XA因子抑制剂N-(5-氯-2-吡啶基)-2-4-(二甲氨基)亚氨基甲基苯甲酰基氨基-5-甲氧基-苯甲酰胺的医药盐和多晶型

摘要

本发明提供一种盐，其包含式(I)化合物和具有抗哺乳动物因子Xa的活性的酸。本发明也涉及制备所述式(I)化合物的方法。

说明书

本申请为申请号为200680041555.4、申请日为2006年11月7日、发明名称为“XA因 子抑制剂N-(5-氯-2-吡啶基)-2-[[4-[(二甲氨基)亚氨基甲基]苯甲酰基]氨基]-5-甲氧基-苯甲酰胺 的医药盐和多晶型”的中国发明专利申请的分案申请。

本申请案主张2005年11月申请的美国临时专利申请案第60/735,224号在35U.S.C§119 (e)下的优先权，其全文以引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及Xa因子抑制剂的新颖医药盐和其多晶型，以及制造Xa因子抑制剂方法。

背景技术

通过外科方法或通过血管收缩和凝血作用的生理特性而发生止血，即控制出血。特定言 之，本发明涉及血液凝聚作用和在损伤、发炎、疾病、先天性缺陷、功能异常或其它破裂后 其参与维持哺乳动物循环完整性的方式。尽管在恢复止血和血栓性疾病中均包含血小板和血 液凝聚，但凝血级联反应的某些组份是在血小板凝集和血纤维蛋白沉积所包含的过程中造成 放大和加速的主要原因，所述血小板凝集和血纤维蛋白沉积是血栓形成和止血中的主要事件。

凝块形成包含血纤维蛋白原转化为血纤维蛋白，所述血纤维蛋白聚合为网状物以在 损伤后恢复止血。类似过程在血栓性疾病中导致血管闭合。血纤维蛋白原转化为血纤维 蛋白是通过凝血酶(血液凝聚级联反应中的一系列反应的最终产物)来催化。凝血酶也 为活化血小板中的关键参与者，从而在动脉和静脉血流的两种条件下有助于血栓形成。 出于所述原因，假设凝血酶的有效调节可导致对于血栓形成的有效调节。多种当前使用 的抗凝剂直接或间接影响凝血酶(也就是未分级肝素、低分子量肝素、类肝素化合物、 五糖和杀鼠灵(warfarin))。对凝血酶活性的直接或间接抑制在临床发展中已成为多种抗 凝剂的焦点(由Eriksson和Quinlan所评论，药物(Drugs)11：1411-1429，2006)。

凝血酶原(凝血酶的前体)通过Xa因子转化为活性酶。局部活化组织因子/VIIa因 子介导的Xa因子的产生是由IXa因子/VIIIa因子复合物而放大，且其导致凝血酶原酶在 经活化的血小板上组合。作为凝血酶原酶复合物的部分的Xa因子是引起脉管结构中持续 形成凝血酶的唯一酶。Xa因子为丝氨酸蛋白酶(其前体X因子的活化形式)，且为钙离 子结合、含γ羧基谷氨酸(GLA)、维生素K依赖性和凝血因子的一员。与作用于包括血 纤维蛋白原和PAR受体(经蛋白酶活化的受体，Coughlin，血栓形成止血杂志(J  Thrombosis Haemostasis)3：1800-1814，2005)的多种蛋白质基质的凝血酶不同，Xa因 子似乎具有单一生理性基质(即凝血酶原)。由于Xa因子的一个分子可产生大于1000 个分子的凝血酶(Mann等人，血栓形成止血杂志1：1504-1514，2003)，因此作为间接抑 制凝血酶形成的方法的Xa因子的直接抑制作用可为有效的抗凝策略。这个论断是基于凝 血酶原酶在凝血酶合成中的关键作用，且基于凝血酶原酶的抑制作用对所有血小板凝集 和凝血路径将具有显著效应。

诸如VIIa因子、IXa因子或Xa因子的活化蛋白酶独立具有较弱的蛋白水解活性。 然而，其与辅因子依赖性膜结合复合物的组合显著增强其催化效率。这个效应对于Xa 因子来说最为剧烈，其中效率增加10⁵倍(Mann等人，血液(Blood)76(1)：1-16，1990)。 由于血液中存在较高浓度的酶原(1.4μM凝血酶原比150nM Xa因子)和活化动力学， 因此需要抑制小于凝血酶量的Xa因子以达到抗凝效应。与凝血酶相比，作为治疗靶的 Xa因子的假设优势的间接证据也可在用于预防深静脉血栓症的临床试验中发现。磺达肝 素(Fondaparinux)(一种抗凝血酶III依赖性Xa因子抑制剂)在四次矫形外科手术的试 验中经证明优于伊诺肝素(enoxaparin)(一种抑制凝血酶和Xa因子两者的低分子量肝 素)(Turpie，等人，美国内科杂志(Archives Internal Medicine)162(16)：1833-1840， 2002)。因此，推荐选择性抑制Xa因子的化合物可用作活体外诊断剂或用于某些血栓性 病症中的治疗投药(例如参见WO 94/13693)。

已报道多种Xa因子抑制剂作为来源于吸血性有机体的多肽，以及非大多肽型抑制剂 的化合物。其它Xa因子抑制剂包括小分子有机化合物，诸如具有甲脒基取代基的含氮杂 环化合物，其中化合物的两个官能团可在两个活性位点处结合到Xa因子。举例来说， WO 98/28269描述具有末端甲脒基(-C(＝NH)-NH₂)的吡唑化合物；WO 97/21437描 述经碱性基团取代的苯并咪唑化合物，所述化合物经由直链或支链伸烷基、-C(＝O)- 或-S(＝O)₂-桥基连接到萘基；WO 99/10316描述具有4-苯基-N-烷基甲脒基-哌啶和4- 苯氧基-N-烷基甲脒基-哌啶基的化合物，所述化合物经由羧酰胺伸烷基氨基桥连接到3- 甲脒基苯基；且EP 798295描述具有4-苯氧基-N-烷基甲脒基哌啶基的化合物，所述化合 物经由经取代或未经取代的磺酰胺或羧酰胺桥基连接到甲脒基萘基。

其它所报道的Xa因子抑制剂包括具有包含经由酰胺键连接的苯基-甲脒基、苯基和 卤基-苯基的结构的那些Xa因子抑制剂(美国专利第6,844,367B1号)。其它Xa因子抑 制剂的卤基-苯基已由卤基-吡啶基置换(参见美国专利第6,376,515B2号和第6,835,739 B2号)。美国专利第6,376,515B2号揭示在实例206中识别的特定Xa因子抑制剂化合物， 其也于美国专利第6,835,739B2号中揭示为实例206且在本文中识别为式I化合物。式I 化合物由以下结构表示：

研发Xa因子的选择性抑制剂的进一步工作已导致惊人发现，这种化合物的某些盐展 现出比游离碱化合物本身或其它盐更好的热稳定性和水解稳定性，其中顺丁烯二酸盐具 有所观测到的最佳稳定性。

