甘草次酸修饰脂质、肝靶向脂质体、胶束及复合物和制法

摘要

本发明属于医药领域，具体涉及甘草次酸修饰脂质、肝靶向脂质体、胶束及复合物和制法。本发明提供了一种全新的甘草次酸修饰脂质，它是甘草次酸作为肝靶向介导物质，该修饰脂质作为脂质体或胶束的膜材应用，使得由其制备的脂质体或胶束具有肝靶向性。具体的，修饰脂质是以甘草次酸与磷脂或胆固醇为原料，在含有缩合剂的溶剂中反应而得。本发明还提供了由甘草次酸介导的肝靶向脂质体载体和胶束载体，脂质体载体是采用该修饰脂质与胆固醇和磷脂制成，胶束是由该修饰脂质直接制成；以及上述两种载体作为包封层制备的肝靶向脂质体复合物或胶束复合物，从而实现甘草次酸介导相关药物靶向到肝细胞，降低其对正常组织的毒性，提高药物的肝病防治效果。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及甘草次酸修饰脂质、肝靶向脂质体、胶束及复合物和制 法。

背景技术

目前，肝癌、肝炎等肝脏疾病仍是危害人类健康的重大疾病之一。广大科研工作这已经 做了大量的工作，但是仍然防治效果不甚理想，肝脏疾病依然是目前医药领域面对的强力挑 战之一。

肝炎治疗主要是采用两种或两种以上抗病毒药物联合治疗，由于难治性肝炎病人多处于 免疫耐受状态，单用一种药物疗效比较差，联合抗病疗法就根据药物成分不同、作用病位点 不同来选择不同药物，使药物在不同位点同时发挥药效。又有采集人体自身免疫细胞，经过 体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组 织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治 疗和保健的双重功效。这种肝炎的治疗方法源于依靠重建自身免疫能力彻底消除病的科研思 路：即以肝炎病的抗原蛋白为主体，加上多种细胞因子作为佐剂，激发重建患者体内抗病免 疫能力，达到清除病的目的。然而这些方法的治疗效果仍然不是很好，主要原因之一就是药 物没有靶向性，因此构建肝靶向的新型给药系统，有望提高肝炎的治疗效果。

肝癌治疗目前仍以手术切除为主，但临床实践显示，大多数患者无手术适应征，全肝癌 切除手术患者比例不到肝癌总例数的10％；且大肝癌根治性切除后5年复发率高达80％以上， 小肝癌切除后5年复发率也高达40％～60％。因此，对于无法手术的患者或者手术后复发患 者，局部治疗和化疗发挥着重要作用。目前全身化疗和化疗相关治疗如肝动脉灌注化疗(TAI) 应用较多，但现在临床上治疗肝癌的药物没有一个是对肝癌特别有效的。一线药物阿霉素是 单剂化疗疗效最高的，反应率仅为15％～20％，联合化疗反应率也不超过35％；而用紫杉醇、 氟达拉宾等药物进行全身化疗时的反应率几乎为零。近年来，抗肝癌新药研究报道颇多，但 进展不大。因此，开发肝靶向的新型给药系统，增加药物的肝脏分布和提高肝靶向性有望提 高肝癌的治疗效果。

脂质体和胶束作为药物载体已经显示了较好的应用前景，其组成的脂质材料具有生物可 降解性，毒性小等特点，还可缓释药物，延长药物作用时间；静脉给药后可由肝脏Kuppfer 细胞摄取而被动靶向于肝，使药物达到肝器官的目的。但是普通脂质体容易被调理素识别， 被肝脏以外的其他单核巨噬细胞系统吞噬，存在选择性差，靶向效率低的问题。

Negishi等在证实了离体大鼠肝细胞匀浆的细胞膜组分中含有多量甘草次酸 (Glycyrrhetinic Acid，GA)特异结合位点，在所有脏器组织中，肝脏的GA结合位点活性 最高。GA与该位点的结合呈可饱和性、高度特异性，且该位点具蛋白质性质。国内也有学 者用透射电镜进行观察，证实了肝细胞表面确存在大量GA受体。

现有报道中，仅有毛声俊等在肝细胞靶向甘草次酸表面修饰脂质体的制备[中国中药杂 志，2003年4月第28卷第4期，328-331]以及毛声俊在2007年Preparation，characterization and uptake by primary cultured rat hepatocytes of liposomes surface-modified with glycyrrhetinic acid.Pharmazie，[ORIGINAL ARTICLES，2007年，62卷第8期：614-619]中公开了一种甘草 次酸表面修饰脂质体，它是将GA与硬脂醇、琥珀酸酐偶联，合成一新型两亲性导向分子， 将其掺入脂质体中，介导该修饰脂质体与肝细胞表面的GA受体特异结合，以期达到肝细胞 主动靶向作用。该甘草次酸表面修饰脂质体简称LP-SM-GA。制得的甘草次酸修饰的脂质体 平均粒径在65～79nm之间，甘草次酸修饰脂质的摩尔含量最高为10％。由于甘草次酸是一 中药单体成分，将其作为肝靶向配体，发明人发现采用上述两篇文献公开的方法制备的甘草 次酸修饰的脂质体尚存在以下不足之处：

1、文献中记载的肝靶向配体甘草次酸是与硬脂醇、琥珀酸酐偶联，合成了一新型两亲性 导向分子，然后将其掺入脂质体中。由于在脂质体引入了硬脂醇，其生物相容性难以保证。

2、文献中记载的甘草次酸修饰的脂质体容易被单核巨噬细胞系统吞噬，难以较多量到达 肝实质细胞，无法作为治疗基于肝实质细胞疾病药物的优良载体。

3、文献中记载的甘草次酸修饰的脂质体中，导向分子掺入的摩尔含量最高为10％，进 一步增加掺入比例，所得脂质体为白色混浊液，短时间内即出现大量絮状沉淀物，无法制得 稳定的具有较高甘草次酸靶向配体含量的脂质体。

