一种用于制备抗肝脏肿瘤标志物CK-19抗体的多肽序列、多克隆抗体与应用

摘要

本发明公开了一种用于制备抗肝脏肿瘤标志物CK-19抗体的多肽序列、多克隆抗体与应用，其氨基酸序列如SEQNO.1所示。本发明选择了CK-19蛋白一段氨基酸序列进行多肽合成作为免疫原免疫动物制备抗体。涉及：人CK-19蛋白氨基酸特性分析，多肽设计及合成，多肽与载体蛋白KLH偶联及偶联产物纯化，偶联物免疫新西兰兔，抗血清ELISA检测、收集及纯化，纯化抗体ELISA及免疫印迹鉴定。该多克隆抗体可特异性识别及检测人CK-19蛋白，有望为肝癌诊断提供帮助，并指导临床预后判断和治疗方案的选择。

说明书

 

技术领域

    本发明涉及检测肝癌标志物CK-19用的兔多克隆抗体，具体地说，涉及一种抗肝脏肿瘤标志物CK-19的多肽抗体的制备及其应用。

背景技术

细胞角蛋白（Keratin, type I cytoskeletal）是细胞体的中间丝，根据其分子量和等电点不同可分为20种不同类型。在胚胎肝细胞中表达CK8、CK18、CK-19，随着肝脏的分化，CK-19在正常肝细胞不表达，只在胆管中表达。CK-19对胆管上皮和胆管细胞癌（ICC）具有特异性染色，阳性率达77%~100%，是目前诊断ICC最好的免疫组化标志物之一。当肝细胞发生癌变时，有些癌细胞又重新表达CK-19，部分为分子结构不完整的CK-19，且表达程度与细胞的分化程度呈负相关。当细胞出现坏死时，CK-19以溶解片段的形式释放于血清中，能在血液中检出，检测指标为细胞角质素偏低抗原。Nagai等报道，在70例肝癌患者中，33例外周血CK-19升高，在同时检测CK-19和AFP的患者中，有12.3%的患者CK-19升高而AFP正常。两者联合检测对诊断有一定的互补性。Ding SJ等发现CK-19在高转移力细胞株中高表达，且随着转移力的升高表达量亦呈上升趋势。李雁等进一步探索了CK-19与肝癌患者临床病理指标的关系，表明血清CK-19升高与HCC分化程度低，血管侵袭力强，临床病期晚有一定的关系。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可特异性识别人肝癌细胞表达的CK-19的多克隆抗体。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于制备抗肝脏肿瘤标志物CK-19抗体的多肽序列，其氨基酸序列如SEQ NO.1所示。

为便于与载体蛋白偶联，在上述多肽序列的C端连接一个半胱氨酸。

本发明选择了CK-19蛋白N端14肽作为候选多肽，并用人工方法进行多肽合成制备免疫原。

上述多肽序列免疫动物可获得多克隆抗体，所述多克隆抗体能用于制备肝癌诊断药物。

本发明用上述免疫原免疫新西兰兔，获得可特异性识别人肝癌细胞表达的CK-19的多克隆抗体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明对CK-19蛋白氨基酸序列的二级结构、免疫原性、亲疏水性、表面可及性等进行分析，确定合适的一段肽序列进行人工合成；将合成的多肽与马来酰亚氨活化的载体mcKLH偶联，将此偶联产物进行脱盐柱纯化后免疫新西兰兔；经过多次免疫的兔血清用ELISA法对抗体效价进行检测，效价达理想值后收集免疫兔血清，并用Protein G蛋白纯化柱纯化抗体；对纯化后抗体进行ELISA、western bot等鉴定。鉴定结果表明该多克隆抗体可特异性识别CK-19蛋白，可用于检测肝癌细胞表达的CK-19蛋白，为肝癌诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。

附图说明

图1是抗CK-19多克隆抗体经protein G凝胶柱纯化后经SDS-PAGE电泳 (12%)检测结果。M: 蛋白Marker：Lane 1：上样峰；Lane 2：流穿峰；Lane 3：平衡峰；Lane 4：洗脱峰。

