一种测定活的血管内皮细胞表面摩擦性能的方法

摘要

一种测定活的血管内皮细胞表面摩擦性能的方法，以具有与生理血管类似结构和功能的高分子水凝胶加上单层血管内皮细胞膜构筑软材料活细胞人工血管模型，用于体外直接、定量且能长时间准确测定在体外培养的或者活的人体血管内皮细胞表面摩擦性能的方法，加强了细胞在水凝胶支架表面的粘附力，从而在测试中细胞不易被从水凝胶表面剥离，便于活细胞摩擦长时间准确检测；而该方法中使用到的高分子水凝胶，将处于“柔软的”水凝胶细胞培养支架与“柔软的”水凝胶摩擦基板之间的“夹心”状态，粘弹性的高分子水凝胶将有效减小细胞所承受的应力，从而保护细胞生存状态，克服细胞易于被剥离损坏的缺点，具有准确评价活细胞摩擦性能的优点。

说明书

技术领域

本发明属于细胞生物力学测定技术领域，具体涉及一种测定活的血管内皮细 胞表面摩擦性能的方法。

背景技术

微创医疗技术是21世纪医学领域发展最快的医疗技术之一，其原因在于为 数众多的患者需要治疗。微创介入医疗是采用一系列微创器械、材料和现代化 数字诊疗设备进行诊断与治疗操作的医疗技术，它具有“及时、微创、无痛、 舒适”的优点，在治疗心血管疾病方面尤为突出。随着人口老龄化时代的到来 和生活质量的提高，微创介入医学工程已显示出前所未有的应用前景。统计数 据表明，现今我国需要接受心血管手术的病人已达约400万人，且每年以20％ 的速率增加。在2005年我国与微创介入医疗器械材料相关的市场销售额约为50 亿元，预计在2015年，市场需求量有可能达到300～400亿元。所以，目前国 际上所有的医疗器械制造商都把目光瞄准了中国，将中国作为全球最大的心血 管疾病治疗的医疗器械潜在市场。

然而，由医疗导管/血管内皮细胞摩擦诱发的血管疾病是一个长期存在且尚 未解决的问题。在手术操作过程中，长度为80-150cm的医疗导管通常从浅表 腿部动脉或静脉入路，经过迂曲的血管将治疗器械(支架等)输送到病变处(如 心脏或脑部)，在此过程中，医疗导管不可避免地与血管内壁表面的单层内皮 细胞膜接触而产生摩擦，摩擦过高将会导致内皮细胞受损，进而诱发手术出血、 血栓形成以及术后血管再狭窄等并发症，最终诱发动脉粥样硬化等血管疾病。 所以，医疗导管/人体血管内皮细胞摩擦性能对心血管疾病微创介入治疗成功与 否意义重大。但是目前医疗导管/人体血管内皮细胞摩擦性能及机理尚不明确， 与迅速发展的微创介入医疗极不匹配，其主要原因在于目前测定医疗导管摩擦 性能的方法的如下缺点：

1)医疗导管材料/材料摩擦研究对细胞而言存在局限性，这类研究占绝大 多数，主要用微摩擦力测定仪、旋转式流变仪及多功能微摩擦试验机等方法评 价导管材料之间、材料与玻璃、高分子水凝胶等基板之间的摩擦性能。但是由 于未以血管内皮细胞为研究对象，很难断定所研究材料是否同样具有降低血管 内皮细胞摩擦的功能。

2)医疗导管材料/动物血管内壁表面摩擦研究难以扩展到人体，相关报道 尚不多见，有报道用销-盘摩擦磨损试验机、往复式摩擦测试仪研究了导管材料 /动物血管内壁摩擦性能。然而，以动物血管为研究对象的最大局限性在于需要 大量新鲜的血管样品，而获取大量人体新鲜血管样品的机会非常有限，所以该 方法难以扩展到人体血管内壁摩擦性能研究。

