 

实施例5 

按照实例3得到的含腈水解酶的细胞0.3g(干重)，加入0.1M、pH7.5的磷酸盐缓冲液至100mL。在反应体系中首次加入0.1M4-氰基吡啶，30℃、50rpm搅拌反应，通过HPLC色谱跟踪分析底物和产物，当体系中4-氰基吡啶低于0.01M时，补加底物4-氰基吡啶至0.1M，底物累计加入14次时，不再进行补料，待反应液中的4-氰基吡啶全部被转化为异烟酸后，终止反应，反应历时7h，产物浓度172g/L。 

实施例6 

按照实例3得到的含腈水解酶的细胞0.5g(干重)，加入0.1M、pH7.5的磷酸盐缓冲液至100mL。在反应体系中首次加入0.1M3-氰基吡啶，30℃、50rpm搅拌反应，通过HPLC色谱跟踪分析底物和产物，当体系中3-氰基吡啶低于0.01M时，补加底物3-氰基吡啶至0.1M，底物累计加入17次时，不再进行补料，待反应液中的3-氰基吡啶全部被转化为烟酸后，终止反应，反应历时9.5h，底物浓度＜18％，最终转化率为≥99％，烟酸产量达到209g/L。 

实施例7 

按照实例3得到的含腈水解酶的细胞0.5g(干重)，加入0.1M、pH7.5的磷酸盐缓冲液至100mL。在反应体系中首次加入0.1M4-氰基吡啶，于30℃、50rpm搅拌反应，通过HPLC色谱跟踪分析底物和产物，当体系中4-氰基吡啶低于0.01M时，补加底物4-氰基吡啶至0.1M，底物累计加入18次时，不再进行补料，待反应液中的4-氰基吡啶全部被转化为异烟酸后，终止反应，反应历时10h，底物总浓度＜19％，最终转化率为≥99％，烟酸产量达到221g/L。 

实施例8 

按照实例3得到的含腈水解酶的细胞5g(干重)，加入0.1M、pH7.5磷酸缓冲液至1L，在5L的反应器里30℃、300rpm搅拌反应.在反应过程中采取间隙补加底料的方式添加3-氰基吡啶到反应器中，使3-氰基吡啶的浓度为0.1M。底物累计加入17次时，不再进行补料，待反应液中的3-氰基吡啶全部被转化为烟酸后，终止反应，反应历时9.5h，底物浓度＜18％，最终转化率为≥99％，烟酸产量达到209g/L。 

实施例9 

按照实例3得到的含腈水解酶的细胞5g(干重)，加入0.1M、pH7.5磷酸缓冲液至1L，在5L的反应器里30℃、300rpm搅拌反应.在反应过程中采取间隙补加底料的方式添加4-氰基吡啶到反应器中，使4-氰基吡啶的浓度为0.1M。底物累计加入18次时，不再进行补料，待反应液中的4-氰基吡啶全部被转化为异烟酸后，终止反应，反应历时10h，底物浓度＜19％，最终转化率为≥99％，烟酸产量达到221g/L。