发明内容

在一实施例中，本发明涉及一种盐，其包含式I化合物：

和酸，其中所述酸是选自由盐酸、乳酸、顺丁烯二酸、苯氧乙酸、丙酸、丁二酸、 己二酸、抗坏血酸、樟脑酸、葡萄糖酸、磷酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、反丁烯二酸、 乙醇酸、萘-1，5-二磺酸、龙胆酸和苯磺酸组成的群组。

在一优选实施例中，所述酸是选自由盐酸、乳酸、顺丁烯二酸、苯氧乙酸、丙酸、 丁二酸、己二酸、抗坏血酸、樟脑酸、葡萄糖酸、磷酸、酒石酸、柠檬酸和甲磺酸组成 的群组。

在另一优选实施例中，所述酸是选自由盐酸、乳酸、顺丁烯二酸、苯氧乙酸、丙酸 和丁二酸组成的群组。在一实施例中，所述盐为顺丁烯二酸盐或丙酸盐。预期式I化合 物的顺丁烯二酸盐可通过将式I化合物的一个或一个以上氮原子质子化而形成。在一实 施例中，式I的甲脒基氮(＝NH)经质子化(＝NH₂⁺)以形成盐。

在一优选实施例中，式I化合物的顺丁烯二酸盐由式II来表示：

在另一实施例中，本发明提供一种具有结晶多晶型形态的式II的盐。在优选实施例 中，结晶多晶型形态展现的粉末X射线衍射图案具有至少四个且更优选八个以下近似特 征峰位：4.9、9.7、13.8、14.1、15.2、17.6、18.5、20.8、21.6、22.7、24.1、26.3、26.8 度2θ。在又一实施例中，粉末X射线衍射图案具有4.9、9.7、11.8、13.8、14.1，15.2、 17.6、18.5、19.9、20.8、21.6、22.7、24.1、25.0、26.3、26.8度2θ的近似特征峰位。本 发明预期所述近似特征峰将具有高达约±0.2度2θ的偏差。在又一实施例中，粉末X射 线衍射图案近似于图1所示的粉末X射线衍射图案。在其它实施例中，本发明提供一种 具有结晶多晶型形态的式II的盐，其具有近似于图2所示的差示扫描热量测定图案的差 示扫描热量测定图案。式II的盐的这种结晶多晶型提供用于适合于临床研究的可再生形 态的这种化合物。

在另一实施例中，本发明提供一种用于预防或治疗哺乳动物中以不良血栓形成为特 征的病症的医药组合物，其包含医药学上可接受的载剂和治疗有效量的盐，所述盐包含 式I化合物、式I化合物的顺丁烯二酸盐、式II的盐或具有结晶多晶型形态的式II的盐。 在另一实施例中，医药组合物为片剂形式。在又一实施例中，医药组合物为胶囊形式。 在又一实施例中，医药组合物为锭剂形式。在其它实施例中，医药组合物为适于输注、 注射或经皮传递的形式。

在某些实施例中，本发明提供一种用于预防或治疗哺乳动物中以不良血栓形成为特 征的病症的方法，其包含向哺乳动物投与治疗有效量的盐，所述盐包含式I化合物、式I 化合物的顺丁烯二酸盐、式II的盐或具有结晶多晶型形态的式II的盐。在另一实施例中， 所述病症是选自由急性冠脉综合症、心肌梗塞、不稳定性心绞痛、顽固性心绞痛、溶 血栓疗法后或冠脉血管成形术后出现的闭塞性冠脉血栓、血栓介导性脑血管综合症、栓 塞性中风、血栓性中风、短暂性缺血性发作、静脉血栓症、深静脉血栓症、肺栓塞、凝 血症、散播性血管内凝血、血栓性血小板缺乏紫斑症、血栓闭塞性脉管炎、与肝素诱导 性血小板减少症相关联的血栓性疾病、与体外循环相关联的血栓性并发症、与使用仪器 相关联的血栓性并发症和与假体装置的装配相关联的血栓性并发症组成的群组。

在另一实施例中，本发明提供一种抑制血液样本凝聚的方法，其包含使样本与盐接 触的步骤，所述盐包含式I化合物、式I化合物的顺丁烯二酸盐、式II的盐或具有结晶 多晶型形态的式II的盐。

在又一实施例中，本发明提供一种制备式I化合物的方法，其包含使LiN(CH₃)₂与式 III化合物：

或其盐在条件下接触以形成式I化合物。

在某些实施例中，所述条件为亲核性加成条件且包含使用非极性、非质子性溶剂。 在某些其它实施例中，溶剂为选自由四氢呋喃、二乙醚、二甲氧基甲烷、二噁烷、己烷、 甲基叔丁基醚、庚烷和环己烷组成的群组的一员。在某些实施例中，式III化合物的盐为 盐酸盐。

在某些实施例中，本发明提供一种制备式I化合物的方法，其中所述方法在小于10 ℃的温度下进行。

在另一实施例中，本发明提供一种制备式I化合物的方法，其中以至少50％的产率 提供具有式I的化合物。在另一实施例中，以至少65％的产率提供具有式I的化合物。 在又一实施例中，以至少75％的产率提供具有式I的化合物。

在另一实施例中，本发明提供一种制备克级或千克级式I化合物的方法。

附图说明

图1A和1B提供式II形式(顺丁烯二酸盐)的X射线粉末衍射(XRPD)。图1A显 示所观测到的衍射图案而图1B显示计算的衍射图案。

图2A和2B分别提供式II的顺丁烯二酸盐的差示扫描热量测定(DSC)和热解重量 分析(TGA)数据。

图3提供式II的顺丁烯二酸盐的重量分析吸水率(GVS)数据。

图4提供式II的顺丁烯二酸盐分子来自显示所用编号流程的晶体结构数据的两张视 图。在50％概率水平下，显示非氢原子的各向异性原子位移椭球体。用任意小的半径显 示氢原子。

具体实施方式

如美国专利第6,376,515B2号中所论述，式I化合物为有效Xa因子抑制剂。然而， 式I化合物并未展现最优溶解性或结晶性。发现式I化合物的乙酸盐的制备具有良好结晶 性，但并不具有良好热稳定性和水解稳定性。惊人且出乎意料的是，发现某些盐显示良 好结晶性和热稳定性和水解稳定性，其包括(例如)：盐酸盐、乳酸盐、顺丁烯二酸盐、 苯氧基乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、己二酸盐、抗坏血酸盐、樟脑酸盐、葡萄糖酸盐、 磷酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、反丁烯二酸盐、乙醇酸盐、萘-1，5-二磺酸盐、 龙胆酸盐和苯磺酸盐。

具体来说，式II的顺丁烯二酸盐展现优良结晶性、热稳定性和水解稳定性和纯度。 本发明的式II的顺丁烯二酸盐适用于治疗哺乳动物中的不良血栓形成。

I.定义

如本文所用的术语“多晶型”是指不同于另一结晶形态但共享相同化学式的物质的 结晶形态。

术语“治疗”意谓对诸如哺乳动物的个体中的疾病或病症的任何治疗，其包括：

·预防或防止疾病或病症，也就是致使临床症状不发展；

·抑制疾病或病症，也就是阻止或抑制临床症状的发展；和/或

·缓解疾病或病症，也就是致使临床症状消退。

如本文所用的术语“预防”是指对有这种需要的患者的预防性治疗。预防性治疗可 通过对具有罹患疾病风险的个体提供适当剂量的治疗剂来完成，从而大体上避免疾病发 作。

所属领域的技术人员应了解在人类医学中，由于最终感应事件可为未知、潜伏的或 直到事件发生患者仍未确认，因此并非总是可能区分“预防”与“抑制”。因此，如本文 所用的术语“预防”意欲作为“治疗”的要素以涵盖如本文所定义的“预防”和“抑制” 的两者。如本文所用的术语“保护”意谓包括“预防”。