4、甘草次酸表面修饰的脂质体平均粒径在65～79nm之间，粒径范围较窄，难于满足不 同肝脏疾病对粒径的需求。

5、文献中记载的甘草次酸表面修饰的脂质体，处方中所用磷脂为大豆磷脂，采用注入法 制备，无法满足不同性质药物如亲水性药物、基因蛋白等大分子药物的高效包载。不能高效 包载基因蛋白等大分子药物的主要原因是：基因蛋白等大分子等常带有正电荷，大豆磷脂为 中性磷脂，无法通过静电吸附作用实现高效包载；此外，注入法这个制备方法包载亲水性药 物、基因蛋白等大分子药物的包封率本身就比较低。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种全新的甘草次酸修饰脂质，它是甘草次酸作为肝靶向介导 物质，该甘草次酸修饰脂质作为脂质体或胶束的膜材应用，使得由其制备的脂质体或胶束具 有肝靶向性。

本发明甘草次酸修饰脂质是以甘草次酸与磷脂或胆固醇为原料，在含有缩合剂的溶剂中 反应而得。

具体地，本发明甘草次酸修饰脂质是将甘草次酸、磷脂或胆固醇、与缩合剂在溶剂中混 合反应后，浓缩，柱层析或高效液相色谱纯化即得。

其中，甘草次酸与磷脂或胆固醇的反应关系：摩尔比为1∶1；缩合剂与反应物料(即原 料总量)的反应关系为：摩尔比为1∶1-1∶5。添加的催化剂为DMAP，其用量与反应物料 甘草次酸的反应关系为：摩尔比是1∶1。

制备过程中优选：分别将甘草次酸、磷脂或胆固醇与缩合剂配制成溶液后进行反应。

进一步地，为了使甘草次酸修饰脂质制备得到束和脂质体能够到达肝实质细胞，发明人 在本发明甘草次酸修饰脂质中引入了亲水基团聚乙二醇，使甘草次酸修饰脂质及其制备而得 的相应胶束和脂质体具有隐形的特性，避免单核巨噬细胞系统的吞噬，使所载药物更多的到 达肝实质细胞，达到治疗目的，尤其可作为治疗基于肝实质细胞疾病药物的优良载体。引入 聚乙二醇制备修饰脂质是以甘草次酸、磷脂(或胆固醇)、聚乙二醇为原料，在含有缩合剂的 溶剂中反应而得。

其中，甘草次酸与磷脂(或胆固醇)、聚乙二醇的反应关系：摩尔比为1∶1∶1；缩合剂 与反应物料(即原料总量)的反应关系为：摩尔比为1∶1-1∶5；添加的催化剂为DMAP， 其用量与反应物料甘草次酸的反应关系为：摩尔比是1∶1。

本发明甘草次酸修饰脂质可实现高效包载治疗药物，提高药物肝靶向性和富集浓度，从 而起到高效低毒的作用。

当采用磷脂或胆固醇制备修饰脂质时，采用如下方法制备：

在甘草次酸溶液中，加入磷脂或胆固醇的溶液、缩合剂的溶液，在0-80℃反应2-48小时， 冷却后，浓缩反应液，柱层析或高效液相色谱纯化，作为甘草次酸修饰脂质。

采用磷脂(或胆固醇)与聚乙二醇制备修饰脂质时，采用如下方法制备：

甘草次酸溶液中，加入聚乙二醇的溶液、缩合剂的溶液，在0-80℃反应2-48小时，冷却 后，再加入胆固醇与丁二酸酐的溶液、缩合剂的溶液(或再加入磷脂的溶液、缩合剂的溶液)， 浓缩反应液，柱层析或高效液相色谱纯化，作为甘草次酸修饰脂质。

上述两种制备方法中，进一步限定的反应条件为：

(1)甘草次酸溶液配制成1-30％(g/100ml)；磷脂、胆固醇、聚乙二醇、缩合剂配制溶 液时满足其溶解于溶剂中即可。甘草次酸溶液、缩合剂的溶液，磷酸或胆固醇的溶液，以及 聚乙二醇的溶液均可采用以下溶剂水、乙醚、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正戊烷、正己 烷、正庚烷、三氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环、N，N-二甲基甲酰胺，二甲亚砜，N-甲基吡 咯烷酮。针对不同的溶质，在同一方法中，既可以使用相同的溶剂，也可以使用不同的溶剂 系统，只要不同的溶剂能够互溶即可。

(2)采用的缩合剂为1-乙基-3-(3-二甲氨基异丙基)碳二亚胺(以下简称为EDC)、二 环己基碳二亚胺(以下简称为DCC)。

(3)柱层析条件为：二氯甲烷∶甲醇＝0∶100-30∶70、石油醚∶丙酮＝90∶10-30∶70、石油醚∶乙 酸乙酯＝100∶0-20∶80和正己烷∶丙酮＝95∶5-25∶75，采用上述四种溶剂系统中任意一种进行梯度 洗脱以获得修饰脂质。如制备甘草次酸修饰胆固醇时，采用石油醚∶丙酮＝90∶10-30∶70梯 度洗脱；或制备甘草次酸修饰磷脂时，采用正己烷∶丙酮＝95∶5-25∶75梯度洗脱；或制备 甘草次酸修饰聚乙二醇化胆固醇时，采用二氯甲烷∶甲醇＝0∶100-30∶70梯度洗脱；或制备 甘草次酸修饰磷脂时，采用正己烷∶丙酮＝95∶5-25∶75梯度洗脱；或制备甘草次酸修饰聚乙二醇 化磷脂时，采用正己烷∶丙酮＝95∶5-25∶75梯度洗脱。即制备任一种修饰脂质时，均可采用上述 四种洗脱系统进行梯度洗脱。洗脱时，不同比例洗脱液的流出液都用薄层色谱监测，收集薄 层色谱上组分Rf值在0.3～0.5的流出液，浓缩干燥即得修饰脂质。

