一种转基因沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535/Pcda-GFP及其构建方法

摘要

本发明公开一种转基因沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535/Pcda-GFP及其构建方法。该沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535/Pcda-GFP，其保藏编号为：CCTCC NO：M 2011269。本发明将带有强启动子Pcda和绿色荧光蛋白基因EGFP的重组质粒转入到沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535中，由此而获得转基因的沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535。该工程菌株相比于野生型的沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535，其荧光强度大大增强，从而当其用于毒性测试时候，能提高毒性测试方法的灵敏度，能够更方便、更快速的检测毒性物质。因此本发明的实现为更为方便、快速、灵敏的检测毒性物质提供了便利，可在环境中遗传物质的检测中进行推广应用。

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种转基因沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535/Pcda-GFP工 程菌株及其构建方法。

背景技术：

传统的毒性试验方法如鱼类试验、藻类实验、浮游动物试验等，或费用相对昂贵，或操 作繁琐试验耗时较长，不利于快速检测或在线监测。而发光细菌法则能很好的克服这些缺陷， 它具有快速、灵敏和操作简单等优点。应用发光细菌进行毒性测试可以有以下几个方面：一 个是利用天然发光细菌进行毒性测试，细菌发光强度与毒性物质浓度成负相关关系(称为 light-off)，以发光抑制率反映综合毒性大小，这种方法已被广泛接受；应用重组DNA技术构 建重组发光细菌(Recombinant Luminescent Bacteria)，分为组成型和诱导型两种，其中诱导 型须在特定的诱导物存在时荧光酶才得以表达，在毒物亚致死浓度范围内，其剂量效应关系 为正相关关系(表现为light-on)；还有就是利用从发光生物体中提取出来得酶系统进行毒性 试验。

传统的发光细菌法只能给出样品的综合毒性，而成分越趋复杂的城市污水和工业废水要 求日常环境监测中不仅要反映水体总毒性大小，更要提供不同类型毒性物质的信息。于是重 组发光细菌开始进入人们的视野。

lux操纵子作为编码和调控细菌生物发光的基因，其表达的直接结果非常直观并且便于仪 器检测，因此在分子生物学研究中被广泛地用作报告基因以研究基因的表达与调控。基于lux 报告基因这些特点，于上世纪90年代就开始有学者提出构建重组发光细菌来检测环境中特定 毒性物质的方法。重组发光细菌和天然发光细菌相比，其优势在于不同的调节基因和启动子 赋予了RLB不同的识别能力，能够根据毒性作用机制特异性的识别各类毒性物质，故可用以 检测各种细胞损伤，或是检测环境中某类特殊化合物如环境内分泌干扰物(EDCs)、持久性 有机污染物(POPs)等。近十几年，随着人们对RLB的关注，越来越多各种具有不同功能 的RLB被创造出来。

SOS/Umu测试系统正是基于DNA损伤物诱导SOS反应而表达umuC基因的能力，在鼠伤 寒沙门菌Salmonella typhimuriumTA1535中导入携带umuC”LacZ嵌合体的质粒pSK1002，该质 粒携带umu操纵子、umuD基因和umuC”LacZ融合基因的启动子及四环素和氯霉素耐药基因， 允许通过药物选择转化株，新构建的细菌称为S.typhimurium TA1535-pSK1002″当细菌受诱变 物作用引起SOS反应时，激活umuC-LacZ融合基因，表达出有β-半乳糖苷酶活性的融合蛋白， 通过检测此酶的活性可以确定受试物引起DNA损伤的程度，若加入S9混合液，则可以检测 化学物是否代谢活化生成损害DNA的产物。

发明内容：

本发明的目的是提供一种更方便、灵敏、快速的监测毒性物质的转基因沙门氏鼠伤寒杆 菌(Salmonella typhimurium)TA1535/Pcda-GFP工程菌株及其构建方法。

本发明的转基因沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535/Pcda-GFP于2011 年07月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其 保藏编号为CCTCC NO：M 2011269。

本发明的沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535/Pcda-GFP是通过以下方 法构建的，包括以下步骤：

将强启动子Pcda和绿色荧光蛋白基因EGFP连接，再与表达载体pET20b(+)连接构建 成重组质粒PSK-EGFP，再转化到沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535中， 从而得到转基因的沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535/Pcda-GFP，所述的强 启动子Pcda的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的98位-219位所示，所述的绿色荧光蛋白基因 EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的220位-936位所示。

本发明使用的沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535属于现有技术中的菌 株，可以从德国DSMZ菌种保藏中心购买到。