术语“治疗有效量”是指当向需此治疗的个体投药时，足以实现治疗(如本文所定 义)通常以医药组合物形式传递的本发明的盐的量。治疗有效量将视个体和经治疗的疾 病病症、个体的体重和年龄、疾病病症的严重性、选择的特定化合物、遵循的给药方案、 投药时序、投药方式等等而变化，所有均易于由一般所属领域的技术人员来确定。

如本文所用的术语“病症”是指使用本发明的化合物、盐、组合物和方法抵抗的疾 病状态。

如本文所用的术语“血液样本”是指从个体所获取的全血或包括血浆或血清的血液 的任何部分。

II.多晶型化合物

本发明的一实施例为包含式I化合物的盐。所属领域的技术人员应了解，式I的游离 碱的其它盐也用于本发明中。所述其它盐可使用无机和有机酸来制备，所述酸提供必需 的热稳定性和水解稳定性，诸如(但不限于)盐酸、乳酸、顺丁烯二酸、苯氧乙酸、丙 酸、丁二酸、己二酸、抗坏血酸、樟脑酸、葡萄糖酸、磷酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、 反丁烯二酸、乙醇酸、萘-1，5-二磺酸、龙胆酸和苯磺酸。在一实施例中，式II的顺丁烯 二酸盐表示为：

本发明的盐(诸如式II的盐)可采用多种不同结晶形态。单一化合物采用多种结晶 形态之一的能力称为多晶型。给定化合物的结晶多晶型与所述化合物的任何其它结晶多 晶型在含有以相同方式彼此结合的相同原子方面在化学性质上是一致的，但其晶体形态 不同。相同化合物的不同结晶形态可对一种或一种以上物理特性具有影响，诸如稳定性、 溶解性、熔点、容积密度、流动特性、生物可用性等。

多晶型的特征在于其结晶结构(X-光衍射图案)、其热特性(如由DSC和TGA所测 定)、稳定性、溶解性等。X-光衍射图案以特征峰±0.2度2θ呈现。式II的盐的一种多晶 型的特征在于图1A和1B中所示的X-光衍射图案、图2A和2B中所示的DSC/TGA数 据和图3中所示的吸水性数据或所述特征的两者或所有所述的组合。所属领域的技术人 员应了解式II的盐的其它多晶型也适用于本发明。

III.医药组合物

本发明的医药组合物可用于预防或治疗罹患病症的个体，其中所述病症的以不良血 栓形成为特征。本发明的医药组合物包含医药学上可接受的载剂和治疗学上可接受量的 盐，所述盐包含式I化合物、式I化合物的顺丁烯二酸盐、式II的盐或具有结晶多晶型 形态的式II的盐。

A.医药学上可接受的载剂

本发明的盐的诊断学应用一般可利用诸如溶液或悬浮液的调配物。

在血栓性病症的处理中，本发明的盐可以诸如片剂、胶囊、用于口服的锭剂或酏剂、 栓剂、无菌溶液或悬浮液或可注射投药等等的组合物形式利用，或并入定型物品中。可 对需要治疗的个体(一般为哺乳动物个体)投与适当剂量的可提供最佳功效的本发明化 合物。投药的剂量和方法因个体不同而变化，且取决于以下因素：诸如经治疗的哺乳动 物的类型、其性别、体重、饮食、并用药物、全部临床症状、所采用的特定盐、采用所 述盐的特定用途，和熟习医药技术者可识别的其它因素。

适用于本发明的胶囊可使用传统和已知封装技术(诸如Stroud等人的美国专利第 5,735,105号中所述)来制备。胶囊一般为通常的圆柱形的中空壳，其具有足够的直径和 长度以使得将含有适当剂量活性剂的医药溶液组合物装配到胶囊中。胶囊的外部可包括 增塑剂、水、明胶、改性淀粉、胶、角叉菜胶和其混合物。所属领域的技术人员应了解 何种组合物合适。

用于本发明的片剂除活性剂以外可包含填充剂、粘合剂、压缩剂、润滑剂、崩解剂、 着色剂、水、滑石粉和其它所属领域的技术人员可识别的元素。片剂可为均质的，其核 心处具有单一层或具有多层以实现优选释放曲线。在某些情况下，本发明的片剂可经诸 如肠溶衣来涂覆。所属领域的技术人员应了解其它适用于本发明的片剂中的赋形剂。

适用于本发明的锭剂包括适当量的活性剂，以及任何填充剂、粘合剂、崩解剂、溶 剂、增溶剂、甜味剂、着色剂和所属领域的技术人员应了解为必需的任何其它成份。设 计本发明的锭剂以使得一经与患者口腔接触即溶解并释放活性剂。所属领域的技术人员 应了解其它适用于本发明的传递方法。

本发明的盐的调配物是通过将具有所要纯度的盐与生理学上可接受的载剂、赋形剂、 稳定剂等混合来制备以供存储或投药，且其可以持续释放型或定时释放型调配物来提供。 用于治疗用途的可接受的载剂或稀释剂在医药领域中已熟知，且例如描述于雷氏药学大 全(Remington′s Pharmaceutical Sciences)、Mack出版公司(Mack Publishing Co.)(A.R. Gennaro编，1985)中。所述材料在所采用的剂量和浓度下对受者来说无毒，且包括诸如 磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐和其它有机酸盐的缓冲剂、诸如抗坏血酸的抗氧化剂、诸如 聚精氨酸的低分子量(小于约10个残基)肽、诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白的蛋 白质、诸如聚乙烯吡咯烷酮的亲水性聚合物、诸如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸 的氨基酸、单糖、双糖和包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精的其它碳水化 合物、诸如EDTA的螯合剂、诸如甘露糖醇或山梨糖醇的糖醇、诸如钠的平衡离子和/或 诸如Tween、Pluronics或聚乙二醇的非离子性表面活性剂。

欲用于治疗性投药的本发明的盐的剂量调配物须无菌。无菌性易于通过经诸如0.2 微米膜的无菌膜过滤或通过其它传统方法来完成。调配物一般可以冻干形式或水溶液形 式存储。本发明的制剂的pH值一般介于3与11之间、更优选为5到9且最优选为7到 8。应了解使用某些前述赋形剂、载剂或稳定剂可导致形成环状多肽盐。虽然投药的优选 路线是通过注射，但也预期其它的投药方法，诸如静脉内(快速注射和/或输注)、皮下、 肌肉内、结肠、直肠、经鼻或腹膜内，采用多种剂型，诸如栓剂、植入式丸粒或小圆柱 体、气溶胶、口服剂型调配物(诸如片剂、胶囊和锭剂)和诸如软膏、滴剂和真皮贴片 的局部调配物。理想的是将本发明的灭菌剂并入诸如植入物的定型物品中，所述植入物 可采用惰性材料，诸如生物可降解聚合物或例如硅橡胶、聚硅氧橡胶的合成聚硅氧或其 它市售聚合物。