若采用高效液相，其色谱条件为甲醇/乙腈-水系统，检测器为紫外检测器，检测波长为 249nm；具体的流动相条件为：甲醇∶水＝50∶50-100∶0或乙腈∶水＝50∶50-100∶0，收集 在249nm处有吸收的流出液，浓缩干燥即得修饰脂质。

本发明第二个目的是提供一种由甘草次酸介导的肝靶向脂质体载体。

为了探寻制备工艺简单、工艺稳定、质量易于控制的肝靶向脂质体制备方法，比较考察 了多种脂质体的制备方法如薄膜法、逆向蒸发法、注入法、超声法等多种制备方法，优选出 薄膜法、逆向蒸发法和注入法三种方法用于制备肝靶向脂质体。然后对每一种方法的工艺参 数进行考察，如：有机溶剂种类、用量，药脂比，甘草次酸修饰脂质用量等进行优化，以获 得本发明中的粒径、zeta电位稳定的肝靶向脂质体处方。

具体地，它是采用上述方法制备的甘草次酸修饰脂质与胆固醇和磷脂制成的脂质体，其 中，各组分配比关系如下：胆固醇和磷脂的摩尔比为1∶1～10，甘草次酸修饰脂质的摩尔含量 为胆固醇和磷脂的总摩尔数的0.5～30％。

按照上述组分配比关系采用薄膜法、逆向蒸发法和注入法三种方法制备肝靶向脂质体， 可制备得到粒径、zeta电位稳定的肝靶向脂质体，包封率在60％～98％。

进一步地，优选甘草次酸修饰脂质的摩尔含量为胆固醇和磷脂的总摩尔数的1～25％， 制备所得脂质体的包封率在70％～98％。

磷脂种类很多，可采用制剂领域常用于制备脂质体的磷脂类型。具体地，制备肝靶向脂 质体时采用的磷脂为中性磷脂，负电荷磷脂或正电荷脂质材料。

本发明第三个目的是提供一种由甘草次酸介导的肝靶向胶束载体。

具体地，本发明肝靶向胶束的制备方法是采用混合法、乳化-溶剂挥发法、自组装溶剂蒸 发法、薄膜分散法、透析法、熔融法中的任意一种，将磷脂(或胆固醇)与聚乙二醇反应制 备所得的甘草次酸修饰脂质制成肝靶向胶束。该肝靶向胶束因引入了聚乙二醇，优点有二： 其一，修饰脂质中引入亲水基团才能形成胶束；其二，可避免单核巨噬细胞系统的吞噬，作 为肝实质细胞疾病治疗药物的优良载体，实现肝病治疗药物在肝实质细胞富集。

本发明第四个目的是提供一种肝靶向脂质体复合物或胶束复合物，它是以本发明肝靶向 脂质体或胶束作为包封层，将基因、蛋白、多肽或小分子药物中的任意一种包封于肝靶向脂 质体或胶束中的复合物。通过甘草次酸实现介导相关药物(如小分子肝病治疗药物，大分子 肝病防治药物包括蛋白、多肽和基因)靶向到肝细胞，降低其对正常组织的毒性，提高药物 的肝病防治效果。

附图说明

图1：空白肝靶向脂质体或胶束体外抗人肝癌细胞HepG2活性。

图2：肝靶向空白脂质体的粒径分布图，size＝96.29，PDI＝0.12。

图3：肝靶向载基因脂质体复合物的粒径分布图，size＝220.30，PDI＝0.11。

图4：肝靶向载槲皮素胶束的粒径分布图，size＝127.20，PDI＝0.07。

图5：肝靶向空白脂质体的zeta电位分布图zeta电位＝50.41mV。

图6：肝靶向载基因脂质体复合物的zeta电位分布图zeta电位＝30.27mV。

图7：肝靶向脂质体的原子力显微镜图谱。

图8：不同比例甘草次酸修饰的肝靶向脂质体的最佳载体/基因质量比筛选电泳图。

图9：不同比例甘草次酸修饰的载基因肝靶向脂质体的肝癌细胞转染图。

图10：肝靶向胶束的透射电镜图谱。

其中图9(A)为彩色照相图，图9(B)为彩色照相图应用Microsoft Word设置图片格 式-图片-图像控制项，将颜色转换为灰度的转染图。

具体实施方式

本发明提供的甘草次酸修饰脂质，从功能上与本发明背景技术中提及的导向分子作用相 同，均是介导由其制成的脂质体具有肝靶向性，但是本发明甘草次酸修饰脂质可作为膜材应 用，而该导向分子中并不是作为膜材使用。

本发明甘草次酸修饰脂质是它是以甘草次酸与磷脂或胆固醇为原料，在含有缩合剂的溶 剂中反应而得。应用磷脂和胆固醇在治疗效果上差异不大，但是由于磷脂成本较低，所以优 选磷脂制备修饰脂质。

