聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂及其制备方法与应用。该聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂，是由式I所示化合物、与所述式I所示化合物的R

说明书

技术领域

本发明涉及一种聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂及其制备方法与应用。

背景技术

氧化应激是许多慢性疾病形成的重要病因之一，例如癌症、动脉粥样硬化、心血 管疾病、神经退行性疾病等[Sies，H.Antioxidants in disease mechanisms and therapy.San  Diego：Academic Press；1997.]。而抗氧化剂对于这些疾病所产生的抵御作用吸引人们对 其进行了广泛的研究[Margaill，I.；Plotkine，M.；Lerouet，D.Free Radic.Biol.Med.2005， 39：429-443.]，并且促进了用于治疗氧化应激相关疾病的新型抗氧化剂的开发和研究。 如维生素E是一种有效的脂溶性天然抗氧化剂，对于预防和治疗氧化应激相关疾病的 功效受到了广泛的关注，并且得到了越来越多的临床和流行病学的研究结果的支持。 而抗氧化剂与脂质自由基的高反应活性是决定其生物学保护效果的基本因素。为寻找 具有高效抗氧化功能的抗氧化剂，研究者不断的设计和开发新型的抗氧化剂以增加其 抗氧化活性，然而这种抗氧化剂在增加其抗氧化效果的同时可能会带来不可预期的生 物危害。本实验室前期的研究发现[Nie Z，Liu K J，Wang L F，et.al.Free Radic Biol Med. 2007，43：1243-1254]，将抗氧化化剂Trolox自组装到金纳米颗粒表面后所形成的纳米 抗氧化剂，在不改变其抗氧化基团的前提下，大大提高了其抗氧化效果，其清除DPPH 自由基的速率是抗氧化剂Trolox单体的8.3倍。尽管该纳米抗氧化剂大大提高了抗氧 化剂的抗氧化速率，但是该纳米抗氧化剂仍有悬而未决的问题存在，如：其生物相容 性较差，是否具有生物毒性，以及抗氧化剂纳米化后其抗氧化速率增加的机制等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂及其制备方法 与应用。

本发明提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂，是由式I所示化合物、与 所述式I所示化合物的R₁基团相连的抗氧化剂和与所述式I所示化合物的巯基相连的 金纳米颗粒组成，所述抗氧化剂的结构式如式IIa、式IIb或式IIc所示，

(式I)

式I所述化合物为含有ω-胺基或羟基的聚乙二醇基硫醇，所述式I中，R₁为-O或 -NH，n为1-200的整数，优选n为1-10的整数，更优选n为1-4的整数。

所述式IIa、式IIb和式IIc分别如下所示，

(式IIa)丹参素      (式IIb)水溶性维E    (式IIc)阿魏酸

上述聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂中，所述金纳米颗粒中的金原子与所 述式IIa-式IIc所示抗氧化剂的摩尔比为1∶2-9，具体可为1∶5-9、1∶6-9或1∶5-6， 所述聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的平均粒径为1-200nm，优选4.4-4.6nm。

本发明提供了两种制备上述聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的方法，其 中，方法一包括如下步骤：

1)在缩合剂和溶剂存在的条件下，式IIa、式IIb和式IIc所示任意一种抗氧化剂 与式I所示化合物进行缩合反应，得到式III所示化合物；

(式I)

所述式I中，R₁为OH或NH₂，n为1-200的整数，优选n为1-10的整数，更优 选n为1-4的整数；

所述式IIa、式IIb和式IIc分别如下所示，

(式IIa)      (式IIb)      (式IIc)

；

(式III)

所述式III中，R为NH或O，n为1-200的整数，优选n为1-10的整数，更优选 n为1-4的整数；

所述式III中，R₂为

2)在溶剂存在的条件下，将所述式III所示化合物与金纳米颗粒进行配基交换反 应，得到所述聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂。

该方法的步骤1)中，所述缩合剂选自N，N-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N-二环己 基碳二酰亚胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)中的 至少一种，所述溶剂为非质子极性溶剂，选自四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲 烷中的至少一种；所述式IIa-式IIc所示任意一种抗氧化剂、式I所示化合物与所述缩 合剂的摩尔用量比为1-5∶1-2∶1.2-10，优选1∶1∶1.2；所述缩合反应中，温度为0-40℃， 反应时间为12-48小时，优选18小时；