本发明的盐也可以诸如单层小微脂粒、单层大微脂粒或多层微脂粒的脂质体传递系 统的形式投药。脂质体可由多种脂质形成，诸如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱。

本发明的盐也可通过使用盐分子偶合的抗体、抗体片段、生长因子、激素或其它靶 部分来传递。本发明的盐也可与作为可靶向药物载剂的合适聚合物偶合。所述聚合物可 包括经软脂酰基残基取代的聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺酚、 聚羟基乙基天冬酰胺酚或聚氧化乙烯-聚赖氨酸。此外，本发明的盐可偶合到一类用于达 成药物的控制型释放的生物可降解聚合物，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸 的共聚物、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸 酯和水凝胶的交联或两性嵌段共聚物。聚合物和半渗透性聚合物基质可形成定型物品， 诸如瓣膜、血管支架、管道、假体等等。

B.定量给药

如可接受的医药实践所要求，一般将约0.5到500mg的本发明的盐或盐混合物与生 理学上可接受的媒剂、载剂、赋形剂、粘合剂、防腐剂、稳定剂、染料、香料等混合。 所述组合物中的活性成份的量为如此以便获得在指示范围内合适的剂量。

预期典型剂量介于约0.001mg/kg到约1000mg/kg的范围内，优选为约0.01mg/kg 到约100mg/kg，且更优选为约0.10mg/kg到约20mg/kg。本发明的化合物可每日投与一 或多次，且其它给药方案也可适用。

IV.方法

A.预防和治疗以不良血栓形成为特征的疾病病症

本发明的盐可用于预防或治疗哺乳动物中以不良血栓形成为特征的病症，其是通过 向哺乳动物投与治疗有效量的式I化合物的盐、式I化合物的顺丁烯二酸盐、式II的盐 或具有结晶多晶型形态的式II的盐进行。所述盐可单独使用，或与医药学上可接受的赋 形剂结合使用以防止以不良血栓形成为特征的病症发作。经由减少医药治疗和其相关的 精神和物理费用，以及由避免对患者的长期治疗来直接节省金钱，预防性治疗可大体上 有益于具有疾病风险的患者。对于病症未足够早地检测出以防止发作的患者来说，本发 明的盐可单独使用或与医药学上可接受的赋形剂结合使用以治疗病症。

本发明的优选盐的特征在于其抑制血栓形成的能力，所述盐对凝血参数、血小板和 血小板功能的传统测量具有可接受的效应且对与其使用相关联的出血并发症具有可接受 水平，同时展现合适稳定性。以不良血栓形成为特征的病症可包括涉及动脉和静脉脉管 结构的那些病症。

关于冠状动脉脉管结构，异常血栓形成的特征在于已确认的动脉粥样硬化斑的破裂， 其为急性心肌梗塞和不稳定性心绞痛的主要原因，且其特征也在于因溶血栓疗法或经皮 经管腔冠脉血管成形术(PTCA)造成的闭塞性冠脉血栓形成。

关于静脉脉管结构，异常血栓形成的特征在于在下肢或腹部区域经受大手术的患者 中所观测到的病症，所述患者常遭受在静脉脉管结构中导致至受影响肢体的血液流量减 少且为肺栓塞诱因的血栓形成。异常血栓形成的另一特征在于散播性血管内凝血症，其 通常在败血性休克(某些病毒感染)和癌症(一种其中快速消耗凝血因子和全身性凝血 的病症，所述全身性凝血导致在整个微脉管结构中出现形成危及生命的血栓，从而导致 广泛的器官衰竭)期间出现于两种血管系统中。

咸信本发明的盐(如本文所揭示进行选择和使用)适用于预防或治疗以不良血栓形 成为特征的病症，诸如(a)治疗任何血栓介导性急性冠脉综合症，包括心肌梗塞、 不稳定性心绞痛、顽固性心绞痛、溶血栓疗法后或冠脉血管成形术后出现的闭塞性冠脉 血栓，(b)治疗任何血栓介导性脑血管综合症，包括栓塞性中风、血栓性中风或短暂性 缺血性发作，(c)治疗任何在静脉系统中发生的血栓性综合症，包括深静脉血栓症或自 发出现或在恶性肿瘤、手术或外伤的情况下出现的肺栓塞，(d)治疗任何凝血症，包括 散播性血管内凝血(包括败血性休克或其它感染、手术、妊娠、外伤或恶性肿瘤的情况 且不管其与多器官衰竭是否相关)、血栓性血小板缺乏紫斑症、血栓闭塞性脉管炎或与肝 素诱导性血小板减少症相关联的血栓性疾病，(e)治疗与体外循环(例如肾透析、心肺 旁路或其它氧处理程序、血浆去除法)相关联的血栓性并发症，(f)治疗与使用仪器(例 如心脏或其它血管内的导管插入术、主动脉内球囊泵、冠脉血管支架或心瓣)相关联的 血栓性并发症，和(g)与假体装置的装配相关联的那些病症。

因此，一种用于治疗哺乳动物中以不良血栓形成为特征的病症的方法包含向哺乳动 物投与治疗有效量的本发明的盐。预期使用本发明的盐可治疗的疾病状态包括(但不限 于)急性冠脉综合症、心肌梗塞、不稳定性心绞痛、顽固性心绞痛、溶血栓疗法后或 冠脉血管成形术后出现的闭塞性冠脉血栓、血栓介导性脑血管综合症、栓塞性中风、血 栓性中风、短暂性缺血性发作、静脉血栓症、深静脉血栓症、肺栓塞、凝血症、散播性 血管内凝血、血栓性血小板缺乏紫斑症、血栓闭塞性脉管炎、与肝素诱导性血小板减少 症相关联的血栓性疾病、与体外循环相关联的血栓性并发症、与使用仪器相关联的血栓 性并发症、与假体装置的装配相关联的血栓性并发症、由溶血栓疗法或经皮经管腔冠脉 血管成形术造成的闭塞性冠脉血栓形成、在静脉脉管结构中的血栓形成、散播性血管内 凝血症、一种其中快速消耗凝血因子和全身性凝血的病症(所述全身性凝血导致在整个 微脉管结构中出现形成危及生命的血栓，从而导致广泛的器官衰竭)、出血性中风、肾透 析、血液氧处理和心脏导管插入术。

无论何时需要抑制血液凝聚以防止所存储全血凝聚且防止其它用于测试或存储的生 物学样本凝聚，也可使用式I化合物的顺丁烯二酸盐或式II的盐。因此，本发明的凝聚 抑制剂可添加到所存储的全血和任何含有或怀疑含有血浆凝聚因子的介质中或与其接 触，且其中需要抑制血液凝聚，例如当哺乳动物的血液与选自由人造血管、血管支架、 矫形外科假器、心脏假器和体外循环系统组成的群组的材料接触时。