图2是本发明中的抗CK-19多克隆抗体的western-blot鉴定结果。上样为HepG2细胞（人肝癌细胞系）裂解液。

具体实施方式

本发明设计和人工合成CK-19多肽抗原，与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白（KLH）偶联，经脱盐纯化后免疫新西兰兔，通过多次免疫及ELISA效价检测后，采集兔血清并经protein G凝胶纯化柱纯化。该多克隆抗体经过ELISA、western blot等鉴定，可特异性识别人肝癌细胞表达的CK-19蛋白，为肝癌诊断提供帮助，并能指导其临床预后判断和治疗方案的选择。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1：CK-19多肽的设计及合成

1. CK-19氨基酸序列

根据GenBank获得人CK-19氨基酸序列 (P08727)：如SEQ NO.2所示。

结果：人CK-19蛋白含有400氨基酸。

2. http://www.uniprot.org/uniprot在线分析CK-19结构域（表1）：

表1

aaaa     Domain1 – 400400Keratin, tyPe I cytoskeletal 191 – 7979Head80 – 387308Rod80 – 11536Coil 1A116 – 13318Linker 1134 – 22592Coil 1B226 – 24823Linker 12244 – 390147Necessary for interaction with PNN249 – 387139Coil 2388 – 40013Rod-like helical tail

结果：人CK-19蛋白含有9个结构域。

3. 用DNAstar软件分析CK-19蛋白特性（表2）：

表2

 

结果：人CK-19蛋白分子量为44091.06道尔顿，等电点为4.97，为酸性蛋白。

 

4. 用DNAstar软件分析CK-19免疫原性、亲疏水性及表面可及性：

结果：人CK-19蛋白N末端有14个氨基酸抗原性、亲水性及表面可及性较强。

5. CK-19合成多肽序列：

经过上述分析，选用的多肽序列为MTSYSYRQSSATSS（1aa-14aa）。实施例2：多肽合成及与载体蛋白偶联

实施例2：多肽合成及偶联

1. 多肽合成

为便于与载体蛋白偶联，合成多肽在C端加入一个半胱氨酸，即：MTSYSYRQSSATSSC。多肽由上海吉尔生化公司合成。

2. 多肽与载体蛋白偶联

化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白交联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T辅助细胞，进而诱导 B细胞反应。用于与多肽交联的载体蛋白有多种，其中最普遍使用的载体是匙孔血蓝蛋白（keyhole limpet hemacyanin，KLH)，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），卵清蛋白（ovalbumin，OVA）和牛甲状腺球蛋白（bovine thyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，是最为常用的多肽交联载体。BSA也常用来作为多肽载体，但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。

多肽与载体蛋白偶联：

a. 用200ul超纯水稀释一管马来酰亚胺活化的mcKLH，使成10 mg/ml 的溶液。 (注：上述溶液呈蓝白色半透明状，不得振荡或加热，否则会导致mcKLH沉淀。)

b. 用相当于步骤1中溶液1.0-2.5倍体积的偶联Buffer溶解含巯基的半抗原.例如：将2 mg半抗原用200-500ul偶联Buffer溶解，加入到mcKLH。如果多肽是易溶的，可以以固体加入到mcKLH悬液中。