3)另外在体外培养血管内皮细胞摩擦性能测试方面，美国佛罗里达大学的 W.G.Sawyer等用微摩擦试验机初步评价了在玻璃表面培养的牛大动脉血管内 皮细胞/玻璃摩擦性能。虽然该研究在一定程度上反应了血管内皮细胞表面的宏 观摩擦行为，但是还存在下列问题：①研究对象问题，没有评价人体血管内皮细 胞摩擦性能，结果难以借鉴到人体；②体系设计问题，测试中细胞处于“硬的” 玻璃培养支架与“硬的”玻璃摩擦基板之间的“夹心”状态，因此，应力会集 中在“柔软的”细胞表面，测试中细胞很快被剥离损坏，导致难以准确评价细 胞摩擦性能。另外一种是用旋转流变仪测试在高分子水凝胶表面培养的人体血 管内皮细胞表面与玻璃板之间的摩擦性能，由于摩擦力较大，随测试时间的增 加，细胞逐渐被玻璃基板剥离损坏，200s以后不能得到准确的摩擦信息。此外， 上述两种方法均没有考虑温度和CO₂浓度对测试结果的影响。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种测定活的 血管内皮细胞表面摩擦性能的方法，这种方法用于体外直接、定量且能长时间 准确测定在体外培养的或者活的人体血管内皮细胞表面摩擦性能的方法，加强 了细胞在水凝胶支架表面的粘附力，从而在测试中细胞不易被从水凝胶表面剥 离，便于活细胞摩擦长时间准确检测；对不同的人体血管内皮细胞可分别寻找 出适合它们扩增为单层细胞膜的合成高分子水凝胶支架，并具有与体内血管内 皮细胞的接近的内皮糖萼结构和抗凝血功能，而该方法中使用到的高分子水凝 胶，将处于“柔软的”水凝胶细胞培养支架与“柔软的”水凝胶摩擦基板之间 的“夹心”状态，粘弹性的高分子水凝胶将有效减小细胞所承受的应力，从而 保护细胞生存状态，克服细胞易于被剥离损坏的缺点，具有准确评价活细胞摩 擦性能的优点。

为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种测定活的血管内皮细胞表面摩擦性能的方法，步骤如下：

步骤1：首先将高分子水凝胶按照预设的支架构架和基板构架分别切割加工 成高分子水凝胶支架和高分子水凝胶摩擦基板，将该高分子水凝胶支架和高分 子水凝胶摩擦基板进行高温灭菌15-20分钟；

步骤2：随后将人体脐带静脉血管内皮细胞直接播种于高温灭菌后的高分子 水凝胶支架的一侧表面后，在内部温度为37℃且内部CO₂的体积百分比为5％ 的培养箱中培养，直到血管内皮细胞扩增为单层血管内皮细胞膜，这样带有扩 增为单层细胞膜的高分子水凝胶支架就构筑成软材料活细胞人工血管模型；

步骤3：将待与单层血管内皮细胞膜摩擦的高分子水凝胶基板粘接在流变仪 溶液池的底面，并在流变仪溶液池内加入对应的细胞培养液，随后将高分子水 凝胶支架的带有单层血管内皮细胞膜的一侧表面朝向高分子水凝胶基板，而将 高分子水凝胶支架的另一侧表面粘接于流变仪上部的几何测头上，启动流变仪 的升降系统控制几何测头下降，直至软材料活细胞人工血管模型的单层血管内 皮细胞膜与高分子水凝胶基板相接触且相接触时垂直压力P达到预定值范围1～ 50Pa时，保持平衡10分钟，随后启动流变仪，按照预设的扭矩T(ω)使高分子水 凝胶基板沿旋转中心旋转至预定的最大角速度ω，当达到最大角速度ω时，待测点 的摩擦力F(ωR)与扭矩T(ω)的关系为F(ωR)＝[4T(ω)]/3πR³，其中R为待测点和 旋转中心之间的距离，根据摩擦力F(ωR)与所施加的垂直压力P的除值导出被 测点的摩擦系数μ。

所述的高分子水凝胶为聚乙烯醇水凝胶、聚氧乙烯水凝胶、聚乙二醇水凝 胶、聚丙烯酸水凝胶、聚甲基丙烯酸水凝胶、聚苯乙烯磺酸钠水凝胶或者聚2- 丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸水凝胶。