除用于人类治疗以外，也预期这些盐用于伴侣动物、外来动物和农场动物(包括哺 乳动物、啮齿动物和其类似动物)的兽医治疗。更优选动物包括马、狗和猫。

B.投药

通常将治疗性液体调配物置于具有无菌接口的容器中，例如具有通过皮下注射针可 刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶。

治疗有效剂量可由活体外或活体内方法来确定。对于本发明的每一特定盐来说，可 进行个别测定以确定所需的最佳剂量。治疗有效剂量的范围受投药途径、治疗目的和患 者病症的影响。对于通过皮下注射针的注射来说，可假定将剂量传递到体液中。对于其 它投药途径来说，每一化合物的吸收效率必须由药理学中熟知的方法来个别确定。因此， 当需要获得最佳治疗效应时，治疗师必需滴定剂量且改变投药途径。有效剂量水平的测 定(也就是达到所要结果必需的剂量水平)可易于由所属领域的技术人员确定。盐的应 用一般由较低浓度水平开始，增加剂量水平直到获得所要效应。

可并入片剂、胶囊、锭剂等等的典型佐剂为诸如阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶的粘合 剂和诸如微晶纤维素的赋形剂、诸如玉米淀粉或褐藻酸的崩解剂、诸如硬脂酸镁的润滑 剂、诸如蔗糖或乳糖的甜味剂或调味剂。当剂型为胶囊时，其除以上材料之外也可含有 诸如水、盐水或脂肪油的液体载剂。可使用多种类型的其它材料作为涂覆剂或剂量单位 的物理形态的改性剂。用于注射的无菌组合物可根据传统医药实践来调配。举例来说， 可能需要将活性化合物溶解或悬浮于诸如油或诸如油酸乙酯的合成脂肪媒剂的媒剂中， 或溶解或悬浮于脂质体中。可根据可接受的医药实践并入缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂等 等。

C.组合疗法

本发明的盐也可与其它治疗剂或诊断剂组合使用。在某些优选实施例中，本发明的 盐可与其它化合物一起共投与，所述其它化合物一般指定用于根据通常接受的医疗实践 的病症，所述其他化合物诸如抗凝剂、溶血栓剂或其它抗血栓形成剂，包括血小板凝集 抑制剂、组织血纤维蛋白溶酶原活化剂、尿激酶、尿激酶原、链球菌激酶、肝素、阿司 匹灵(aspirin)或杀鼠灵。本发明的盐可以协同方式起作用以防止成功溶血栓疗法后的 再闭塞和/或减少再灌注的时间。所述盐也使得可使用减少剂量的溶血栓剂，且因此最小 化潜在的出血性副作用。本发明的盐也可在活体内(通常在哺乳动物中，诸如灵长类、 人类、羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠)或活体外使用。

D.化合物制备

1.式I化合物的顺丁烯二酸盐

式I化合物可转化为各种无机和有机酸的盐，其包括(但不限于)盐酸盐、乳酸盐、 顺丁烯二酸盐、苯氧基乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、己二酸盐、抗坏血酸盐、樟脑酸盐、 葡萄糖酸盐、磷酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、反丁烯二酸盐、乙醇酸盐、萘 -1，5-二磺酸盐、龙胆酸盐和苯磺酸盐。所属领域的技术人员可意识到其它可用于制备盐 的酸，所述盐包含用于本发明的式I化合物。也预期本发明的盐可易于转化为本发明的 其他盐。

为评估所述盐的热稳定性和水解稳定性，进行所属领域的技术人员已知的测试。所 述测试于下文实例4中更全面论述。

可将多种方法用于制备上述盐，且为所属领域的技术人员已知。举例来说，式I化 合物与一或多摩尔当量的所要酸在盐不溶于其中的溶剂或溶剂混合物中、或在例如水的 溶剂中反应，之后通过蒸发、蒸馏或冷冻干燥移除溶剂。或者，可使式I化合物通过离 子交换树脂以形成所要的盐或可使用相同的通用方法将产品的一种盐形态转化为另一种 盐形态。

根据下文所列程序制备式I化合物。为其优良结晶性、热稳定性和水解稳定性和高 纯度选择式I化合物的顺丁烯二酸盐。

2.式I

可根据多种不同方法的任一者制备克级(＜1kg)或千克级(＞1kg)的式I化合物。 克级方法于下文实例2中列出。另一种克级方法于美国专利第6,844,367B1号(参见实例 266)中列出，其以引用的方式并入本文中。

或者，可使用实例2中所列的程序制备千克级的式I化合物。式I的二甲基脒的形成 包括通过去质子化胺对氰基进行亲核性攻击，其中所述去质子化胺由二级胺和烷基锂形 成。如本文所用的术语“烷基”是指具有1到8个碳原子的烃基。所属领域的技术人员 可意识到，所述去质子化胺可经由其它方法形成，且式I的脒官能团的形成可通过多种 其它方法来制备。

如上所述用于本发明方法的有用溶剂为非极性、非质子性溶剂，诸如四氢呋喃 (THF)、乙醚、二甲氧基甲烷、二噁烷、己烷、甲基叔丁基醚、庚烷和环己烷。此外， 去质子化胺的形成可在10℃以下的温度下进行。形成式I化合物的胺的亲核性加成反应 也可在10℃以下的温度下进行。所属领域的技术人员可意识到，可使用多种其它溶剂、 试剂和反应温度实践本发明的方法。

使用本发明的方法可以大于50％的产率制备式I化合物。在某些情况下，可以大于 65％的产率制备式I化合物。在其它情况下，可以大于75％的产率制备式I化合物。

此外，当用于制备克级式I化合物的本发明方法类似于用于千克级的程序时，反应 量级增加超过3400％。此外，在若干步骤中，使用减少量的过量试剂获得增加的产量。 所属领域的技术人员可意识到，经由其它化学方法可制备克级和千克级的式I化合物。

V.实例

除非另外规定，否则整个本说明书所用的缩写具有以下含义：

A％＝总百分比面积

aq.＝水溶液

cm＝厘米

d＝双重峰

DSC＝差示扫描热量测定

EDTA＝乙二胺四乙酸

eq.＝当量

EtOH＝乙醇

g＝克

HPLC＝高效液相色谱法

hr＝小时

Hz＝赫兹

IR＝红外线

J＝偶合常数

kg＝千克

kV＝千伏特

L＝升

LOD＝检测极限

M＝摩尔浓度

m＝多重峰

mA＝毫安

Me＝甲基

MeO＝甲氧基

MeOH＝甲醇

mg＝毫克

min.＝分钟

mL＝毫升

mm＝毫米

MTBE＝甲基叔丁基醚

N＝当量浓度

nM＝纳摩尔浓度

NMR＝核磁共振

s＝单重峰

TDS＝总溶解固体

TGA＝热解重量分析

THF＝四氢呋喃

μM＝微摩尔

实例1：式II的结晶多晶型盐的制备

克级制备

在装配有冷凝器的三颈1500mL圆底烧瓶中装填于式I的游离碱化合物(25g；1当 量)，且伴随搅拌添加9∶1的EtOH/水(500mL)。将所得浆料加热到70℃。逐滴添加顺 丁烯二酸(12.77g；2当量)作为溶液(100mL的9∶1的EtOH/水)且在已添加50mL 后，溶液显著变得更澄清。在顺丁烯二酸溶液完全添加后，使温度在80℃下保持5分钟。 使容器缓慢冷却到45℃，且接着添加400mL的MTBE。将溶液搅拌12小时。将所得沉 淀物过滤，且在真空下干燥。式II的盐以45％的产率(14.2g)回收。