为了使甘草次酸修饰脂质制备得到束和脂质体能够到达肝实质细胞，在修饰脂质中引入 亲水基团聚乙二醇。

具体制备方法可参见以下四个制备实施例：

实施例1甘草次酸修饰胆固醇的制备：

称取5g甘草次酸置于500mL圆底烧瓶中，向瓶内加入250mL二氯甲烷，磁力搅拌溶解。 再向瓶内加入2.5gEDC，磁力搅拌至溶解后，加入4g胆固醇，继续搅拌，室温反应12小时。 有机层分别用1mol/L的HCl溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干 燥后减压，浓缩除去有机溶剂。所得固体柱层析(石油醚∶丙酮＝90∶10-30∶70梯度洗脱) 后得到淡黄色固体7.4g(产率82.6％)。

上述固体也可以采用高效液相纯化，其色谱条件为甲醇/乙腈-水系统，检测器为紫外检测 器，检测波长为249nm；具体的流动相条件为：甲醇∶水＝50∶50-100∶0或乙腈∶水＝50∶ 50-100∶0，收集在249nm处有吸收的流出液，浓缩干燥即得修饰脂质。

实施例2甘草次酸修饰磷脂的制备：

称取1g甘草次酸置于250mL圆底烧瓶中，向瓶内加入100mL二氯甲烷，磁力搅拌溶解。 再向瓶内加入0.5gEDC，磁力搅拌至溶解后，冰水浴冷却，加入0.4g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (以下简称DSPE)，继续搅拌至完全溶解，保持冰水浴冷却，避光反应24小时。有机层分 别用1mol/L的HCl溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后，减 压浓缩除去有机溶剂。所得固体柱层析(正己烷∶丙酮＝95∶5-25∶75梯度洗脱)后得到白 色固体0.5g(产率76.8％)。

上述固体也可以采用高效液相纯化，其色谱条件为甲醇/乙腈-水系统，检测器为紫外检测 器，检测波长为249nm；具体的流动相条件为：甲醇∶水＝50∶50-100∶0或乙腈∶水＝50∶ 50-100∶0，收集在249nm处有吸收的流出液，浓缩干燥即得修饰脂质。

实施例3甘草次酸修饰聚乙二醇化胆固醇的制备：

称取5g甘草次酸置于500mL圆底烧瓶中，向瓶内加入250mL二氯甲烷，磁力搅拌溶解。 再向瓶内加入2.5gEDC和0.9g 4-二甲氨基吡啶(以下简称DMAP)，磁力搅拌至溶解后，加 入18g聚乙二醇2000，继续搅拌，室温反应12小时。有机层分别用1mol/L的HCl溶液， 饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩除去有机溶剂。所得固 体柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝0∶100-30∶70梯度洗脱)后得到浅黄色固体7.8g。将该固体置 于500mL圆底烧瓶中，向瓶内加入200mL二氯甲烷，磁力搅拌溶解。再向瓶内加入2g丁二 酸单胆固醇酯，磁力搅拌至溶解后，加入1g EDC和0.4g DMAP，继续搅拌，室温反应24小 时。有机层分别用1mol/L的HCl溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl溶液洗涤，无水硫酸 钠干燥后，减压浓缩除去有机溶剂。所得固体柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝0∶100-30∶70梯度 洗脱)后得到淡黄色固体14.6g(产率54.9％)。

上述固体也可以采用高效液相纯化，其色谱条件为甲醇/乙腈-水系统，检测器为紫外检测 器，检测波长为249nm；具体的流动相条件为：甲醇∶水＝50∶50-100∶0或乙腈∶水＝50∶ 50-100∶0，收集在249nm处有吸收的流出液，浓缩干燥即得修饰脂质。

上述固体也可以采用高效液相纯化，其色谱条件为甲醇/乙腈-水系统，检测器为紫外检测 器，检测波长为249nm；具体的流动相条件为：甲醇∶水＝50∶50-100∶0或乙腈∶水＝50∶ 50-100∶0，收集在249nm处有吸收的流出液，浓缩干燥即得修饰脂质。

实施例4甘草次酸修饰聚乙二醇化磷脂的制备：

称取5g甘草次酸置于500mL圆底烧瓶中，向瓶内加入250mL二氯甲烷，磁力搅拌溶解。 再向瓶内加入2.5gEDC和0.9g DMAP，磁力搅拌至溶解后，加入18g聚乙二醇2000，继续 搅拌，室温反应12小时。有机层分别用1mol/L的HCl溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和NaCl 溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后减压浓缩除去有机溶剂。所得固体柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝0 ∶100-30∶70梯度洗脱)后得到浅黄色固体7.8g。将该固体置于500mL圆底烧瓶中，向瓶 内加入200mL二氯甲烷，磁力搅拌溶解。再向瓶内加入1g丁二酸酐，磁力搅拌至溶解后， 加热回流反应2小时。冷却后分别用饱和碳酸氢钠，饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥 后，再向溶液中加入4g二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)，磁力搅拌至溶解后，加入1.2g EDC， 继续搅拌，室温反应24小时。有机层分别用1mol/L的HCl溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和 氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后，减压浓缩除去有机溶剂。所得固体柱层析(二氯甲烷 ∶甲醇＝0∶100-30∶70梯度洗脱)后得到淡黄色固体13.2g(产率44.3％)。

上述固体也可以采用高效液相纯化，其色谱条件为甲醇/乙腈-水系统，检测器为紫外检测 器，检测波长为249nm；具体的流动相条件为：甲醇∶水＝50∶50-100∶0或乙腈∶水＝50∶ 50-100∶0，收集在249nm处有吸收的流出液，浓缩干燥即得修饰脂质。