所述步骤2)中，所述溶剂选自二氯甲烷或由体积比为1∶1的二氯甲烷和甲醇组 成的混合液，所述金纳米颗粒的粒径为1-200nm，优选4.4-4.6nm；金纳米颗粒与所 述式III所示化合物的摩尔用量比为1∶2-9，优选1∶2.5-2.7；所述配基交换反应中， 温度为0-40℃，时间为4-24小时，优选6小时。

方法二包括如下步骤：

1)在溶剂存在的条件下，式I所示化合物或由所述式I所示化合物与式IV所示 化合物组成的混合物与金纳米颗粒进行配基交换反应，得到式I所述化合物修饰的金 纳米颗粒；

(式I)

所述式I中，R₁为OH或NH₂，n为1-200的整数，优选n为1-10的整数，更优 选n为1-4的整数；

(式IV)

所述式IV中，n为1-200的整数，优选n为1-10的整数，更优选n为1-4的整数；

2)在缩合剂和溶剂存在的条件下，将所述式I所述化合物修饰的金纳米颗粒与式 IIa-式IIc所示任意一种抗氧化剂进行缩合反应，得到所述聚乙二醇表面自组装金基纳 米抗氧化剂；

所述式IIa-式IIc分别如下所示，

(式IIa)    (式IIb)    (式IIc)

上述方法的步骤1)中，所述溶剂选自二氯甲烷或由体积比为1∶1的二氯甲烷 和甲醇组成的混合液，所述金纳米颗粒的粒径为1-200nm，优选4.4-4.6nm；

所述式I所示化合物与金纳米颗粒进行配基交换反应步骤中，所述式I所示化合 物与所述金纳米颗粒的摩尔用量比为2-9∶1；

所述式I所示化合物与式IV所示化合物组成的混合物与金纳米颗粒进行配基交换 反应步骤中，所述式I所示化合物与式IV所示化合物组成的混合物与所述金纳米颗粒 的摩尔用量比为2-9∶1，优选2.5-2.7∶1，所述式I所示化合物与所述式IV所示化合 物的摩尔用量比为0.1-20∶1，优选1∶1；

所述配基交换反应中，温度为0-40℃，时间为4-24小时，优选6小时；

所述步骤2)中，所述缩合剂选自N，N-二甲氨基吡啶(DMPA)、N，N-二环己基碳 二酰亚胺(DCC)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)中的至少 一种，所述溶剂选自四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺和二氯甲烷中的至少一种；所述式 I所述化合物修饰的金纳米颗粒、式IIa-式IIc所示任意一种抗氧化剂与所述缩合剂的 摩尔用量比为1∶2-9∶1.2-10，优选1∶2.5-2.7∶1.2；所述缩合反应中，温度为0-40℃， 反应时间为12-48小时，优选18小时。

本发明提供的上述聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂，其结构式如式V所 示，

(式V)

上述式V结构式中，Au代表金纳米颗粒，抗氧化剂通过配基 R1-(-CH₂-)-S-/R₁-(-CH₂CH₂O-)-S-连接到金纳米颗粒表面。需要说明的是，上述结构只 是说明金纳米颗粒与抗氧化剂之间的连接关系，不能理解为一个金纳米颗粒表面只连 接一个抗氧化剂。金纳米颗粒上的抗氧化剂的数量可以通过如下关系确定：金纳米颗 粒的金原子与抗氧化剂的摩尔比，其具体数值可通过XPS结果给出，当摩尔比为5-6∶1 时，抗氧化剂在金纳米颗粒表面接近饱和。

本发明提供的两种制备上述聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的方法，对于 不同链长(n)的配基具有不同的选择性。由于含有ω-胺基或羟基的聚乙二醇基硫醇 保护的具有高效抗氧化性能的表面自组装金纳米探针(n≤2)稳定性不好，因此适宜采 用方法一；而式I中(n＞2)的化合物的有机分离过程比较困难，适宜采用方法二。

本发明提供的上述聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂在制备抗氧化剂中的 应用，也属于本发明的保护范围。

本发明通过实验测试表明这种聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂能实现对 自由基的高效快速清除，因而可以作为一种新型的纳米抗氧化剂得到广泛的应用。本 发明具有如下优点：