千克级制备

将式I化合物(24.6Kg)装填于760L GLMS反应器(反应器A)中。添加顺丁烯 二酸(12.7Kg，2.0当量)、乙醇(445Kg，18.1份)和高纯水(140Kg，5.7份)。将反 应混合物调节到22℃(19-25℃)且在所述温度下搅拌约1小时，接着经过精细过滤器传 输到经调整的780L哈斯特合金(Hastelloy)反应器(反应器B)中。将反应器A的泵 和管线经由精细过滤器用另外的乙醇(约45Kg)正向冲洗到反应器B中。将滤液在真 空下用最大温度为45℃的暖乙二醇浴(加热反应器夹套)浓缩，直到残留约140L(5.7 体积份)。从反应器B的内容物取样用于运行中的NMR中，其显示乙醇：式II的摩尔比 为26。将高纯水(49Kg，2.0份)装填于反应器B且继续在真空下浓缩直到达到约140L (5.7体积份)的罐体积。运行中的NMR指示乙醇：式II的盐的摩尔比为14。再次装填于 高纯水(49Kg，2.0份)且继续在真空下浓缩以获得约140L的罐体积。运行中的NMR 显示乙醇：式II的盐的摩尔比为5。将反应器B内容物的温度调节到22℃(19到25℃)， 且肉眼确认形成浆料。将反应混合物在22℃(19到25℃)下搅拌约2小时，且接着在 安装有F-53滤布的30″离心机上过滤。将反应器B的泵和管线以两份高纯水(每份约30 Kg)经由精细过滤器正向冲洗到30″离心机中。从滤饼取样用于运行中的HPLC，其显示 产物纯度为99.1A％，最大杂质为0.26A％，且因此无需再结晶。在真空下用最大温度为 40℃的暖乙二醇浴(加热反应器夹套)干燥滤饼(33.1Kg)。在约30.5小时之后，运行 中的LOD分析指示溶剂含量为0％。排出干燥产物(26.4Kg)，且存储于2-8℃下。最终 产物的产率为85％，稍微高于预期值(预期为50-80％)。

使用实例4中所述的技术来表征式II的盐。式II的盐的X射线衍射图案显示于图 1A中，且其特征在于以下近似峰位：4.9、9.7、11.8、13.8、14.1、15.2、17.6、18.5、19.9、 20.8、21.6、22.7、24.1、25.0、26.3、26.8度2θ。使用差示扫描热量测定(DSC，参见图 2A中的图案)测量熔点在197与201℃之间。此外，经由热解重量分析(TGA，参见图 2B中的图案)测量式II的盐在100℃下的重量损失为0.62％。式II的盐的吸水作用可逆 且显示0.1与3％之间的吸水率(图3)。通过如HPLC所测量的水解脒含量的存在测量式 II的盐的纯度，且发现其纯度大于99％。

¹H NMR(DMSO-d₆)：δ3.0(s，3H)、3.2(s，3H)、3.82(s，3H)、7.2(d，1H，J ＝9.0Hz)、7.42(s，1H)、7.68(d，1H，J＝8.0Hz)、7.95-8.15(m，2H)、8.12(m)、 8.18(m，1H)、8.42(s，1H)、9.0(s，1H)、11.0(s，1H)、11.2(s，1H)；IR(KBr， cm^-1)：3300，1685，1600，1515，1380，1270，1200，1100，1050，880，800，710。

实例2：式I化合物的制备

克级制备

在THF(4.67kg，10.3份)中制备式F化合物的浆料(455g，1.0当量)，且调节到 小于10℃。如下制备二甲基酰胺锂：将己基锂(2.3N/己烷，2.45L，5.5当量)添加到 维持在小于10℃的二甲基胺溶液(2N/THF，2.8L，5.5当量)中。将二甲基酰胺锂溶液 装填于含有式F化合物的浆料中，维持小于10℃的罐温度。通过运行中的HPLC监控反 应进程，所述HPLC确认式F的量小于1.0A％。在去离子水(6.6kg，14.51份)中制备 NaHCO₃(490g，1.1份，5.7当量)和Na₂CO₃(490g，1.1份，4.5当量)的缓冲溶液， 且将上述反应混合物传输到所述水溶液，维持小于5℃。将所沉淀出的产物和所得浆料 调节到20℃历经12小时的时期。过滤固体，且将所得湿滤饼以3.5kg(7.7份)去离子 水洗涤。使用粗烧结玻璃台式过滤器滤出固体，且以冷(0-5℃)无水乙醇(628g，1.4 份)正向冲洗。将产物在30-35℃下干燥。获得干燥产物458g(73％产率)。

千克级制备

在780L哈斯特合金反应器(反应器A)中制备式F化合物(31.5Kg，1.0当量)于 THF(251Kg，8.0份)中的浆料，且调节到0℃(-3到3℃)。将THF中的2M二甲胺 (161.0Kg，5.0当量)和THF(63Kg，2份)装填于1900L GLMS反应器(反应器B) 中，且伴随最大搅拌调节到0℃(-3到3℃)。将己基锂(2.3M，97.2Kg，4.5当量)缓 慢装填于反应器B，同时维持10℃的最高温度。将泵和管线以THF(3.2Kg)正向冲洗 到反应器B。将反应器B的内容物调节到0℃(-3到3℃)，接着传输到反应器A，同时 保持反应器A的温度≤10℃。将反应器B的泵和管线以THF(31.4Kg，，1.0份)正向冲 洗。将反应器A的内容物调节到0℃(-3到3℃)，且在这个温度下搅拌直到如HPLC所 证实反应完全(1-2小时)。在搅拌约1小时后，运行中的HPLC分析指示残留0A％的起 始物质(进程准则：最大1A％)。将反应器A的内容物调节到-5℃(-8到-3℃)。用水对 反应器B进行运行中的清洁。将两种先前制备的水溶液[水(236Kg，7.5份)中的NaHCO₃(35.0Kg，1.1份)和水(236Kg，7.5份)中的Na₂CO₃(35.0Kg，1.1份)]装填于反应 器B，且调节到-3℃(0到6℃)。将反应器A的内容物经隔热管线传输到反应器B，维 持反应器B的温度在-8℃到最大5℃。将反应器A的泵和管线以冷[-5℃(-8到-3℃)]THF (31.4Kg，1.0份)正向冲洗。将反应器B的内容物调节到22℃(19-25℃)，且搅拌约3 小时。视觉确认浆料的形成，且将反应器B的内容物经安装有F-16滤布的30″离心机过 滤。将反应器B的泵和管线用饮用水(63Kg，2份)正向冲洗到安装有F-16滤布的30″ 离心机上。将湿滤饼(66.5Kg)传输回反应器B且使其在22℃(19-25℃)下经受饮用 水(1005Kg，32份)的浆料洗涤历时约1小时。将产物在30″离心机上过滤(在运行中 的清洁且安装F-53滤布之后)，且将反应器B的管线和泵用饮用水(63Kg，2份)正向 冲洗。从冲洗的水取样以供TDS测试，发现水冲洗为0.46％。将反应器B的泵、管线和 湿滤饼用冷[0℃(-3到3℃)]乙醇(44Kg，1.39份)进一步冲洗。在真空下用最大温度 为35℃的水浴(加热反应器夹套)干燥湿滤饼。在干燥约24小时之后运行中的LOD为 0％，且将76.7％的产率排出产物(24.8Kg)。HPLC显示98％的纯度，而脱氯杂质为1.14％。