本发明甘草次酸修饰脂质的制备过程中，当采用甘草次酸与磷脂或胆固醇反应时：甘草 次酸与磷脂或胆固醇的反应关系：摩尔比为1∶1；缩合剂与反应物料(即原料总量)的反应 关系为：摩尔比为1∶1-1∶5；当采用甘草次酸与磷脂(或胆固醇)、聚乙二醇反应时：甘草 次酸与磷脂(或胆固醇)、聚乙二醇的反应关系：摩尔比为1∶1∶1；缩合剂与反应物料(即 原料总量)的反应关系为：摩尔比为1∶1-1∶5。若应用催化剂DMAP，其用量与反应物料 甘草次酸的反应关系为：摩尔比是1∶1。

本发明甘草次酸修饰脂质制成的脂质体或胶束可克服“肝细胞靶向甘草次酸表面修饰脂 质体的制备”和“Preparation，characterization and uptake by primary cultured rat hepatocytes of liposomes surface-modified with glycyrrhetinic acid.Pharmazie”公开的甘草次酸修饰脂质体的不 足，具体表现如下：

其一，本发明制备的肝靶向脂质体或胶束具有良好的生物相容性和生物可降解性。所使 用的材料为磷脂、胆固醇、聚乙二醇和甘草次酸，其中，磷脂和胆固醇为人体细胞膜的组成 成分，具有较好的生物相容性；聚乙二醇是可以生物降解的；制备的肝靶向脂质均采用酯键 连接，可降解为相应的单体成分，因此整个载体系统具有良好的生物相容性和生物可降解性。

其二，本发明制备的肝靶向脂质体或胶束使用的肝靶向物质甘草次酸本身就具有抗肝癌 和治疗肝炎的活性，因此制备的肝靶向脂质体或胶束也具有抗肝癌和治疗肝炎的活性，包装 治疗药物以后，具有协同抗癌作用。空白肝靶向脂质体或胶束体外抗人肝癌细胞HepG2活性 见图1。

其三，本发明制备了引入亲水基团聚乙二醇的肝靶向脂质，制得的相应胶束和脂质体具 有隐形的特性，可避免单核巨噬细胞系统的吞噬，可以较多量的到达肝实质细胞，可作为那 些基于肝实质细胞的疾病治疗的优良载体。

其四，本发明制备的肝靶向脂质体的肝靶向物质甘草次酸修饰密度范围为0.5～30％，甘 草次酸修饰脂质的用量在0.5～30％范围内可调，均可制得粒径大小适宜，稳定性好的脂质体， 可满足不同肝脏疾病治疗对肝靶向物质甘草次酸修饰密度的需求。

其五，本发明制备的载小分子药物的肝靶向脂质体粒径为：82～157nm，载单一大分子 药物或大分子药物/小分子药物复方的肝靶向脂质体粒径为：128-256nm，载小分子药物的肝 靶向胶束粒径为：55～193nm，载单一大分子药物或大分子药物/小分子药物复方的肝靶向胶 束粒径为：97-298nm。粒径范围较大，调节制备工艺参数即可获得不同粒径的脂质体或者胶 束，可满足不同肝脏疾病对粒径的需求，适用范围广。

其六，本发明制备的肝靶向脂质体或胶束可包载基因、蛋白、多肽或小分子药物中的任 意一种或多种，适用范围广，可解决单一制剂实现肝脏疾病治疗的联合用药问题。

本发明提供的由甘草次酸介导的肝靶向脂质体载体，它是由本发明甘草次酸修饰脂质与 胆固醇和磷脂制成，其中，各组分配比关系如下：胆固醇和磷脂的摩尔比为1∶1～10，甘草次 酸修饰脂质的摩尔含量为胆固醇和磷脂的总摩尔数的0.5～30％。进一步优选，甘草次酸修饰 脂质的摩尔含量为胆固醇和磷脂的总摩尔数的1～25％。

为了探寻制备工艺简单、工艺稳定、质量易于控制的肝靶向脂质体制备方法，比较考察 了多种脂质体的制备方法如薄膜法、逆向蒸发法、注入法、超声法等多种制备方法，优选出 薄膜法、逆向蒸发法和注入法三种方法用于制备肝靶向脂质体。然后对每一种方法的工艺参 数进行考察，如：有机溶剂种类、用量，药脂比，甘草次酸修饰脂质用量等进行优化，获得 了本发明中的粒径、zeta电位稳定的肝靶向脂质体配方。

