用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒及其方法与运用

摘要

本发明涉及医学领域，特别涉及用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒及其方法与运用，所述ELISA试剂盒包括抗体捕获剂、酶标二抗、底物；本试剂盒能特异性的检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量，其成本低，敏感性佳；运用本试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量，并与正常人的过氧化物还原酶Ⅳ的抗体水平进行比较，判断过氧化物还原酶Ⅳ抗体是否为阳性。

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验领域，特别涉及用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的间接ELISA试剂盒及其方法与运用。

背景技术

类风湿关节炎(RA) 是一种以滑膜炎为基本病理改变, 以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫病，大多病情呈进行性，最终导致关节纤维性或骨性强直而严重致残，严重影响患者生活质量。未经正确治疗的类风湿关节炎可迁延不愈, 甚至导致关节畸形。作为自身免疫性疾病，致病抗原驱动的自身反应性CD4⁺T细胞活化是类风湿关节炎发病的核心途径。

对于类风湿关节炎的诊断，现在主流仍然沿用1987 年美国风湿病学学会RA 的分类标准，其主要靠临床表现并排除其他关节炎从而对RA进行判断。另外，X线改变和类风湿因子也是判断RA的常用标准。但上述方法操作繁琐且特异性不高，且不适用于早期诊断。

众所周知，RA的病理改变从滑膜组织开始逐渐向软骨到骨发展。RA在早期若未得到有效治疗，将会引起关节功能障碍甚至劳动力丧失，并导致全身多脏器受累进而危及生命。如果能尽早对RA病情做出诊断，及早治疗，从而阻止或延缓其发展，将能有效的提高RA的治疗效果并减少其并发症的发生。而针对RA早期有高度敏感性和特异性的检测指标是实现RA早期诊断和治疗的前提。

早期诊断指标中，IL-8、IL-6水平在巨细胞病毒DNA阳性的类风湿关节炎患者中升高和CMV基因组出现之间存在联系，但特异性和敏感性低。在RA自身抗体作为检测指标方面：类风湿因子（RF）存在灵敏度低的缺点；在早期RF阴性的类风湿关节炎病人中可53.3% 的病人抗核周因子（APF）呈阳性，但APF抗原片的保存时间较短（仅为1～2周），检测稳定性低；Sa抗体在类风湿关节炎中阳性率为40%，特异性为98.9%，但类风湿关节炎早期仅约23%；过氧化物还原酶Ⅳ和类风湿关节炎的相关性研究尚未有人报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种试剂盒，该试剂盒能快速检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量，操作简单，成本低廉。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

1、用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒包括抗体捕获剂、酶标二抗和底物。

2、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒，所述抗体捕获剂为过氧化物还原酶Ⅳ作不小于5μg/mL的稀释。

3、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒，抗体捕获剂附于固相支持物上。

4、根据3所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒，所述固相支持物为酶标板或生物芯片。

5、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒，所述生物标本为血清、尿液、细胞、组织物或血浆。

6、根据5所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒，所述生物标本为血清，所述血清为不大于200倍体积稀释的血清稀释液。

7、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒，所述酶标二抗为辣根酶标记山羊抗人IgM作不大于4000倍稀释的稀释液。

8、根据1所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒，所述抗体捕获剂与酶标二抗的用量体积比为1:1。

 

本发明的目的之二在于提供上述试剂盒的用途，该用途能弥补过氧化物还原酶Ⅳ抗体检测领域的技术空白，并为类风湿关节炎及其它免疫性疾病提供了诊断思路，特别适用于生物标本的检测。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

9、1-8所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒在检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的应用。

10、根据9所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒的应用，所述ELISA试剂盒在制备检测类风湿关节炎试剂盒中的应用。

11、根据9所述的用于检测生物标本中的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒的应用，所述ELISA试剂盒检测待测血清与正常人血清的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量，当待测血清的OD_450nm值大于0.257为过氧化物还原酶Ⅳ抗体阳性，小于或等于0.257为过氧化物还原酶Ⅳ抗体阴性。

