一种丙酸杆菌属菌株质粒纯化的方法

摘要

本发明公开了一种针对于丙酸杆菌属菌株质粒纯化的方法，通过对菌体前处理以及后续处理，能够从丙酸杆菌属菌株中得到高纯度的质粒，与常规方法相比大大提高了质粒的浓度和纯度。本发明对于丙酸杆菌属的分子操作方面的研究打下了坚实的基础，并且对于其他革兰氏阳性菌(如乳酸菌属)可能具有普遍的适用意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种质粒的纯化方法，特别是一种丙酸杆菌属菌株质粒的纯化方 法。

背景技术

丙酸杆菌是一类革兰氏阳性，不运动，不产芽孢，厌氧耐氧，过氧化氢酶阳 性的杆状细菌，并且细胞壁较普通的革兰氏阳性菌成分更加复杂，结合更加紧密。 丙酸杆菌是一类重要的工业用微生物，已经广泛用于生产微生物B₁₂、四吡咯化 合物和丙酸，并且也应用于面包、奶酪、药剂的制作产业中。特别是丙酸，作为 一种初级代谢产物，广泛应用于纤维素膜、除草剂、香水中。丙酸同时也是一种 抑菌剂，可用于食品和粮食的保藏。

典型的丙酸杆菌是一类非致病菌，是一类很具有吸引力的异源基因表达的宿 主。虽然很多研究尝试对丙酸杆菌进行突变，但是对于丙酸杆菌的基因工程操作 才刚刚起步。丙酸杆菌基因工程操作的发展，将使异源基因和细菌素大量表达而 用于食品工业。基因克隆将给丙酸杆菌的基因研究和维生素B₁₂、四吡咯化合物、 卟啉化合物的生产带来便利。

丙酸杆菌缺乏基因工程研究的原因主要有：高GC含量，缺乏质粒信息，缺 乏合适的可用于转化的质粒载体，丙酸杆菌存在的强限制性修饰作用和缺乏合适 的抗性标记。

丙酸的生产方法主要是化学合成法，其主要原因是微生物发酵法生产成本较 高，目前还无法和化学合成法竞争。要实现丙酸的发酵法生产以完全替代化学合 成法，就必须大幅提高有机酸发酵生产的产量、生产强度和底物转化率，这就要 追根于菌体利用代谢途径生产有机酸的关键科学问题。

丙酸生产代谢途径中关键酶酶活力的限制、能荷水平的限制和分支代谢途径 的代谢流分流作用是普遍存在的关键科学问题。在丙酸代谢中，随着代谢的进行， 丙酸代谢途径中的一些关键酶限制了由底物转化为丙酸的速度，以及丙酸相关的 代谢部分流向分支代谢途径，最终导致目标产物的产量和生产强度较低，生产成 本较高。如在丙酸代谢过程中，当培养基中碳源甘油浓度超过40g/L时，产酸丙 酸杆菌合成丙酸的能力无法继续升高，反而降低，表现为高浓度碳源对丙酸杆菌 生长有抑制作用；分支代谢途径的存在导致由碳源流向丙酸的代谢通量降低，产 物乙酸的产量达2.56g/L。虽然通过分批补料控制甘油的浓度使丙酸产量上升， 但明显使发酵周期延长，生产成本增加，染菌机率增加，且无法有效降低分支代 谢产物产量。