1.本发明提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂能够实现对自由基的高效 快速反应。本发明通过将抗氧化剂以及含有巯基的不同链长的烷基或者聚乙二醇配基 自组装到金纳米颗粒的表面，通过在金表面形成局部高浓度的抗氧化剂基团，从而实 现了低浓度下加快抗氧化剂与自由基的反应速度的目的，经测试其与自由基的反应速 率为抗氧化剂单体的7-10倍。

2.本发明提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂通过将含有抗氧化剂基 团的巯基配基自组装到金纳米颗粒上的方法来提高抗氧化剂与自由基的反应速率，此 种方法合成过程简单，很容易实现。而且由于合成的金纳米颗粒的高生物相容性和低 细胞毒性，不会引入不必要的细胞毒性。

附图说明

图1为实施例1提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的红外谱图。

图2为实施例1提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的XPS谱图。

图3为实施例1提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的TEM(透射电镜) 照片。

图4为实施例3提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的红外谱图。

图5为实施例3提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的XPS谱图。

图6为实施例3提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的TEM(透射电镜) 照片。

图7为实施例4提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的红外谱图。

图8为实施例4提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的TEM(透射电镜) 照片。

图9为实施例4提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的XPS谱图。

图10为实施例3提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的MTT实验谱图。

图11为实施例3提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的MDA实验谱 图。

图12为实施例3提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的自由基清除动 力学实验谱图。

具体实施方式

以下通过具体实施例来说明本发明聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的制 备和应用，实施例中氨基或者羟基的烷基硫醇、羧基的烷基硫醇及其它原料均可由商 业途径购买得到，而氨基或者羟基的聚乙二醇基硫醇均是通过合成制得。下述实施例 中所述方法如无特别说明，均为常规方法。所述浓度如无特别说明，均为质量百分浓 度。

实施例1、方法一制备聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂(n＝1)

该反应方程式如下：

1)制备式III所示化合物(化合物4)

单口瓶中加入1.22g(0.01mol)式I所示化合物3(n＝1)、2.47g(0.012mol)缩合剂 DCC和1.98g(0.01mol)式IIa所示化合物丹参素混匀后，于30℃下反应24小时，用由 体积比为40∶1的二氯甲烷和乙醇组成的混合液进行柱分离，得到产物1.4g。

该产物的核磁数据如下：

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃).δ：9.48(s，2H)；6.73-6.86(m，3H)；6.52(s，1H)，5.25(s， 1H)；3.65-3.44(m，6H)；2.96(m，2H)；2.7(t，2H)

由上可知，该化合物结构正确，为化合物4。

其中，所述化合物3可按照下述方法制备而得：

1、化合物1的合成

单口烧瓶中加入10.6g(0.01mol)多聚乙二醇(结构式为 HOCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂OH)、7.5mL(0.07mol)三乙胺和150mL二氯甲烷，分 批加入9g(0.005mol)对甲苯磺酰氯，室温下反应14小时，用NaHSO₄溶液、5％NaHCO₃洗涤，无水硫酸钠干燥，用由体积比为40∶1的二氯甲烷和乙醇组成的混合液进行柱分 离，得产物化合物69g。

该产物的核磁数据如下：¹H-NMR(300MHz，CDCl₃).δ：7.8-7.31(m，4H)；4.16 (t，2H)；3.67(m，4H)；3.19(t，2H)；2.43(s，3H)。

由上可知，该化合物结构正确，为化合物1。

2、化合物2的合成

单口瓶中加入化合物19g(0.029mol)，NaI·9H₂O 11g(0.036mol)，以及50mL 丙酮回流反应过夜，过滤除去沉淀，除去溶剂后，用由体积比为80∶1的二氯甲烷和乙 醇组成的混合液进行柱分离，得产物5g。

该产物的核磁数据如下：¹H-NMR(300MHz，CDCl₃).δ：4.95(s，1H)；3.94(t，2H)； 3.61(t，3H)；3.43(m，4H)。

由上可知，该化合物结构正确，为化合物2。

3、化合物3的合成

单口瓶中加入2.9g(0.01mol)化合物2，加入NaSH的甲醇溶液10mL，室温下， 搅拌4小时，用由体积比为20∶1的二氯甲烷和乙醇组成的混合液进行柱分离，得化合 物34g。