本发明的目的之三在于提供过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法，该方法敏感性高，操作简单。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

12、运用1-8任一项所述ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法，a、将生物标本与ELISA试剂盒中的抗体捕获剂接触并保温；b、将未结合的生物标本分离，得抗原-抗体复合物；c、在步骤b所得的抗原-抗体复合物加入ELISA试剂盒中的酶标二抗，得双抗复合物；d、检测结合于抗体捕获剂的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量。

13、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法，所述方法还包括将步骤d所得的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量与正常人过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量进行比较判断。

14、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法，步骤a中，将抗体捕获剂包被酶标板，将待测生物标本与抗体捕获剂接触，保温并用封闭液封闭；所述生物标本为不大于200倍体积稀释的血清稀释液，所述抗体捕获剂为过氧化物还原酶Ⅳ作小于5μg/ml的稀释液。

15、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法，步骤b中，将步骤a中保温并用封闭液封闭的酶标板洗涤将未结合的生物标本分离，得抗原-抗体复合物。

16、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法，步骤c中，在步骤b所得的抗原-抗体复合物加入ELISA试剂盒中的酶标二抗进行保温反应，得双抗夹心复合物；所述酶标二抗为辣根酶标记山羊抗人IgM作不大于4000倍稀释的稀释液。

17、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法，步骤d中，在步骤c所得的双抗复合物中加入底物避光显色后，加入终止液终止反应得显色样品液,通过测显色样品液的OD_450nm值检测结合于抗体捕获剂的过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量。  

18、根据12所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法，所述方法还包括阴性对照组和空白对照组，所述阴性对照组为源自于正常人的生物标本。

19、根据18所述的运用ELISA试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体含量的方法，所述待测生物标本的OD_450nm值大于阴性对照组样本的OD_450nm值平均值与其2倍标准方差之和时，判定为过氧化物还原酶Ⅳ抗体阳性，述待测生物标本的OD_450nm值小于或等于阴性对照组样本的OD_450nm值平均值与其2倍标准方差之和时为阴性。

本发明的有益效果在于：本试剂盒能特异性的检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量，其成本低，敏感性佳；运用本试剂盒检测过氧化物还原酶Ⅳ抗体的含量，并与正常人的过氧化物还原酶Ⅳ的抗体水平进行比较，可特异性教高的诊断类风湿关节炎，所以该试剂盒可以制备成类风湿关节炎诊断试剂盒，尤其适用于早期诊断。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为间接ELISA法检测初诊RA、复诊RA及正常人血清中过氧化物还原酶Ⅳ抗体的分析图。

图2为过氧化物还原酶Ⅳ间接法ELISA标准曲线,横坐标为小鼠抗人单克隆抗体稀释倍数，纵坐标为不同稀释倍数抗体所对应的OD₄₅₀值。

 

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明的优选实施例进行详细的描述。本实施例中所述抗原包被物人过氧化物还原酶Ⅳ的获得是通过构建原核表达质粒、转化表达菌并发酵培养，收集到大量的含有过氧化物还原酶Ⅳ的菌体沉淀，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗人IgM，作为间接法ELISA的二抗；进一步确定了人过氧化物还原酶Ⅳ包被浓度和检测血清的最佳浓度范围及阴阳性临界值的确定，制定了一种特异性和敏感性高的类风湿关节炎过氧化物还原酶Ⅳ抗体检测方法，其能捕获7.8ng/mL过氧化物还原酶Ⅳ抗体。

实施例 过氧化物还原酶Ⅳ抗体间接法ELISA试剂盒及其方法与运用

一 包被物人过氧化物还原酶Ⅳ的制备

构建人过氧化物还原酶Ⅳ表达质粒,用pET原核表达系统制备重组抗原TRX-过氧化物还原酶Ⅳ融合蛋白。

1根据GenBank中检索到的人过氧化物还原酶Ⅳ成熟蛋白序列编码,设计合成编码过氧化物还原酶Ⅳ蛋白的DNA；

2分别在DNA5′端和3′端设计EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点,经聚合酶链反应(PCR)、构建重组质粒pET过氧化物还原酶Ⅳ；