（注：如果半抗原不易溶，可以加入DMSO增加溶解。DMSO在偶联溶解液中浓度低于30%，否则载体蛋白易变性。）

c.立即混匀多肽、mcKLH，然后在室温反应2h。

偶联产物纯化：通过凝胶层析脱盐柱来纯化偶联物

如果偶联物在一周以内注射，用PBS纯化。如果偶联物冻存，用纯化缓冲盐纯化，如果在偶联时形成沉淀，离心，收集上清，保留沉淀。仅纯化上清。将纯化的偶联物与沉淀结合。

a．溶解一瓶纯化缓冲盐，加入60ml 脱气的超纯水。在4度保存。

b．拿去脱盐柱的顶和底的盖子，使存储液排出。一脱盐柱可纯化0.5ml样品。

c．用3-5倍柱体积（15-25ml）的纯化缓冲液冲洗柱子。

d．将0.5ml的多肽载体混合物直接加入柱中心。加入0.5ml的纯化缓冲液，在分离管中收集各峰。

e．在280nm下测定吸光度以确定哪部分含有偶联物。在第一个吸收峰检测出的将是半抗原偶联物。混合所有含偶联物的部分

f．在含有偶联物的部分出现后，继续向柱内加入缓冲液，收集没有偶联的半抗原。

g．将偶联物过滤除菌，无菌保存在-80度。

结果: 考马斯亮兰法测得偶联后蛋白浓度和含量，每管250ug分装，－80度保存。

实施例3：抗CK-19多肽兔多克隆抗体制备及纯化：

1. 动物免疫

每种偶联产物免疫两只新西兰雄兔，体重2-2.5Kg。弗式完全佐剂和弗式不完全佐剂购自Sigma公司。

免疫程序（表3）：

a.      用PBS稀释100ug抗原，至1.25ml，用等体积佐剂混匀，旋涡振荡100分钟，检测乳化结果，取一滴抗原滴于水上，一分钟不溶解扩散。

b.     免疫前耳静脉取血，4度静置后取血清，－80度保存，作阴性对照血清。

表3

免疫次数天数抗原剂量免疫途径  第一次第1天400ug+完全佐剂（共1ml）脊柱两侧皮下多点注射，6个点第二次第15天200ug+不完全佐剂（共1ml）  脊柱两侧皮下多点注射，6个点 第22天第一次ELISA检测取血2ml制备血清，ELISA检测第三次第29天200ug+不完全佐剂（共1ml）脊柱两侧皮下多点注射，6个点 第36天第二次ELISA检测取血2ml制备血清，ELISA检测第四次第43天200ug静脉注射 第48天第三次ELISA检测先检测，合格后大量放血

抗体效价ELISA检测方法：

（一） 实验试剂

a．磷酸盐缓冲液（PBS）（10×浓缩）

氯化钠（NaCl）     50g

氯化钾（KCl） 1.25g

磷酸二氢钾（KH₂PO₄）    1.25g

磷酸氢二钠（Na ₂ HPO₄·12H₂O）      18.1g

蒸馏水加至  1000ml

用1M HCL调pH至7.2

b. 封闭液

正常牛血清  10ml

1×PBS（不含吐温）  90ml

c. 洗涤缓冲液

吐温-20（Tween 20）   0.2ml

1×PBS    1000ml

d．底物显色A液

醋酸钠（CH₃ COONa）    13.6g

柠檬酸（C₆H₈O₇·H₂O）    1.6g

双氧水（H₂O₂ 30%）  0.3ml

蒸馏水加至      500ml

e．底物显色B液 

乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na₂）     0.2g

柠檬酸（C₆H₈O₇·H₂O）    0.95g

甘油 （C₃H₈O₃）   50ml

四甲基联苯胺（TMB）    0.2g

蒸馏水加至          500ml

f．终止液（2M H₂SO₄ ）

取浓H2SO4  27.62ml，缓缓加入到473ml的蒸馏水中，混匀即可。

g．抗原包被液（0.1M碳酸盐缓冲液）pH 9.6

碳酸钠（Na₂CO₃） 1.59g

碳酸氢钠（NaHCO₃） 2.93g

叠氮钠（NaN₃）    0.2g

蒸馏水加至      1000ml

h．辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG（已商品化）。 

（二）实验步骤

a．抗原包被：纯多肽抗原终浓度一般为1-2μg/ml，用包被液稀释后取100μl加入聚苯乙烯酶联检测板各孔中，4℃过夜后，洗液洗涤3次。建议4℃包被过夜

b．封闭： 每孔加200μl或加满封闭液，4℃过夜或37℃两小时后，洗涤3次，拍干。置4℃冰箱保存备用。

c．ELISA检测

（a）加待测样品：兔耳静脉采血后分离血清，用PBS倍比稀释，50-100μl/孔加样到包被好的酶标板中，同时，分别选取免疫前兔血清为阴性对照，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。