实例3：式F化合物的制备

步骤1.2-硝基-N-(5-氯-吡啶-2-基)-5-甲氧基-苯甲酰胺(C)的合成

将5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(A)(25.0Kg，1.0当量)、2-氨基-5-氯吡啶(B)(16.3Kg， 1.0当量)和乙腈(87.5Kg，3.5份)装填于380L GLMS反应器中。将反应混合物调节 到22℃(19-25℃)且添加无水吡啶(30.0Kg，3.0当量)。将泵和管线用乙腈(22.5Kg， 0.9份)正向冲洗，且将反应器内容物调节到19-22℃的温度。将磷酰氯(23.3Kg，1.20 当量)经由计量泵装填于反应器的内容物中，同时维持25℃(22-28℃)的温度。将计量 泵和管线用乙腈(12.5Kg，0.5份)正向冲洗，同时保持25℃(22-28℃)的温度。在添 加约1/3的POCl₃之后，反应混合物通常从浆料转变为透明溶液。在添加结束时，其变 得浑浊。在完全添加之后，将反应混合物于25℃(22-28℃)下搅拌约1小时，此时HPLC 分析证实反应完成。将溶液冷却到15℃(12-18℃)，且缓慢装填于饮用水(156.3Kg， 6.25份)，同时保持反应温度在12与30℃之间。接着将反应混合物调节到22℃(19-25 ℃)，且搅拌约5小时直到放热终止。视觉确认浆料的形成，且将反应器的内容物经安装 有F-19滤布的压力吸滤器过滤。将反应器、泵和管线用两份饮用水(每次62.5Kg，2.5 份)正向冲洗到压力吸滤器上。滤液具有7的pH值。在真空下用最大温度为50℃的水 浴(加热反应器夹套)干燥产物(41.8Kg)。在约12小时之后，运行中的LOD分析指 示溶剂浓度为0.72％。以88.2％的产率和由HPLC所测定的99.1％的纯度排出干燥产物(C) (34.4Kg)。

步骤2.2-氨基-N-(5-氯-吡啶-2-基)-5-甲氧基-苯甲酰胺(D)的合成

向780L哈斯特合金反应器中装填于化合物C(33Kg，1.0当量)、5％铂碳(经硫化， 0.33Kg，0.010份)和二氯甲烷(578Kg，17.5份)。开始搅拌且将反应器内容物调节到 22℃(19到25℃)。将反应器用约30psi氢加压且将反应混合物逐渐加热到28℃(25-31 ℃)。在约30psi下于28℃(25到31℃，最高31℃)下进行反应器内容物的氢化作用直 到由HPLC测定反应完成。在16.5小时之后，确认起始物质(0.472A％)消失后认为反 应完成。使反应器的内容物经由在8″斯巴克(sparkler)过滤器中制备的经调节硅藻土衬 垫(经20-55Kg二氯甲烷调节的0.2-0.5Kg硅藻土)循环以移除铂催化剂。将反应器和 硅藻土床用两份二氯甲烷(每次83Kg，2.5份)正向冲洗。将滤液传输到570L GLMS 反应器中，且在大气压下浓缩到约132L(4体积份)。装填于乙醇(69.Kg，2.1份)且 在大气压力下继续浓缩到约99L(3体积份)。运行中的NMR指示二氯甲烷含量为39％。 再次装填于乙醇(69Kg，2.1份)且再次继续浓缩到约99L(3体积份)。运行中的NMR 指示二氯甲烷含量为5％。接着将反应混合物调节到3℃(0到6℃)，搅拌约1小时，且 使所得浆料在安装有F-19滤布的夹套压力吸滤器上过滤。将反应器、泵和管线用冷[3℃ (0到6℃)]乙醇(26Kg，0.8份)正向冲洗。在真空下于40-50℃下用最大温度为50℃ 的水浴(加热反应器夹套)干燥湿滤饼(36.6Kg)。12.5小时之后LOD分析指示溶剂含 量为0.1％。以89.5％的产率排出干燥产物(D)(26.4Kg)。HPLC显示98.4A％的纯度， 而脱氯杂质为0.083％。

步骤3.N-(5-氯-吡啶-2-基)-2-(4-氰基-苯甲酰基-氨基)-5-甲氧基-苯甲酰胺盐酸 盐(F)的合成

向780L哈斯特合金反应器中装填于4-氰基氯化苯甲酰(E)(17.2Kg，1.1当量) 和THF(92Kg，3.5份)。在22℃(19到25℃)下搅拌反应器内容物直到所有固体溶解。 将所得溶液传输到下方接收器且将反应器用THF(26Kg，1份)正向冲洗。将化合物D (26.4Kg，1当量)、THF(396Kg，15份)和吡啶(2.90Kg，0.4当量)装填于清洁反 应器中。将泵和管线用THF(34Kg，1.3份)正向冲洗。经由计量泵将4-氰基氯化苯甲 酰/THF溶液装填于反应器中，保持温度为≤30℃且用THF(约10Kg)正向冲洗。将所 得黄色浆料在22℃(19到25℃)下搅拌约2小时。2小时后所进行的运行中的HPLC显 示式D化合物的含量为0％，指示反应完成。将浆料在安装有F-19滤布的压力吸滤器上 过滤。将反应器、泵、管线和湿滤饼用三份乙醇(每份约15Kg)冲洗。排出湿滤饼(65.4 Kg)，且在22℃(19-25℃)下历时约1小时传输回用于以乙醇(317Kg，12份)洗涤浆 料的反应器中。将浆料在压力吸滤器上过滤，且将反应器、泵、管线和湿滤饼用两份乙 醇(每份约15Kg)和两份THF(每份约15Kg)冲洗。在真空下用最大温度为40℃的 暖乙二醇浴(加热反应器夹套)干燥湿滤饼。在干燥14.5小时之后，LOD为0.75％。将 经干燥物质研磨(筛网0.125″)以给出31.8Kg产物，将所述产物在真空下再干燥10.5 小时。干燥之后的LOD为1.8％，且以74.8％的产率(预期60-90％)排出产物(31.5Kg)。 HPLC显示100％的纯度。

实例4：盐筛检

初级筛检

向3mL 10％(含水)THF混合物中的20mg游离碱中添加1mL乙醇中的1.1当量 酸。将混合物震荡2小时，继而添加2mL叔丁基甲基醚以引起沉淀且再震荡2小时。接 着将样本过滤、干燥且接着分析以判定其纯度、结晶性和稳定性。结果于下表1中呈现， 且列举所测试的酸。