3在BL21(DE3)经IPTG诱导表达；

4 Ni-NTA亲和层析制备TRX-过氧化物还原酶Ⅳ；

5通过DNA测序、融合蛋白的相对分子质量分析及Western印迹来鉴定TRX-过氧化物还原酶Ⅳ质粒及表达的过氧化物还原酶Ⅳ抗原的正确性。

二、过氧化物还原酶Ⅳ抗体的间接法ELISA试剂盒及其方法与运用

1、实验材料

1.1、试剂

辣根酶标记山羊抗人IgM购自Lifescience公司；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）购自北京中山生物技术公司；小鼠抗人过氧化物还原酶Ⅳ单克隆抗体购自Abcam公司；

1.2、仪器

紫外分光光度仪Backmen 公司。

1.3、主要试剂配制

1％封闭液：加入10mL封闭液贮液到90mlTBS中，在-15~-25℃稳定保存。 0.5％封闭液：加入5mL封闭液贮液到95mLTBS中，在-15~-25℃稳定保存。血清稀释液：用0.5％的封闭液稀释一抗。 HRP标记的抗小鼠或人IgG用0.5％的封闭液稀释为1：10000倍，得到二抗工作液。包被液： 0.85M（PH 9.6）碳酸盐缓冲液：1.59g Na₂CO₃加2.93g NaHCO₃，三蒸水定容1000mL。洗涤液：0.01M pH7.4 PBS＋吐温-20（T）使最终质量分数为0.05％。 底物溶液：磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0~5.5)：0.1M柠檬酸24.3mL加入25.7ml 0.2M Na₂HPO₄·12H₂O 加入邻苯二胺40.0mg，定容至50mL，临用前加0.15mL体积分数为 30％的H₂O₂。终止剂：22.2mL硫酸加入蒸馏水177.8mL。

1.4、待测样品5例RA滑膜组织由北京大学附属人民医院风湿免疫科栗占国教授提供；534例 RA（其中初诊67例、复诊467例）、65例OA、120例SLE、10例硬皮病（scleroderma）、15例皮肌炎（dermatomyositis）及120例正常对照（NC）血液标本源自西南医院。

将收集的促凝血液标本4℃过夜后经3,000rpm离心30分钟，取上清，100ul分装，-70℃保存。

2、过氧化物还原酶Ⅳ抗体的ELISA试剂盒及其方法与运用

2.1、最佳过氧化物还原酶Ⅳ包被浓度和检测血清稀释倍数的确定

采用方阵滴定法，具体步骤如下：（1）将含10μg/ul重组表达的人过氧化物还原酶Ⅳ按照如下浓度稀释（5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、50μg/ml、100μg/ml），100μL/孔加于酶标板中，置4℃湿盒孵育12小时，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；（2）加入100μl/孔封闭液，4℃湿盒封闭过夜，洗板机洗涤3次，5min/次，拍干；（3）待测血清按照1：20、1：50、1：100、1：200倍稀释，100μl/孔，37℃湿盒作用1h，洗板机洗涤10次，3min/次，拍干；（4）将HRP标记的山羊抗人IgG按照1：4000稀释，100μl/L，加入酶标板中， 37℃湿盒孵育30分钟，洗板机洗涤10次，3min/次，拍干；酶标二抗按照已确定比例1：4 000使用；（5）加入TMB底物100μl/孔，37℃避光显色5min后，加入100μl/孔2mol/L硫酸终止反应；（6）检测：用酶标仪测OD_450nm值。同时以1%的BSA/PBS溶液作空白对照，以P/N值最大的人过氧化物还原酶Ⅳ包被物浓度和待测血清稀释度为最佳工作浓度。