（b）加二抗：根据酶标二抗的效价选择稀释倍数，100μl/孔，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。

（c）显色：加入A、B液各80μl/孔，37℃显色15min。

（d）终止：加入终止液80μl/孔。

（e）读数： 以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值（P/N）大于2.5为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点

兔血清收集：

采用劲动脉放血法，非抗凝兔全血收集后在37℃孵育2h，

抗体纯化：

A、饱和硫酸铵沉淀法

（一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ） 

将 767g （ NH ₄ ） 2 SO ₄ 边搅拌边慢慢加到 1 升 蒸馏水中。用氨水或硫酸调到硫酸pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液（ 4.1 mol/L, 25 ℃）. 

（二）沉淀 

a.样品（血清） 20 000 ′ g 离心 30 min ，除去细胞碎片； 

b.保留上清液并测量体积； 

c.边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中，终浓度为 1 ： 1 

d.将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或搅拌过夜（ 4℃），使蛋白质充分沉淀。 

（三）透析 

a.蛋白质溶液 10 000 ′g 离心 30 min （ 4 ℃）。弃上清保留沉淀； 

b.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对 

PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时（ 4 ℃），每隔 3-6 小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨； 

c.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。 

B、蛋白G亲和纯化

（一）．所需试剂和特殊设备

    1．0mol/L Tris(pH8．0)；100mmol/L Tris(pH8.0)；10mmol／L Tris(pH8.0)；50mmol／L甘氨酸(pH3.0)；简单的柱状色谱仪。

（二）．操作步骤．

a.加入1／10体积的1．0mol／L Tris(pH8.0) 调含抗体样品(血清，组织培养上清液或腹水)的pH值至8.0。

b.将抗体溶液通过蛋白A或蛋白G微球柱。这些柱中，每毫升的湿微球能结合大约10—20ml抗体(1个蛋白A或蛋白G微球分子结合2分子抗体)。记录装柱微球的大约体积。因为微球柱的体积决定使用清洗和洗脱缓冲液的量。

c.用10倍柱体积的100mmol／L Tris(pH8.0)洗涤微球。

d.用10倍柱体积的10mm01／L Tris(pH8.0)洗涤微球。

e.用50mmol／L甘氨酸(pH3.0)洗脱微球柱，每次加入约1／2柱体积的缓冲液，分次加入。用含1／10柱体积的1mol／L Tris(pH8.0)的试管收集洗脱液，将各管缓慢摇匀，使其pH值恢复至中性。

f.将含抗体的收集管混合，用SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色测总蛋白。

结果: 抗体纯化后经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定（图1），紫外分光光度计测定抗体浓度为0.4mg/ml。纯化后抗体保存于-20℃，0.01M PBS缓冲液中，溶液中含有40%甘油和0.5%BSA。

实施例4：CK-19多克隆抗体的鉴定

1. CK-19多克隆抗体的ELISA鉴定

以合成的CK-19多肽为检测抗原，包被酶标板，以1：2000稀释的未免疫兔血清作为阴性对照，将兔血清及纯化后的抗体倍比稀释，应用ELISA方法检测，以与阴性血清的比值大于2.1判段为阳性，计算单抗效价。

结果，纯化的抗CK-19抗体的效价达到1：4000（表4）。

表4 抗CK-19抗体效价

2. 抗CK-19多克隆抗体的Western-Blot鉴定

收集HepG2细胞1×10⁷个，将其裂解后，裂解液进行10% SDS-PAGE电泳，参照《分子克隆》中所述的免疫印迹方法，电转移条件为100 V电泳1 h，封闭液为含5%脱脂奶粉的TBST，一抗为本发明中的CK-19多克隆抗体（终浓度0.5 μg/ml），二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，通过ECL显色系统进行免疫印迹分析。

结果：本发明中的CK-19多克隆抗体可在HepG2细胞裂解液中检测到44KD大小左右的蛋白条带，与人CK-19蛋白分子量大小相符（图2）。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南方医科大学

 