该产物的核磁数据如下：¹H-NMR(300MHz，CDCl₃).δ：4.91(s，1H)；3.52-3.60 (m，4H)；3.44(t，2H)；2.7(t，2H)；1.8(s，1H)。

由上可知，该化合物结构正确，为化合物3。

2)制备聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂

将四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒10mg(0.8mM)溶于5毫升CH₂Cl₂中，再与 15mg(4.4mM)式III所示化合物4，在氮气氛围下于25℃搅拌6小时直至配基交换反 应完全，除去所用溶剂后，将该金纳米颗粒的粗产物溶于甲醇，以甲醇为淋洗剂，经 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱分离除去副产物，过量的四辛基溴化铵(TOAB)以及剩 余的巯基配基，收集最前端化合物，提纯后得到本发明提供的聚乙二醇表面自组装金 基纳米抗氧化剂，以干粉的形式存储于-20℃备用。

其中，该步骤中所述四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒是按照如下方法制备而得： 取5mL HAuCl₄水溶液(30.0mM)和14mL四辛基季胺盐的甲苯溶液(50mM)相 互混合，搅拌30分钟使HAuCl₄在四辛基的协助下充分进入有机层，最终水层透明而 甲苯层变为酒红色，完全加入后继续搅拌2小时直至反应完全。分离有机层，室温下 变为宝石红色。然后在剧烈搅拌的条件下逐滴加入过量的硼氢化钠8毫升(0.2M)， 随着滴加的进行，甲苯层逐渐发生由宝石红-白-灰-褐-深氮气吹干，得到所述四辛基溴 化铵保护的金纳米颗粒。

图1和图2分别为本实施例1制备所得聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的 红外谱图和TEM(透射电镜)照片。如图1所示，其红外谱图上在1731处有强的C＝O 吸收峰，说明金纳米颗粒上已经连接有抗氧化剂；X射线光电子能谱(XPS)(图2) 结果表明聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂中，金原子与表面抗氧化剂的摩尔数 之比为5∶1；如图3所示，透射电镜(TEM)结果表明聚乙二醇表面自组装金基纳米 抗氧化剂的平均粒径为4.5±0.5nm。

实施例2、方法一制备聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂(n＝4)

该反应方程式如下：

1、制备式III所示化合物(化合物9)

取0.209g(0.01mol)化合物8和Trolox(6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-羧酸)0.205g (0.01mol)溶于5mL DMF中，向其中加入DMAP(0.146g，0.012mol)、EDC(0.229g， 0.012mol)，于25℃下反应18小时，用由体积比为60∶1的三氯甲烷和乙醇组成的混 合液进行柱分离后溶于质量百分浓度为10％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液中，再向其中 滴加三乙基硅烷(30μl)，室温下搅拌1小时，用由体积比为60∶1的三氯甲烷和乙醇组 成的混合液进行柱分离，得到目标产物。

该目标产物的核磁数据如下所示：¹H-NMR(400MHz，H₂O)δ：1.36(s，3H)， 2.73(t，2H)；2.75-2.85(m，4H)，3.37(t，2H)；3.54-3.76(m，12H)，3.83(s，9H)。

由上可知，该化合物结构正确，为化合物9。

其中，所述化合物8是按照如下方法制备而得：

1.1化合物5的合成

单口瓶中加入三聚乙二醇1.96g(13mmol)，四氢呋喃20mL，三苯基膦7g (26.7mmol)，CBr₄8.7g(26.2mmol)。反应5小时，滤除白色沉淀后，蒸除溶剂， 剩余物溶于二氯甲烷中，加入正己烷后，出现白色沉淀，过滤再除去白色沉淀，浓缩， 用体积比为4∶1的由正己烷和乙酸乙酯组成的混合液柱分离，得到产物。

该产物的核磁数据如下所示：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ3.49(t，4H)，3.69 (s，4H)，3.83(t，4H)