因此，如何有效地提高代谢途径关键酶的酶活力、提高细胞的能量生成速率 和切断分支代谢途径是提高有机酸生产效率的重要科学问题之一。这就必须牵涉 到丙酸杆菌的基因改造问题上，而丙酸杆菌的基因改造的前提就是能找到一个合 适的筛选方法，能够从丙酸杆菌内筛选到内源性质粒进行分析改造，从而利用改 造的载体系统，对丙酸杆菌进行合适的基因操作。丙酸杆菌作为革兰氏阳性菌， 本身细胞壁成分较普通的革兰氏阳性菌更加复杂和紧密，因此普通破壁条件无法 顺利破除细胞壁。J.L.Johnson和C.S.Cummins研究了丙酸杆菌属菌株细胞壁 成分间的差异，证明丙酸杆菌属的菌株确实存在较为复杂的细胞壁。其后鲜有报 道丙酸杆菌的研究，P.Kiatpapan和Y.Murooka报道了一株适用于丙酸杆菌属菌 株的载体的构建，但是并未提及具体的质粒的筛选提取以及纯化方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种专门针对于丙酸杆菌属菌株的质粒筛 选纯化方法。优化了前处理酶的种类和处理时间，提高了提取效率。考察了冻融 对质粒纯化的影响，进一步优化了质粒纯化的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案为：取一定体积的培养菌液离心处 理后经SET洗脱液洗涤、溶液I、溶液II、碱裂解液III，其中在溶液I处理后添 加一定当量的溶菌酶、变溶菌素、蛋白酶K提高处理效果，碱裂解液III处理后， 通过常规的纯化步骤，获得高质量的质粒。其中，SET洗脱液最佳用量为1/20菌 液体积；溶液I最佳用量为1/20菌液体积；蛋白酶K用量为2倍菌液体积；溶 液II最佳用量为1/10菌液体积；碱裂解液III用量为1/13倍菌液体积；异丙醇 的最佳用量3/20倍菌液体积。

本发明优化了前处理用酶的种类和处理时间以及考察了冻融条件对质粒纯 化的影响，大大提高了提取效率，本发明利用优化的前处理步骤，与常规方法相 比大大提高了质粒的纯度、浓度和稳定性。

附图说明

图1冻融不同条件对质粒纯化的影响；

图2质粒纯化后核酸电泳图谱；

图3质粒纯化后核酸电泳图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实例来进一步详细说明本发明。

实施例1

(1)接种6瓶培养基，每瓶200mL 30℃静置培养35h，分别于4℃、10000g 离心3min，去上清，得六管菌体沉淀，分别编号为1-6。

(2)用10mL SET洗脱液分别洗涤六管菌体，于4℃、10000g条件下离心 3min，去上清，沉淀干燥得湿重。

(3)分别加入10mL溶液I彻底悬浮。

(4)分别加入1mL溶菌酶溶液，37℃水浴，1号水浴0min，2号水浴30min， 3号水浴0min，4号水浴30min，5号水浴30min，6号水浴60min。

(5)分别加入400mL蛋白酶K溶液，56℃水浴，1号水浴0min，2号水 浴0min，3号水浴30min，4号水浴30min，5号水浴60min，6号水浴30min；

(6)分别加20mL新配制的溶液II，轻轻颠倒5-6次，置于冰上。

(7)分别加15mL冰预冷的碱裂解液III，反复颠倒数次，检测细胞壁是否 完全破裂(表1)。

表1溶菌酶和蛋白酶K最佳处理时间筛选

(8)加入等体积的酚∶氯仿(1∶1V/V)，剧烈振荡，于4℃、10000g条件 下离心2min，转移上层水相到另一离心管中；

(9)加入30ml异丙醇剧烈振荡，室温放置2min，于室温10000g条件下离 心5min，吸除上清；

(10)加1mL 70％乙醇，颠倒数次，于室温10000g条件下离心2min，除去 上清；

(11)用1mL TE(pH8.0)溶解沉淀，温和震荡数次，贮存于-20℃；所述TE 为100mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。电泳结果见图1。

实施例2

(1)接种6瓶培养基，每瓶300mL 30℃静置培养35h，分别于4℃、10000g 离心3min，去上清，得六管菌体沉淀，分别编号为1-6。

(2)用10mL SET洗脱液分别洗涤六管菌体，于4℃、10000g条件下离心 3min，去上清，沉淀干燥得湿重。

(3)分别加入30mL溶液I彻底悬浮。

(4)分别加入1mL变溶菌素溶液，37℃水浴，1号水浴0min，2号水浴 30min，3号水浴0min，4号水浴30min，5号水浴30min，6号水浴60min。

(5)分别加入300mL蛋白酶K溶液，56℃水浴，1号水浴0min，2号水 浴0min，3号水浴30min，4号水浴30min，5号水浴60min，6号水浴30min；