具体地，采用薄膜法、逆向蒸发法和注入法制备肝靶向脂质体的步骤如下：

1、薄膜法：

1)直接制备法

a、称取甘草次酸修饰脂质、胆固醇和磷脂适量置于旋蒸瓶中，加入氯仿、乙醚或氯仿- 甲醇复合溶剂使之完全溶解；

b、真空旋转蒸发得脂质体膜，干燥；

c、在脂质体膜中加入葡萄糖溶液、PBS、HEPS或纯化水水化得肝靶向空白脂质体溶液；

d、将基因包括裸基因、载基因的质粒载体或病毒载体，正电性蛋白或正电性多肽与肝靶 向空白脂质体溶液孵育，即得。

若制备含有小分子药物的肝靶向脂质体，在a步骤中加入与脂质材料共同成膜，或先溶 于c步骤中的水化溶剂中。

若制备载非正电性蛋白或多肽的肝靶向脂质体，则先将非正电性蛋白或多肽溶于c步骤 中的水化溶剂中。

2)后插入法

a、称取胆固醇和磷脂适量置于旋蒸瓶中，加入氯仿、乙醚或氯仿-甲醇复合溶剂使之完 全溶解；

b、真空旋转蒸发得脂质体膜，干燥；

c、在脂质体膜中加入葡萄糖溶液、PBS、HEPS或纯化水水化得空白脂质体溶液；

d、将基因包括裸基因、载基因的质粒载体或病毒载体，正电性蛋白或正电性多肽与空白 脂质体溶液孵育，即得载药脂质体；

e、取甘草次酸修饰脂质适量与载药脂质体溶液孵育，即得肝靶向载药脂质体。

若制备含有小分子药物的肝靶向脂质体，在a步骤中加入与脂质材料共同成膜，或先溶 于c步骤中的水化溶剂中。

若制备载非正电性蛋白或多肽的肝靶向脂质体，则先将非正电性蛋白或多肽溶于c步骤 中的水化溶剂中。

2、注入法：

1)直接制备法

a、称取甘草次酸修饰脂质、胆固醇和磷脂适量，乙醚或乙醇使之完全溶解；

b、注入葡萄糖溶液、PBS、HEPS或纯化水溶液中，真空旋转蒸发除尽有机溶剂，即得 肝靶向空白脂质体溶液；

c、将基因包括裸基因、载基因的质粒载体或病毒载体，正电性蛋白或正电性多肽与肝靶 向空白脂质体溶液孵育，即得。

若制备含有小分子药物的肝靶向脂质体，在a步骤中加入与脂质材料共溶解，或先溶于 b步骤中的水相溶剂中。

若制备载非正电性蛋白或多肽的肝靶向脂质体，则先将非正电性蛋白或多肽溶于b步骤 中的水相溶剂中。

2)后插入法

a、称取胆固醇和磷脂适量，乙醚或乙醇使之完全溶解；

b、注入葡萄糖溶液、PBS、HEPS或纯化水溶液中，真空旋转蒸发除尽有机溶剂，即得 空白脂质体溶液；

c、将基因包括裸基因、载基因的质粒载体或病毒载体，正电性蛋白或正电性多肽与空白 脂质体溶液孵育，即得载药脂质体；

d、取甘草次酸修饰脂质适量与载药脂质体溶液孵育，即得肝靶向载药脂质体。

若制备含有小分子药物的肝靶向脂质体，在a步骤中加入与脂质材料共溶解，或先溶于 b步骤中的水相溶剂中。

若制备载非正电性蛋白或多肽的肝靶向脂质体，则先将非正电性蛋白或多肽溶于b步骤 中的水相溶剂中。

3、逆向蒸发法

1)直接制备法

a、称取甘草次酸修饰脂质、胆固醇和磷脂适量，氯仿或乙醚使之完全溶解；

b、加入水溶液，进行短时超声，直至形成稳定的W/O型乳剂；

c、减压蒸发有机溶剂，达到胶态后，加入葡萄糖溶液、PBS、HEPS等溶液，旋转使器 壁上的凝胶脱落，在减压下继续蒸发，除尽有机溶剂，即得肝靶向空白脂质体溶液；

d、将基因包括裸基因、载基因的质粒载体或病毒载体，正电性蛋白或正电性多肽与肝靶 向空白脂质体溶液孵育，即得。

若制备含有小分子药物的肝靶向脂质体，在a步骤中加入与脂质材料共溶解，或先溶于 b步骤中的水溶液中。

若制备载基因(包括裸基因、载基因的质粒载体或病毒载体)、蛋白或多肽(包括各种电 性的蛋白或多肽)的肝靶向脂质体，则先将基因、蛋白或多肽溶于b步骤中的水溶液中。

2)后插入法

a、称取胆固醇和磷脂适量，氯仿或乙醚使之完全溶解；

b、加入水溶液，进行短时超声，直至形成稳定的W/O型乳剂；

c、减压蒸发有机溶剂，达到胶态后，加入葡萄糖溶液、PBS、HEPS等溶液，旋转使器 壁上的凝胶脱落，在减压下继续蒸发，除尽有机溶剂，即得空白脂质体溶液；

d、将基因包括裸基因、载基因的质粒载体或病毒载体，正电性蛋白或正电性多肽与空白 脂质体溶液孵育，即得载药脂质体；

e、取甘草次酸修饰脂质适量与载药脂质体溶液孵育，即得肝靶向载药脂质体。

若制备含有小分子药物的肝靶向脂质体，在a步骤中加入与脂质材料共溶解，或先溶于 b步骤中的水溶液中。

若制备载基因(包括裸基因、载基因的质粒载体或病毒载体)、蛋白或多肽(包括各种电 性的蛋白或多肽)的肝靶向脂质体，则先将基因、蛋白或多肽溶于b步骤中的水溶液中。

肝靶向脂质体的详细制备工艺可见以下6个具体实施例。

实施例5薄膜法直接制备肝靶向脂质体

称取胆固醇5.5mg、甘草次酸修饰胆固醇5mg(实施例1制备)和1，2-二油酰基-3-三甲 基氨基-丙烷(正电荷脂质)50mg置于茄形瓶中，加入氯仿使之完全溶解；旋转蒸发得脂质体膜， 干燥；加入5％葡萄糖溶液旋转水化，探头超声即得半透明有淡蓝色乳光的肝靶向空白脂质 体溶液。将绿荧光蛋白质粒与肝靶向空白脂质体溶液(质量比为1∶7)孵育，即得载基因的肝 靶向脂质体。

实施例6薄膜法后插入制备肝靶向脂质体

胆固醇2.8mg、1，2-二油酰基-3-三甲基氨基-丙烷(正电荷脂质)10mg及紫杉醇1mg置于 茄形瓶中，加入氯仿使之完全溶解；旋转蒸发得脂质体膜，干燥；加入5％葡萄糖溶液旋转 水化，探头超声即得半透明有淡蓝色乳光的载紫杉醇的脂质体溶液。将绿荧光蛋白质粒与肝 靶向空白脂质体溶液(质量比为1∶5)孵育，即得基因/化药共载的脂质体；然后加入甘草次 酸修饰聚乙二醇化胆固醇(实施例3制备)(3.2mg)，与基因/化药共载的脂质体孵育，即得 基因/化药共载的肝靶向脂质体。