本发明将带有强启动子Pcda和绿色荧光蛋白基因EGFP的重组质粒转入到沙门氏鼠伤寒 杆菌TA1535中，由此而获得转基因的沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535。 该工程菌株相比于野生型的沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535，其荧光强度大大增强，从而当其用于 毒性测试时候，能提高毒性测试方法的灵敏度，能够更方便、更快速的检测毒性物质。因此 本发明的实现为更为方便、快速、灵敏的检测毒性物质提供了便利，可在环境中遗传物质的 检测中进行推广应用。

本发明的沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535/Pcda-GFP于2011年07 月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编 号为CCTCC NO：M 2011269。

附图说明：

图1是强启动子Pcda PCR扩增鉴定结果，M：DL2000DNA Marker，Pcda：Pcda扩增产物， 2、阴性对照；

图2是绿色荧光蛋白基因EGFP PCR扩增鉴定结果，M：DL5000DNAMarker，EGFP、EGFP 扩增产物，2、阴性对照；

图3是Pcda-EGFP连接后的PCR扩增鉴定结果，M：DL2000DNAMarker，1、2、阴性对照， 3、4、Pcda-EGFP连接产物；

图4是白斑纯培养图；

图5是白斑纯培养紫外激发图，激发光波长为365nm；

图6是野生型的沙门氏伤寒杆菌TA1535(1和2)和转基因沙门氏伤寒杆菌TA1535/Pcda-GFP (阳1和阳2)工程菌株的紫外激发图，激发光波长为365nm。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、强启动子Pcda的扩增：

以上海生工生物工程技术服务有限公司提供的含有Pcda启动子的质粒(货物名称为 Pcda)为模板，分别以C1和C2为上下游引物，PCR反应体系为(Pcda启动子质粒100ng， 1μL；C150μM，1μL；C250μM，1μL；dNTP(10mM)1μL；Taq酶5-10U，1μL；低盐缓冲 液，5μL；去离子水，45μL)，进行PCR反应(95℃4min，95℃45s，52℃30s，72℃30s， 29cycle，72℃10min，22℃forever)，PCR产物用1％的琼脂糖电泳，显示所扩增的片段大小 为120bp左右(图1)，和文献报道相符，结果符合预期。

C1：N：5′-AGCGAATTCGGGTTGACAGGATTTACG-3′

C2：C：5′-TTCTCCTTTACTCATGCAAACACCT-3′

二、绿色荧光蛋白基因EGFP的扩增：

以含有绿色荧光蛋白基因EGFP的质粒(上海雅吉生物科技有限公司，货号：YJ-2194P) 为模板，分别以P1和P2为上下游引物，PCR反应体系为(EGFP质粒，1μL；P150μM，1μL； P250μM，1μL；dNTP(10mM)1μL；Taq酶5-10U，1μL；低盐缓冲液，5μL；去离子水， 45μL)，进行PCR反应(95℃4min，95℃45s，56℃45s，72℃1min，34cycle，72℃10min，22℃ forever)，PCR产物用1％的琼脂糖电泳，显示所扩增的片段大小为750bp左右(图2)，结果 符合预期。

P1 N：5′-ATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3′

P2 C：5′-CTACTTGATATGTTTATTTTCGAACGTGA-3′

三、Pcda-EGFP片段连接：

分别对上面PCR扩增产物(强启动子Pcda片段和绿色荧光蛋白基因EGFP片段)进行胶回 收纯化，通过OD260/OD280，确定DNA浓度，浓度分别为168ng/μL和243ng/μL。把经过纯化 Pcda和EGFP片段进行无引物PCR，PCR反应体系为(强启动子Pcda片段100ng，1μL；绿色 荧光蛋白基因EGFP片段100ng，1μL，dNTP(10mM)1μL；Taq酶5-10U，1μL；低盐缓冲液， 5μL；去离子水，45μL)，PCR程序为：94℃40s，48℃40s，722min，15cycle。然后以C1 和P2作为上下游引物，PCR反应体系为(强启动子Pcda片段100ng，1μL；绿色荧光蛋白基因 EGFP片段100ng，1μL；C150μM，1μL；P250μM，1μL；dNTP(10mM)1μL；Taq酶5-10U， 1μL；低盐缓冲液，5μL；去离子水，45μL)，进行PCR扩增(94℃4min，94℃40s，541min， 72℃1min，30cycle，22℃forever)，PCR产物经1％的琼脂糖电泳，显示所扩增的片段大小为 900bp左右(图3)。

通过切胶回收Pcda-EGFP片段。纯化后，把我们的目的片段连接到TA克隆载体PMD18， 进行测序。测序结果如SEQ ID NO.1所示，经比对，其98位-219位为强启动子Pcda，220 位-936位为绿色荧光蛋白基因EGFP。测序结果与实验设计片段一致。测序结果表明，启动 子Pcda及绿色荧光蛋白基因EGFP正确插入，连接成功，由此得到Pcda-EGFP连接片段。