分别将人过氧化物还原酶Ⅳ包被物和待测血清作系列稀释，进行方阵试验，结果见表1。方阵滴定结果显示，人过氧化物还原酶Ⅳ包被浓度为50μg/ml，待测血清1：200倍稀释时， 类风湿关节炎血清OD_450nm值大于1.0，阴阳性血清OD_450nm比值(P／N)最大为10.45；人过氧化物还原酶Ⅳ包被浓度为20μg/ml，待测血清1：200倍稀释时， 类风湿关节炎血清OD_450nm值大于1.0，阴阳性血清OD_450nm比值(P／N)为10.08，仅比最大阴阳性血清OD_450nm比值小0.37，考虑抗原包被成本，因此选择人过氧化物还原酶Ⅳ包被浓度为20μg/ml为最佳包被浓度；待测血清1：200倍稀释为最佳稀释浓度。

 

2.2、

取30份正常人血清，用上述建立的过氧化物还原酶Ⅳ抗体间接ELISA的方法检测。将30份正常人血清OD_450nm值的平均值（X）和2标准方差(SD)之和作为阴性样品值的上限，即待测血清样品的OD值＞X+2SD时，判断为阳性；否则为阴性。

通过对30份正常人血清样品进行检测(表2)，求得其X值为0.1667,SD值为0.0417，确定阴阳性临界值为 X+2SD=0.1667+2×0.0417= 0.2501。即待测样品的OD450nm值大于0.2501为过氧化物还原酶Ⅳ阳性，小于或等于则为阴性。

2.3

取骨性关节炎（OA）、系统性红斑狼疮（SLE）、其他自身免疫性疾病（AD），包括多形性硬化、硬皮病、皮肌炎、类风湿关节炎（RA）和正常人对照（NC）血清，按照本实施例中的方法进行检测，观察结果。

2.4、

将含2μg/ul小鼠抗人过氧化物还原酶Ⅳ单克隆抗体按照如下浓度梯度倍比稀释（2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125 ng/ml、62.5ng/ml、31.25 ng/ml、15.625 ng/ml、7.8125 ng/ml），100μL/孔加于酶标板中，每个稀释度重复3次，按建立的过氧化物还原酶Ⅳ抗体间接ELISA方法检测，结果见表3和图2。将小鼠抗人过氧化物还原酶Ⅳ单克隆抗体稀释至7.8125ng/ml时，OD450nm值为1.082，稍大于空白对照值0.895，由于在每一酶标孔中加100μL，因此，血清中检测含过氧化物还原酶Ⅳ抗体最低含量为0.78ng。

重复性试验结果

（1）批内重复性测定试验：取3份不同时间收集到的类风湿关节炎血清，按最佳稀释度稀释，加到抗原包被孔中，每份样品做3次重复ELISA测定。由每份样品的OD_450nm值计算出平均OD_450nm值（X）与标准方差（SD），进而计算出每份样品批内变异系数[CV=(SD/X)×100%]；（2）批间重复性测定试验：在其它条件相同的情况下，用3份不同批次制备的纯化的小鼠抗人过氧化物还原酶Ⅳ抗体包被酶标板，对3份不同时间收集到的类风湿关节炎血清进行检测。由每份样品的OD_450nm值计算出平均OD_450nm值（X）与SD，进而计算出每份样品的批间变异系数。

经统计学分析，3份不同时间收集到的类风湿关节炎血清之间批内重复试验OD_450nm值的变异系数（CV）为2.34%～4.87%，小于5%；3份不同时间收集到的类风湿关节炎血清3次批间重复试验OD_450nm值的CV为1.27%～3.79%，小于5%(表4)。表明建立的过氧化物还原酶Ⅳ抗体间接ELISA方法具有很好的批内及批间重复性。

2.6、检测方法的确定

结论:在RA患者血清中过氧化物还原酶Ⅳ抗体滴度明显高于正常人血清（P＜0.01）。尤其在初诊RA血清中过氧化物还原酶Ⅳ抗体滴度与正常人血清比较增高更为明显（P＜0.001）；通过cutoff值（0.2501）判断阳性率，在复诊RA患者血清中过氧化物还原酶Ⅳ抗体特异性为97%，敏感性为79%；过氧化物还原酶Ⅳ抗体在初诊RA患者血清中的特异性为98%，敏感性为82%。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。