表1

  酸   盐   盐酸   +++   乳酸   +++   顺丁烯二酸   +++   苯氧乙酸   +++   丙酸   +++   丁二酸   +++   己二酸   ++   抗坏血酸   ++   樟脑酸   ++   葡萄糖酸   ++   磷酸   ++   酒石酸   ++   柠檬酸   ++   甲磺酸   ++   反丁烯二酸   +   乙醇酸   +   萘-1，5-二磺酸   +   龙胆酸   +   苯磺酸   +   樟脑磺酸   -   α-羟基己酸   -   苯甲酸   -   葡糖醛酸   -   酮基戊二酸   -   丙二酸   -   扁桃酸   -   焦谷氨酸   -   硫酸   -   反式肉桂酸   -

+++，结晶形态，无相变化，良好纯度；++，无定形，某些相变化，中等良好纯度； +，很少或无结晶性，相变化为较少结晶形态，低纯度；-，无沉淀

二级筛检

使用下述方法对多种盐形态进行二级评估，结果概述于表5和图1A、1B、2A、2B 和3中。

差示扫描热量测定(DSC)

在装配有50个位置自动取样器的TA仪器Q1000上收集DSC数据。能量和温度校 正标准为铟。在25与350℃之间用10℃/min的速率加热样本。在样本上维持30mL/min 的氮气净化。除非另外规定，否则使用介于1和3mg之间的样本，且将所有样本均在与 外界隔绝型密封铝盘中卷曲。

热解重量分析(TGA)

在用镍/铝合金校正且用10℃/分钟的扫描速率执行的TA仪器Q500TGA上收集TGA 数据。在样本上维持60mL/min的氮气净化。一般将10-20mg的样本负载于经预称皮重 的铂坩埚上。

XRPD(X射线粉末衍射)

在使用CuKα辐射(40kV，40mA)、θ-θ测角器、自动发散且接受狭缝、石墨二次 单色器和闪烁计数器的Siemens D5000衍射仪上收集X射线粉末衍射图案。使用经过鉴 定的刚玉标准(NIST 1976)检查仪器的性能。

将在周围条件下执行的样本使用粉末制备为平板样本。将近似35mg的样本轻缓挤 进切割为经抛光的零背景(510)硅晶片的空腔中。分析期间样本在其自身平面内旋转。 对下表2中的方法给出详细的数据收集：

表2

使用Cu Kα₁()报道衍射数据，在使用EVA(评估软件)除去Kα₂组 份之后，通过使用WIN-INDEX的ITO方法和使用WIN-METRIC改进的原始晶格常数检 索粉末图案。

单一晶体XRD(X射线衍射)

在装配有Oxford Cryosystems Cryostream冷却装置的Bruker AXS 1K SMART CCD衍 射器上收集数据。使用SHELXS或SHELXD程序解释结构，且用SHELXL程序改进为 Bruker AXS SHELXTL套组的部分。除非另外规定，否则使连接到碳的氢原子经几何学 放置且使其以沿曲线运动的各向同性位移参数进行改进。将连接到杂原子的氢原子安置 于差异傅立叶合成中，且使其以各向同性位移参数进行自由改进。

重量分析蒸气吸附(GVS)研究

在执行CFRSorp软件的Hiden IGASorp吸湿分析器上执行所有样本。样本大小一般 为10mg。如下文概述(2次给定1个全循环的扫描)进行吸湿解吸等温线。所有样本在 典型室内湿度和温度(40％RH，25℃)下负载/卸载。所有样本均通过XRPD后GVS分 析来分析。在25℃下以10％RH之间隔在0-90％RH范围内进行标准等温线。式II的盐显 示优良湿气稳定性。

溶解度

这是通过在0.25mL溶剂(水)中悬浮足够的盐来测量，以给出盐的亲本自由形态 的≥10mg/mL的最大最终浓度。将悬浮液在25℃下平衡24小时，继而检查pH值且经 由玻璃纤维C 96孔板过滤。接着将滤液稀释101倍。参考以近似0.1mg/mL溶解于DMSO 中的标准，通过HPLC进行定量。注入不同体积的标准测试物、经稀释测试物和未经稀 释测试物。通过对在与标准注射中峰最大值相同的滞留时间时发现的峰面积进行积分来 计算溶解度。若在滤板中有足够的固体，则通常检查XRPD的相变化、水合物形成、无 定形化、结晶等。

乙酸盐提供≥10mg/mL的溶解度，而顺丁烯二酸盐提供约2.05mg/mL到约2.27 mg/mL的溶解度。

pKa测定

这是在具有D-PAS附着构件的Sirius GlpKa仪器上进行。通过水溶液中的UV且通 过在25℃下甲醇和水混合物中的电位计来进行测量。滴定介质为经0.15M KCl调节的离 子强度。经由Yasuda-Shedlovsky外推法将可见于甲醇和水混合物的值修正为0％共溶剂。 使用Refinement Pro软件1.0版改进所述数据。使用ACD pKa预测软件8.08版预测pKa 值。式II的盐的数据呈现于下表3中。

表3

LogP测定

这是通过Sirius GlpKa仪器上的电位滴定使用三种比率的辛醇：ISA水以产生Log P、 Log P_离子和Log D值。使用Refinement Pro软件1.0版改进所述数据。使用ACD 8.08版 和Syracuse KNOWWIN1.67版软件预测LogP。顺丁烯二酸盐的数据显示于下表4中。

表4

  LogP   ACD预测LogP   2.93   Syracuse预测LogP   3.86   测量LogP   3.09   测量LogP_离子  -0.08   测量LogD   0.09

卡尔-费休(Karl Fisher)水测定

使用Hydranal Coulomat AG试剂和氩气净化在Mettler Toledo DL39电量计上测量水 含量。样本作为在铂TGA盘上称出的固体引入容器中，所述铂TGA盘连接到subaseal 以避免水进入。对于每次滴定均使用近似10mg的样本且每次分析均进行两次。

稳定性

作为稳定性的测量，在使样本经受75％室内湿度的57℃温度之后通过HPLC(Agilent  HP1100)(滞留时间为34分钟)测量水解脒的含量。样本溶剂为甲醇，且采用0.1％三氟 乙酸的移动相改性剂。除丙酸盐的数据在第0、3和8天时收集以外，均在第3、6和10 天之后收集数据。结果在表5中呈现为酸水解产物的百分比，表现为主峰的百分比。在 计算中所有其它杂质峰均忽略不计。

表5

式II的盐的晶体数据

所有实验均在装配有Oxford Cryosystems Cryostream冷却装置的Bruker-Nonius  Kappa CCD衍射器上进行。通常由SIR-97或SHELXS-97来解释结构，且由SHELXL-97 来改进结构。除非另外规定，否则将氢原子经几何学放置，且使其以各向同性位移参数 进行改进。下表(表6和表7)提供式II的盐的晶体数据和结构改进。

表6

表7

尽管为达成清楚理解的目的，已通过说明和实例相当详细地描述上述发明，但所属 领域的技术人员应了解在随附的权利要求书的范畴内可实践某些改变和修改。此外，本 文所提供的每一参考案均以全文引用的方式并入，其引用程度如同每一参考案个别以引 用的方式并入一般。