<120>  一种用于制备抗肝脏肿瘤标志物CK-19抗体的多肽序列、多克隆抗体与应用

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  14

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  1

 

Met Thr Ser Tyr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Ala Thr Ser Ser

1               5                   10                 

 

 

<210>  2

<211>  400

<212>  PRT

<213>  人CK-19蛋白

 

<400>  2

 

Met Thr Ser Tyr Ser Tyr Arg Gln Ser Ser Ala Thr Ser Ser Phe Gly

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Leu Gly Gly Gly Ser Val Arg Phe Gly Pro Gly Val Ala Phe Arg

            20                  25                  30         

 

 

Ala Pro Ser Ile His Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Val Ser Val Ser

        35                  40                  45              

 

 

Ser Ala Arg Phe Val Ser Ser Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Gly Gly Gly

    50                  55                  60                 

 

 

Tyr Gly Gly Val Leu Thr Ala Ser Asp Gly Leu Leu Ala Gly Asn Glu

65                  70                  75                  80 

 

 

Lys Leu Thr Met Gln Asn Leu Asn Asp Arg Leu Ala Ser Tyr Leu Asp

                85                  90                  95     

 

 

Lys Val Arg Ala Leu Glu Ala Ala Asn Gly Glu Leu Glu Val Lys Ile

            100                 105                 110        

 

 

Arg Asp Trp Tyr Gln Lys Gln Gly Pro Gly Pro Ser Arg Asp Tyr Ser

        115                 120                 125            

 

 

His Tyr Tyr Thr Thr Ile Gln Asp Leu Arg Asp Lys Ile Leu Gly Ala

    130                 135                 140                

 

 

Thr Ile Glu Asn Ser Arg Ile Val Leu Gln Ile Asp Asn Ala Arg Leu

145                 150                 155                 160

 

 

Ala Ala Asp Asp Phe Arg Thr Lys Phe Glu Thr Glu Gln Ala Leu Arg

                165                 170                 175    

 

 

Met Ser Val Glu Ala Asp Ile Asn Gly Leu Arg Arg Val Leu Asp Glu

            180                 185                 190        

 

 

Leu Thr Leu Ala Arg Thr Asp Leu Glu Met Gln Ile Glu Gly Leu Lys

        195                 200                 205            

 

 

Glu Glu Leu Ala Tyr Leu Lys Lys Asn His Glu Glu Glu Ile Ser Thr

    210                 215                 220                

 

 

Leu Arg Gly Gln Val Gly Gly Gln Val Ser Val Glu Val Asp Ser Ala

225                 230                 235                 240

 

 

Pro Gly Thr Asp Leu Ala Lys Ile Leu Ser Asp Met Arg Ser Gln Tyr

                245                 250                 255    

 

 

Glu Val Met Ala Glu Gln Asn Arg Lys Asp Ala Glu Ala Trp Phe Thr

            260                 265                 270        

 

 

Ser Arg Thr Glu Glu Leu Asn Arg Glu Val Ala Gly His Thr Glu Gln

        275                 280                 285            

 

 

Leu Gln Met Ser Arg Ser Glu Val Thr Asp Leu Arg Arg Thr Leu Gln

    290                 295                 300                

 

 

Gly Leu Glu Ile Glu Leu Gln Ser Gln Leu Ser Met Lys Ala Ala Leu

305                 310                 315                 320

 

 

Glu Asp Thr Leu Ala Glu Thr Glu Ala Arg Phe Gly Ala Gln Leu Ala

                325                 330                 335    

 

 

His Ile Gln Ala Leu Ile Ser Gly Ile Glu Ala Gln Leu Gly Asp Val

            340                 345                 350        

 

 

Arg Ala Asp Ser Glu Arg Gln Asn Gln Glu Tyr Gln Arg Leu Met Asp

        355                 360                 365            

 

 

Ile Lys Ser Arg Leu Glu Gln Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Ser Leu Leu

    370                 375                 380                

 

 

Glu Gly Gln Glu Asp His Tyr Asn Asn Leu Ser Ala Ser Lys Val Leu

385                 390                 395                 400