本发明以具有与生理血管类似结构和功能的高分子水凝胶加上单层血管 内皮细胞膜构筑软材料活细胞人工血管模型，该模型具有以下优势：(1)血管 内皮细胞的伪足可伸入三维网状结构的内部，加强了细胞在水凝胶支架表面的 粘附力，从而在测试中细胞不易被从水凝胶表面剥离，便于活细胞摩擦长时间 准确检测；(2)对不同的人体血管内皮细胞(动脉、静脉、微小管)，可分别寻 找出适合它们扩增为单层细胞膜的合成高分子水凝胶支架，并具有与体内血管 内皮细胞的接近的内皮糖萼结构和抗凝血功能。上述优势保证了“软材料活细 胞人工血管模型”在结构和功能上接近于生理血管。而高分子水凝胶在该方法 中发挥两个重要作用：(1)作为人体血管内皮细胞培养支架材料，用以构筑“软 材料活细胞人工血管模型”；(2)作为与单层人体血管内皮细胞膜摩擦的摩擦 基板材料。因此，血管内皮细胞将处于“柔软的”水凝胶细胞培养支架与“柔 软的”水凝胶摩擦基板之间的“夹心”状态，粘弹性的高分子水凝胶将有效减 小细胞所承受的应力，从而保护细胞生存状态，克服细胞易于被剥离损坏的缺 点，具有准确评价活细胞摩擦性能的优点。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作更详细的说明。

测定活的血管内皮细胞表面摩擦性能的方法，步骤如下：

步骤1：首先将高分子水凝胶按照预设的支架构架和基板构架分别切割加工 成高分子水凝胶支架和高分子水凝胶摩擦基板，将该高分子水凝胶支架和高分 子水凝胶摩擦基板进行高温灭菌15-20分钟；

步骤2：随后将人体脐带静脉血管内皮细胞直接播种于高温灭菌后的高分子 水凝胶支架的一侧表面后，在内部温度为37℃且内部CO₂的体积百分比为5％ 的培养箱中培养，直到血管内皮细胞扩增为单层血管内皮细胞膜，这样带有扩 增为单层细胞膜的高分子水凝胶支架就构筑成软材料活细胞人工血管模型；

步骤3：将待与单层血管内皮细胞膜摩擦的高分子水凝胶基板粘接在旋转式 流变仪溶液池的底面，并在流变仪溶液池内加入对应的细胞培养液，随后将高 分子水凝胶支架的带有单层血管内皮细胞膜的一侧表面朝向高分子水凝胶基 板，而将高分子水凝胶支架的另一侧表面粘接于流变仪上部的几何测头上，启 动流变仪的升降系统控制几何测头下降，直至软材料活细胞人工血管模型的单 层血管内皮细胞膜与高分子水凝胶基板相接触且相接触时垂直压力P达到预定 值范围1～50Pa时，保持平衡10分钟，随后启动流变仪，按照预设的扭矩T(ω) 使高分子水凝胶基板沿旋转中心旋转至预定的最大角速度ω，当达到最大角速度 ω时，待测点的摩擦力F(ωR)与扭矩T(ω)的关系为F(ωR)＝[4T(ω)]/3πR³，其中R 为待测点和旋转中心之间的距离，根据摩擦力F(ωR)与所施加的垂直压力P的 除值导出被测点的摩擦系数μ。

所述的高分子水凝胶为聚乙烯醇水凝胶、聚氧乙烯水凝胶、聚乙二醇水凝 胶、聚丙烯酸水凝胶、聚甲基丙烯酸水凝胶、聚苯乙烯磺酸钠水凝胶或者聚2- 丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸水凝胶，这样的合成高分子水凝胶为中性、弱电解 质及强电解质，具有化学结构明确、性能稳定且易于调控、无异物感染、易于 灭菌且廉价的优势。

本发明的摩擦力随时间变化中，能使摩擦力在几秒钟内首先达到一个最大 峰值，然后随时间变化逐渐减小，最后达到一个平衡值，这样即使测试2000s， 大于98％的细胞都保存在“软材料活细胞人工血管模型”的表面，同时细胞摩擦 系数可以维持在0.006-0.008，说明表面摩擦非常低，细胞几乎没有受损，可以 长时间测试。