实施例7注入法直接制备肝靶向脂质体

称取甘草次酸修饰磷脂(具体为修饰二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，如实施例2制备)2.6mg、 胆固醇2.8mg、大豆磷脂10mg及拉米夫定1mg，乙醇使之完全溶解；注入PBS溶液中，真 空旋转蒸发除尽乙醇，即得载拉米夫定的肝靶向脂质体。

实施例8注入法后插入制备肝靶向脂质体

称取胆固醇4.2mg、卵磷脂30mg及阿霉素1mg，乙醇使之完全溶解；注入PBS溶液中， 真空旋转蒸发除尽乙醇，即得载阿霉素的脂质体。然后加入甘草次酸修饰聚乙二醇化磷脂(实 施例4制备)溶液(31.5mg)，与载阿霉素的脂质体孵育，即得载阿霉素的肝靶向脂质体。

实施例9逆向蒸发法直接制备肝靶向脂质体

甘草次酸修饰胆固醇(实施例1制备)5.8mg、胆固醇6.6mg、大豆磷脂20mg及牛血清 白蛋白2mg，氯仿使之完全溶解；加入水溶液，进行短时超声，直至形成稳定的W/O型乳剂； 减压蒸发有机溶剂，达到胶态后，加入HEPS溶液，旋转使器壁上的凝胶脱落，在减压下继 续蒸发，除尽残留氯仿，即得肝靶向载蛋白的脂质体溶液。

实施例10逆向蒸发法后插入制备肝靶向脂质体。

胆固醇7.5mg、大豆磷脂35mg、牛血清白蛋白2mg及硫酸长春新碱1mg，氯仿使之完全 溶解；加入水溶液，进行短时超声，直至形成稳定的W/O型乳剂；减压蒸发有机溶剂，达到 胶态后，加入PBS溶液，旋转使器壁上的凝胶脱落，在减压下继续蒸发，除尽残留氯仿，即 得化药/蛋白共载的脂质体溶液。然后加入甘草次酸修饰聚乙二醇化胆固醇溶液(实施例3制 备)(4.5mg)，与化药/蛋白共载的脂质体孵育，即得化药/蛋白共载的肝靶向脂质体。

本发明提供的由甘草次酸介导的肝靶向胶束载体，它是由本发明磷脂(或胆固醇)与聚 乙二醇制备的甘草次酸修饰脂质制备而成，根据包载药物的性质不同，可采用混合法、乳化- 溶剂挥发法、自组装溶剂蒸发法、薄膜分散法、透析法、熔融法中的任意一种制成肝靶向胶 束。

为了探寻肝靶向胶束制备方法的稳定工艺参数，采用混合法、乳化-溶剂挥发法、自组装 溶剂蒸发法、薄膜分散法、透析法、熔融法等多种胶束制备方法对载不同性质药物的肝靶向 胶束进行了大量的试制，拟定了各种制备方法的药物适用范围、特点：混合法适用于基因、 蛋白、多肽或小分子药物的包载，制备的胶束溶液中聚乙二醇的甘草次酸修饰脂质浓度不超 过20mg/ml；乳化-溶剂挥发法适用于难溶性药物的包载。制备的胶束载药量较高，如槲皮素 可高达25％；自组装溶剂蒸发法适用于基因、蛋白、多肽或小分子药物的包载，制备的胶束 溶液中聚乙二醇的甘草次酸修饰脂质浓度可高达100mg/ml；薄膜分散法适用于基因、蛋白、 多肽或小分子药物的包载。制备的胶束溶液中聚乙二醇的甘草次酸修饰脂质浓度也可高达 100mg/ml，采用自组装溶剂蒸发法不能获得较好包封率和粒径的药物可采用此法；透析法适 用于难溶性药物的包载。制备方法较为复杂，不易规模化制备，采用上述方法均难以获得较 高包封率或适宜粒径分布时方选用；熔融法适用于对热稳定的药物。

肝靶向胶束的详细制备工艺可见以下6个具体实施例。

实施例11混合法制备肝靶向胶束

由实施例3制备的修饰脂质50mg、多烯紫杉醇0.5mg先混合，然后加入5ml水，水浴超 声，过滤除掉未完全溶解的多烯紫杉醇，即得载多烯紫杉醇的肝靶向胶束溶液。

实施例12乳化-溶剂挥发法制备肝靶向胶束

将1mg紫杉醇先溶于1ml氯仿中，然后倒入用混合法制得的10mg/ml由实施例3制备的 修饰脂质胶束水溶液中，剧烈搅拌或超声形成O/W型乳状液，搅拌或旋蒸挥去有机溶剂， 即得载紫杉醇的的肝靶向胶束溶液。

实施例13自组装溶剂蒸发法制备肝靶向胶束

将由实施例4制备的修饰脂质40mg与1mg槲皮素溶于1ml丙酮中，再逐渐加到含干扰 素的水溶液中，形成胶束后，搅拌下挥尽丙酮，即得载槲皮素/干扰素的肝靶向胶束溶液。

实施例14薄膜分散法制备肝靶向胶束

将由实施例4制备的修饰脂质100mg与青蒿琥酯5mg溶于氯仿中，旋蒸除尽有机溶剂， 形成均匀的薄膜，加入到含绿荧光蛋白质粒的水溶液，旋转洗膜，即得载青蒿琥酯/基因的肝 靶向胶束溶液。

实施例15透析法制备肝靶向胶束

将由实施例3制备的修饰脂质30mg与槲皮素溶于2mlTHF，然后置于截留分子量为1000 的有机系透析袋(截留分子量选择依据为：可截留载体材料而有机溶剂及水可以任意通过) 中，水透析24h，除尽有机溶剂，即得载槲皮素的肝靶向胶束溶液。