由上可知，该化合物结构正确，为化合物5。

1.2化合物6的合成

单口瓶中加入1.25g(4.56mmol)化合物9，5mL THF，再加入0.844g(4.56mmol) 邻苯二甲酰亚胺钾盐的3mL DMF溶液，加热回流反应5小时，蒸除溶剂后，剩余物 溶于乙酸乙酯中，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥。用体积比为2∶1由正己烷 和乙酸乙酯组成的混合液进行柱分离，得到中间产物。

将所述中间产物溶于10mL乙腈中，加入0.755g(5.45mmol)碳酸钾，硫代乙酸 0.39mL(5.45mmol)。加热回流反应2小时。蒸除溶剂后，剩余物溶于乙酸乙酯中， NH₄Cl洗，盐水洗，无水MgSO₄干燥，用体积比为1∶1由正己烷和乙酸乙酯组成的混 合液进行柱分离，得到产物。

该产物的核磁数据如下所示：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ2.23(s，3H)，2.94 (t，2H)，3.44(t，2H)，3.49(m，2H)，3.54(m，2H)，3.66(t，2H)，3.81(t，2H)，7.6-7.8 (m，4H)。

由上可知，该化合物结构正确，为化合物6。

1.3化合物7的合成

化合物10溶于15mL甲醇中，加入0.55mL(17mmol)水合肼，搅拌反应5小时， 除去溶剂后，用由体积比为40∶1的二氯甲烷和乙醇组成的混合液进行柱分离，得到产 物。

该产物的核磁数据如下所示：¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ2.64(t，2H)，2.88 (t，2H)，3.52(t，2H)，3.56(t，2H)，3.57(s，4H)。

由上可知，该化合物结构正确，为化合物7。

1.4化合物8的合成

取0.119g化合物75mL THF中，向其中滴加0.22g(7.9×10^-4mol)三苯基氯甲烷， 50℃下反应4小时，蒸除溶剂后，用由体积比为20∶1的二氯甲烷和乙醇组成的混合液 进行柱分离，得到产物0.145g，为无色液体。

该产物的核磁数据如下所示：¹H-NMR(400MHz，CHCl₃)δ：2.40(t，2H)，3.11 (br，2H)，3.26(t，2H)，3.42(br，2H)，3.50(br，2H)，3.69(br，2H)，7.1-7.5(m，15H)。

由上可知，该化合物结构正确，为化合物8。

2)制备聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂

将四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒10mg(0.8mM)溶于5毫升CH₂Cl₂中，再与40 mg(7.2mM)式III所示化合物9，在氮气氛围下于25℃搅拌6小时直至配基交换反 应完全，除去所用溶剂后，将该金纳米颗粒的粗产物溶于甲醇，以甲醇为淋洗剂，经 葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱分离除去副产物，过量的四辛基溴化铵(TOAB)以及剩 余的巯基配基，收集最前端化合物，提纯后得到本发明提供的聚乙二醇表面自组装金 基纳米抗氧化剂，以干粉的形式存储于-20℃备用。

其中，该步骤中所述四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒是按照如下方法制备而得： 取5mL HAuCl₄水溶液(30.0mM)和14mL四辛基季胺盐的甲苯溶液(50mM)相 互混合，搅拌30分钟使HAuCl₄在四辛基的协助下充分进入有机层，最终水层透明而 甲苯层变为酒红色，完全加入后继续搅拌2小时直至反应完全。分离有机层，室温下 变为宝石红色。然后在剧烈搅拌的条件下逐滴加入过量的硼氢化钠8毫升(0.2M)， 随着滴加的进行，甲苯层逐渐发生由宝石红-白-灰-褐-深氮气吹干，得到所述四辛基溴 化铵保护的金纳米颗粒。

本发明提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂，经过红外光谱检测，在 1729处有C＝O的振动吸收峰；其XPS结果，表明该聚乙二醇表面自组装金基纳米抗 氧化剂中，金原子与表面抗氧化剂的摩尔数之比为6∶1；透射电镜(TEM)结果表明， 该聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的平均粒径为4.5nm。

实施例3、方法二制备聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂(n＝3)

该反应方程式如下：

1)制备式I所述化合物修饰的金纳米颗粒

取10mg四辛基溴化铵保护的金纳米颗粒和8.6mg式I所示化合物12溶于二氯甲 烷中，25℃下搅拌反应6小时。反应结束后，蒸除二氯甲烷后，将所得剩余物溶于甲 醇中，以甲醇为淋洗剂通过凝胶色谱柱Sephadex LH-20进行提纯后，得到式I所述化 合物修饰的金纳米颗粒。