(6)分别加15mL新配制的溶液II，轻轻颠倒5-6次，置于冰上。

(7)分别加30mL冰预冷的碱裂解液III，反复颠倒数次，检测细胞壁是否 完全破裂(表2)。

表2变溶菌素和蛋白酶K最佳处理时间筛选

(8)加入等体积的酚∶氯仿(1∶1V/V)，剧烈振荡，于4℃、10000g条件 下离心2min，转移上层水相到另一离心管中；

(9)加入15ml异丙醇剧烈振荡，室温放置2min，于室温10000g条件下离 心5min，吸除上清；

(10)加1mL 70％乙醇，颠倒数次，于室温10000g条件下离心2min，除去 上清；

(11)用1mL TE(pH8.0)溶解沉淀，温和震荡数次，贮存于-20℃；所述TE 为100mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。电泳结果显示无条带。

实施例3

(1)接种6瓶培养基，每瓶300mL 30℃静置培养35h，分别于4℃、10000g 离心3min，去上清，得六管菌体沉淀，分别编号为1-6。

(2)用30mL SET洗脱液分别洗涤六管菌体，于4℃、10000g条件下离心 3min，去上清，沉淀干燥得湿重。

(3)分别加入10mL溶液I彻底悬浮。

(4)分别加入1mL溶菌酶溶液和1mL变溶菌素溶液，37℃水浴，1号水 浴0min，2号水浴30min，3号水浴0min，4号水浴30min，5号水浴30min，6 号水浴60min。

(5)分别加入900mL蛋白酶K溶液，56℃水浴，1号水浴0min，2号水 浴0min，3号水浴30min，4号水浴30min，5号水浴60min，6号水浴30min；

(6)分别加60mL新配制的溶液II，轻轻颠倒5-6次，置于冰上。

(7)分别加15mL冰预冷的碱裂解液III，反复颠倒数次，检测细胞壁是否 完全破裂(表3)。

表3溶菌酶、变溶菌素和蛋白酶K最佳处理时间筛选

(8)加入等体积的酚∶氯仿(1∶1V/V)，剧烈振荡，于4℃、10000g条件 下离心2min，转移上层水相到另一离心管中；

(9)加入60ml异丙醇剧烈振荡，室温放置2min，于室温10000g条件下离 心5min，吸除上清；

(10)加1mL 70％乙醇，颠倒数次，于室温10000g条件下离心2min，除去 上清；

(11)用1mL TE(pH8.0)溶解沉淀，温和震荡数次，贮存于-20℃；所述TE 为100mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。电泳结果如图2。

本发明优选溶菌酶溶液和变溶菌素溶液于37℃水浴30min，然后加蛋白酶 K溶液于56℃水浴30min作为前处理。

实施例4

(1)接种2瓶培养基，每瓶200mL 30℃静置培养35h，分别于4℃、10000g 离心3min，去上清，得六管菌体沉淀，分别编号为1、2。

(2)用10mL SET洗脱液分别洗涤两管菌体，于4℃、10000g条件下离心 3min，去上清，沉淀干燥得湿重，其中1号快速冻融一次，2号不冻融。

(3)分别加入10mL溶液I彻底悬浮。

(4)分别加入1mL溶菌酶溶液和1mL变溶菌素溶液，37℃水浴，30min。

(5)分别加入400mL蛋白酶K溶液，56℃水浴30min；

(6)分别加20mL新配制的溶液II，轻轻颠倒5-6次，置于冰上。

(7)分别加15mL冰预冷的碱裂解液III，反复颠倒数次，然后置于冰上 3-5min，于4℃、10000g条件下离心5min，将上清转移至另一离心管中；

(8)分别加等体积的酚∶氯仿(1∶1V/V)，剧烈振荡，于4℃、10000g条 件下离心2min，转移上层水相到另一离心管中；

(9)分别加30mL异丙醇剧烈振荡，室温放置2min，于室温10000g条件 下离心5min，吸除上清；

(10)分别加1mL 70％乙醇，颠倒数次，于室温10000g条件下离心2min， 除去上清；

(11)分别用1mL TE(pH8.0)溶解沉淀，温和震荡数次，将两管纯化质粒进 行核酸电泳，结果如图3所示。

本发明优选培养液离心得菌体快速冻融后再用溶菌酶溶液和变溶菌素溶液 于37℃水浴30min，然后加蛋白酶K溶液于56℃水浴30min作为前处理。

按照本发明工艺，采用了冻融方法并且优化了前处理用酶的种类和处理时 间，提高了提取效率和产物浓度，产物纯度也得到较大改进，为后面的丙酸杆菌 分子操作打下了基础。