实施例16熔融法制备肝靶向胶束

将由实施例4制备的修饰脂质60mg与紫杉醇共混，加热至60℃使熔融，加入水溶液， 搅拌，除去未溶解的药物，即得载紫杉醇的肝靶向胶束溶液。

以下通过脂质体及胶束粒径、电位测定，肝靶向脂质体复合物及胶束复合物载药量等实 验数据说明本发明的有益效果。

一、发明人将本发明甘草次酸修饰脂质、胆固醇、磷脂按胆固醇和磷脂的摩尔比为1∶1～ 10，甘草次酸修饰脂质的摩尔含量为胆固醇和磷脂的总摩尔数的0.5～30％的配比关系制备的 肝靶向脂质体用纯化水稀释100倍，于25℃用激光散射粒径分析仪测定(Zetsizer Nano ZS90)， 并记录粒径均值和多分散系数(polydispersity index，PDI)。结果显示载小分子药物的甘草次酸 修饰肝靶向脂质体粒径为：82～157nm，载单一大分子药物或大分子药物/小分子药物复方的 甘草次酸修饰肝靶向脂质体粒径为：128-256nm，载小分子药物的甘草次酸修饰肝靶向胶束粒 径为：55～193nm，载单一大分子药物或大分子药物/小分子药物复方的甘草次酸修饰肝靶向 胶束粒径为：97-298nm。粒径范围较大，调节制备工艺参数即可获得不同粒径的脂质体或者 胶束，可满足不同肝脏疾病对粒径的需求，适用范围广，从而具有较好的肝靶向治疗前景， 弥补了对比文件“肝细胞靶向甘草次酸表面修饰脂质体的制备”和“Preparation，characterization and uptake by primary cultured rat hepatocytes of liposomes surface-modified with glycyrrhetinic acid.Pharmazie”中存在的不足。

肝靶向空白脂质体、肝靶向载基因脂质体复合物和肝靶向载药胶束的粒径分布见图2～ 图4。

二、发明人将本发明甘草次酸修饰脂质、胆固醇、磷脂按胆固醇和磷脂的摩尔比为1∶1～ 10，甘草次酸修饰脂质的摩尔含量为胆固醇和磷脂的总摩尔数的0.5～30％的配比关系制备的 肝靶向脂质体用1mM的NaCl溶液稀释100倍，于25℃用激光散射粒径分析仪测定(Zetsizer Nano ZS90)，结果显示，肝靶向脂质体的zeta电位主要跟磷脂的种类关系密切，中性磷脂制 备的肝靶向脂质体的zeta电位几乎接近中性，负电荷磷脂制备的肝靶向脂质体的zeta电位呈 电负性，而正电荷脂质材料制备的肝靶向脂质体的zeta电位则呈正电性。

肝靶向空白脂质体和肝靶向载基因脂质体复合物的zeta电位分布见图5和图6，并记录 zeta电位均值。

三、取肝靶向载基因脂质体复合物溶液(实施例5)，将样品稀释至0.01-0.05mg/ml，移 取5-10μl滴加到新解离的石英片表面，用吸管或移液枪使液滴均匀分散于石英片表面，必要 时用Milli-Q水冲洗石英片，置于洁净的培养皿中并盖上，空气中干燥即得样品。于原子力显 微镜(SPA400，SII Nanotechnology，Inc.)下观察，图像规格为5×5μm²或2×2μm²。图像 经专门的原子力处理软件Spiwin分析处理而得，结果见图7。粒径为150nm左右，表面圆整 光滑。

四、分别取1％和5％甘草次酸修饰脂质(制备工艺参见实施例5)制备的肝靶向脂质体 (1％和5％是指甘草次酸修饰脂质的摩尔含量为胆固醇和磷脂的总摩尔数的百分比)100μL 于12个0.5mLEP管中，按照甘草次酸修饰的肝靶向脂质体/基因质量比2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、 6∶1和7∶1(w/w)分别加入基因，37℃孵育30min后于130V、1％琼脂糖凝胶电泳分析15min， 采用凝胶成像系统Quantity One(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)照相，见 图8。可见，1％甘草次酸修饰的肝靶向脂质体与基因质量比为7∶1时，可完全将基因包载；5 ％甘草次酸修饰的肝靶向脂质体与基因质量比为4∶1时，可完全将基因包载。

针对本发明四大类修饰脂质(甘草次酸-磷脂反应；甘草次酸-胆固醇反应；甘草次酸-聚 乙二醇-磷脂反应；甘草次酸-聚乙二醇-胆固醇反应。)参照上述评价方法，即可确定含不同用 量的甘草次酸修饰脂质与所载药物的配比关系，达到适宜的包载效果。

五、HepG2细胞接种至6孔板中，每孔150000个左右，接种后于37℃，5％CO₂条件过 夜，使细胞贴壁。弃去有血清的DMEM培养基，加入无血清的培养基至少孵育30min后， 加入新制备的脂质体绿荧光蛋白质粒复合物(含绿荧光蛋白质粒1μg)，孵育5-6h，更换新鲜 双有DMEM培养基，继续孵育42h左右，于倒置荧光显微镜IX71(Olympus Corp.，Shinjuku， Tokyo，Japan)下观察荧光并照相，结果见图9，即图9(A)和图9(B)。

六、将载槲皮素的肝靶向胶束(实施例14)溶液稀释5倍以后，滴在铜网上，2％磷钨酸 钠染色后，HITACHI H-600透射电子显微镜观察粒子形态，结果见图10，可见胶束圆整，粒 径分布均匀。