其中，所述化合物12是按照如下方法制备而得：

1.1化合物10的合成

单口烧瓶中加入15g(0.01mol)三缩乙二醇，7.5mL(0.07mol)三乙胺，150mL 二氯甲烷，分批加入9g(0.005mol)对甲苯磺酰氯，室温下反应14小时，用NaHSO₄溶液，5％NaHCO₃洗涤，无水硫酸钠干燥，用由体积比为40∶1的二氯甲烷和乙醇组成 的混合液进行柱分离，得产物9g。

该产物的核磁数据如下所示：¹H-NMR(300MHz，CDCl₃).δ：7.8-7.31(m，4H)； 4.14(t，2H)；3.67(t，2H)；3.61-3.19(m，10H)；2.43(s，3H)。

由上可知，该化合物结构正确，为化合物10。

1.2化合物11的合成

单口瓶中加入上步产物9g(0.029mol)，NaI·9H₂O 11g(0.036mol)，以及50mL 丙酮回流反应过夜，过滤除去沉淀，除去溶剂后，用由体积比为80∶1的二氯甲烷和乙 醇组成的混合液进行柱分离，得产物5g。

该产物的核磁数据如下所示：¹H-NMR(300MHz，CDCl₃).δ：7.8-7.31(m，4H)； 4.14(t，2H)；3.67(t，2H)；3.61-3.19(m，10H)；2.43(s，3H)。

由上可知，该化合物结构正确，为化合物11。

1.3化合物12的合成

单口瓶中加入2.9g(0.01mol)化合物11，加入NaSH的甲醇溶液10mL，室温下， 搅拌4小时，用由体积比为20∶1的二氯甲烷和乙醇组成的混合液进行柱分离，得产物 4g。

该产物的核磁数据如下所示：¹H-NMR(300MHz，CDCl₃).δ：4.91(s，1H)；3.52-3.60 (m，8H)；3.44(t，2H)；2.7(t，2H)；1.8(s，1H)。

由上可知，该化合物结构正确，为化合物12。

2)制备聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂

取20mg所述步骤1)得到金纳米颗粒，分别加入水溶性维E(6-羟基-2，5，7，8-四 甲基色满-2-羧酸)45mg(0.17mM)，DMAP(4-二甲氨基吡啶)60mg(0.49mM)， 再加入5mL DMF，20℃下搅拌24小时，除去溶剂后，将剩余物溶于甲醇，然后通过 凝胶色谱柱Sephadex LH-20提纯后，得到本发明提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米 抗氧化剂。

本发明提供的具有高效抗氧化性能的聚乙二醇表面自组装金纳米颗粒(R＝O， n＝3)，经过红外光谱检测，在1731处有C＝O的振动吸收峰(图4)；其XPS结果 如图5所示，表明该聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂中的金原子与表面抗氧化 剂的摩尔数之比为9∶1；如图6所示，其透射电镜(TEM)结果表明，该聚乙二醇表 面自组装金基纳米抗氧化剂的平均粒径为4.5nm。

实施例4、、方法二制备聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂

(R＝O，n＝3)

该反应方程式如下：

1)制备式I所述化合物修饰的金纳米颗粒

按照与实施例3步骤1)完全相同的方法及条件制备得到15所示式I金纳米颗粒。

2)制备聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂

取20mg所述步骤1)得到金纳米颗粒，分别加入阿魏酸(4-羟-3-甲氧基肉桂酸) 33mg(0.17mM)，DMAP(4-二甲氨基吡啶)60mg(0.49mM)，再加入5mL DMF， 20℃下搅拌24小时，除去溶剂后，将剩余物溶于甲醇，然后通过凝胶色谱柱Sephadex LH-20提纯后，得到本发明提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂。

本发明提供的聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂，经过红外光谱检测，在 1732处有C＝O的振动吸收峰(图7)；其XPS结果如图8所示，表明该聚乙二醇表 面自组装金基纳米抗氧化剂中，金原子与表面抗氧化剂的摩尔数之比为9∶1；如图9 所示，其透射电镜(TEM)结果表明，该聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的平 均粒径为4.5nm。