四、Pcda-EGFP片段与表达载体pET20b(+)(上海希匹吉生物科技有限公司，货号：CPC15) 连接：

1、酶切

将1μg Pcda-EGFP片段，EcoR I 0.5μL，HindIII 0.5μL，10×M Buffer 2μL，加无菌水至20μL， 37℃过夜(18h)酶切。

将1μg pET20b(+)，EcoR I 0.5μL，HindIII 0.5μL，10×M Buffer 2μL，加无菌水至20μL，37℃ 过夜(18h)酶切。

2、连接

T4酶1μL，10×T4DNALigase Buffer 2.5μL，表达载体pET20b(+)的酶切产物1μL， Pcda-EGFP片段的酶切产物为3μL。加无菌水至25μL，16℃过夜使Pcda-EGFP片段与表达载 体pET20b(+)连接，由此而将Pcda-EGFP片段插入表达载体pET20b(+)中，构建得到重 组质粒PSK-EGFP。

五、将重组质粒PSK-EGFP转入E.coli TOP 10中保存

取上述90μl重组质粒PSK-EGFP加入电击杯底部，再加入E.coli TOP10菌株，轻击液 体以确保细菌与DNA悬液位于电击杯底部，擦干电击槽外的冷凝水和雾气，将电击杯放进 电击仪进行电击转化，2500v，5ms。电击结束后，尽可能快取样品池，室温下加1mL SOC 培养液，37℃，200rpm/min，培养1h。分别取20μl，50μl，100μl涂布于含50mg/L的氨苄平 板上。37℃倒置培养，放置10-16h。挑白斑，以C1和P2作为引物，应用PCR方法的进行 验证(图3)。由此而获得带有重组质粒PSK-EGFP的E.coli TOP10重组菌株。

六、沙门氏鼠伤寒杆菌(salmonella typhimurium)TA1535/Pcda-GFP的构建

提取带有重组质粒PSK-EGFP的E.coli TOP10重组菌株的质粒，抽提完成后，用RNA酶， 37℃处理一个小时，用LB过夜培养无氨苄抗性的沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535菌株(由于沙门氏 鼠伤寒杆菌TA1535菌株中带有Psk1002质粒，必然会对氨苄抗性筛选产生影响，因此可对野 生型的沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535菌株进行连续传代培养，使Psk1002质粒发生丢失，从中筛 选到无氨苄抗性的沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535菌株)，按照前述方法进行电击转化，转化后， 进行挑菌紫外荧光验证。

如图4、5、6所示，图5和图6均为紫外激发图，采用365nm波长，转化成功的含有重组质 粒PSK-EGFP的沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535在紫外线的激发下，菌体发出绿色荧光，在图5中的 28个菌落都发出了绿色荧光，由此可见，这些菌株都转化成功了，如图6所示，转化成功的阳 性克隆发出绿色荧光，而野生型的无氨苄抗性的沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535不发出荧光。由上 述图可以推断，含有重组质粒PSK-EGFP的TA1535重组菌株(阳性克隆)构建成功，将此菌 命名为沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535/Pcda-GFP，该菌于2011年07月26 日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为 CCTCC NO：M 2011269。

功能比较

方法：挑取沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535/Pcda-GFP(CCTCC NO： M 2011269)和野生型的沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535的单菌落，用LB+Amp(50μg/mL)液体 培养基进行30℃，200rpm过夜摇菌。以1∶50(体积比)转接到含50mL(LB+50μg/mL Amp) 的三角烧瓶中，30℃，200rpm，摇菌。控制摇菌时间，取不同时间段菌液进行染毒实验，测 定OD₆₀₀分别为0.8，反应时间为6h，取3mL作为样品，进行荧光分光光度计进行荧光强度 测定。阳性物质采用丝裂霉素C(MMC)，浓度为1μg/mL，阴性对照用二甲基亚砜(DMSO)， 比较相同条件下的相对荧光强度。

结果见表1：

表1：两个菌种在相同条件下的荧光强度

由表1可以看出，本发明的沙门氏鼠伤寒杆菌(Salmonella typhimurium)TA1535/Pcda-GFP 的荧光强度在相同条件下，其荧光强度(26.3)远远大于野生型的沙门氏鼠伤寒杆菌TA1535 (11.8)，因此将其用于毒性测试时，能提高毒性测试方法的灵敏度，能够更方便、更快速的 检测毒性物质。因此本发明的实现为更为方便、快速、灵敏的检测毒性物质提供了便利，可 在环境中遗传物质的检测中进行推广应用。