实施例5、聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂对RAW264.7细胞氧化应激的 保护作用

1)RAW264.7细胞(购自协和医科大学细胞中心)活力的检测-MTT试验

将密度为1.0×10⁵个/ml的RAW264.7细胞悬液接种于96孔培养板，每孔100μl； 贴壁12h后，弃掉旧培养液，每孔加入100ul 5％DMEM完全培养基(对照组)或100ul 含有4mM Trolox单体的5％DMEM完全培养基(对照组)、100ul实施例3制备的聚 乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的5％DMEM完全培养基(样品组)；孵育24h 后，对照组各孔加入26.3μl DMEM基础培养基(不含胎牛血清的DMEM完全培养基)； 样品组各孔加入26.3μl 10mM t-BuOOH(叔丁基过氧化氢)，使之终浓度为500μM； 作用12小时后，每孔加入20μl 5mg/ml MTT溶液；孵育4h后，弃掉细胞培养液，每 孔加入150μl DMSO溶解的甲臜；于摇床上振荡10min后，用酶标仪测定各孔在490nm 处的吸收值，所得实验结果如图10所示。由图10可知，与不加抗氧化剂的t-BHP组 相比，Trolox单体能显著保护t-BHP对RAW264.7的氧化损伤，但与添加Trolox-壳 聚糖纳米颗粒组别相比，后者保护效果更为显著。

2)RAW264.7细胞膜脂质过氧化程度分析-MDA含量检测

细胞的处理方法同MTT试验。

用t-BuOOH(叔丁基过氧化氢)作用12h后，于24孔板上每孔加入100μl细胞 裂解液(购自北京索来宝科技有限公司)，裂解30min；用脂质氧化(MDA)检测试 剂盒(购自碧云天生物技术研究所)测定样品组的MDA含量。

按照表1所示MDA测试方法配制标准管、标准空白管、测定管和测定空白管。

表1、标准管、标准空白管、测定管和测定空白管的配制方法

  标准管   标准空白管   测定管   测定空白管   标准品   200μl   无水乙醇   200μl   样品   200μl   200μl   试剂一   1ml   1ml   1ml   1ml   试剂二   3ml   3ml   3ml   3ml   试剂三   1ml   1ml   1ml   50％冰醋酸   1ml

表1中，标准品为10nmol/ml四乙氧基丙烷水溶液，试剂一为pH值为7.4的磷酸 缓冲液，试剂二为3％的三氯乙酸水溶液，试剂三为0.6％的TBA(硫代巴比妥酸)水 溶液。

90℃水浴40min，冷却，测定532nm处的紫外吸收值，所得结果如下：

测定管吸收值：0.09；测定空白管吸收值：0.01；标准管吸收值：0.11；标准空白 管吸收值：0.01。并按照下述公式计算得到MDA值，

实验结果如图11所示，由图11可知，Trolox浓度均为1mM的条件下，Trolox- 壳聚糖纳米颗粒与Trolox单体相比，能够显著降低RAW264.7细胞膜的脂质过氧化程 度。

实施例6、聚乙二醇表面自组装金基纳米抗氧化剂的抗氧化速率实验

精密称取一定量的DPPH·，用无水甲醇配制成50μM的DPPH·溶液，将50μL(3 mM)样品溶液加入1.95mL上述DPPH·溶液中，混合，充分振摇。室温下静置20min， 然后测定反应溶液在517nm处的吸光度值。

样品溶液1和样品溶液2均用甲醇溶液配制，即：在1.95mL的DPPH·溶液中加 入50μL(3mM)样品2溶液，摇匀静置，反应30min，测定517nm处样品溶液1 和2的吸光度值，记为A1，每个样品测3次。用DPPH·溶液加甲醇溶液作为参比，A 值记为A0。所述样品1为Trolox，样品2为实施例3制备得到的聚乙二醇表面自组装 金基纳米抗氧化剂。

按照如下公式可得Trolox对DPPH·自由基的清除率(Scavenging rate)：

Scavenging rate＝(A0-A1)/A0×100％

所得结果如图12，表明实施例3制备的金纳米颗粒相比Trolox对DPPH自由基 的清除效率更快，具有更高的抗氧化活性。