一株拟无枝酸菌及利用其全细胞转化制备香草醛的方法

摘要

本发明涉及一株拟无枝酸菌及利用该菌的全细胞生物转化阿魏酸生产香草醛的方法，属生物技术领域。该菌已于2011年7月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号CCTCC NO：M2011265。在高底物浓度下，该微生物细胞转化阿魏酸产生香草醛的最大浓度可达到10g/L以上，对底物摩尔转化率为50%以上，用树脂吸附提取转化液中的香草醛，得到香兰素粗品的纯度为80%～95%。本发明转化反应条件温和，菌体细胞可以反复，对环境污染小，生产周期短，成本低，转化产物易分离纯化，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一株拟无枝酸菌（Amycolatopsis  sp.）zhp06，及其转化底物阿魏酸制备香草醛的生物转化方法，属生物技术领域。

背景技术

香草醛，又称香兰素(vanillin)、香兰精、香兰醛，香草素或香茅醛等，化学名称为3-甲氧基-4-羟基苯甲醛，相对分子质量152.15，白色至微黄色针状或粉末状结晶，是香荚兰的主要成分。它以游离态和葡萄糖甙的形式广泛存在于自然界植物中，在香子兰的荚中的质量含量为1.5%-3%，是香子兰花英中的典型香味物质。香草醛作为一种以奶油甜香味为特征的风味物质，广泛用于冰淇淋、巧克力和乳制甜点等食品中，堪称世界上使用最广的增香剂。目前，市场上大多是以愈创木酚（1，2-甲氧基苯酚）为原料经化学方法合成香草醛（年产12000t，16美元/kg），仅有极少一部分是从香子兰（Vanilla planifolia）豆荚中提取生产（年产20t，3200美元/kg）。化学合成法生产香草醛，工艺成熟，但环境污染严重，同时产品香气单一，安全性开始受到质疑。天然香兰素的高昂价格，不能满足人们对天然香料的消费的需求，由此推动了生物转化生产天然香兰素的研究。其中利用微生物细胞对前体底物进行转化的方法，近年来成为生产生物香草醛的发展趋势。

阿魏酸是香草醛的前体底物，根据微生物的不同，目前有一步法和两步法微生物转化生产香草醛。专利CN 1421523A 和CN 1824783A公开了用黑曲霉CGMCC 0774和朱红密孔菌CGMCC 1115微生物两步法转化阿魏酸生成香草酸、再生成香草醛的方法，这种方法需要培养两种微生物，存在工艺路线长的缺陷。US 06133003公布了2株拟无枝酸菌DSM 9991、DSM 9992一步法发酵转化阿魏酸生成香草醛的方法，微生物在发酵罐中生长12.5 h后，开始分阶段加入阿魏酸底物，转化50h后发酵液中香草醛达到11.5 g/L，摩尔转化率为77.8%。US 06235507公布了用西唐氏链霉菌Streptomyces setonni ATCC 39116以阿魏酸为底物一步法生产香草醛的方法，微生物接种于发酵培养基中生长20-40 h，当培养基中葡萄糖消耗完时开始分阶段加入阿魏酸底物，转化5-50h后，发酵液中可积累8-16g/L香草醛以及香草醇、香草酸、愈创木酚、乙烯基愈创木酚以及2-甲氧基-4-乙基苯酚等副产物，用有机溶剂如甲基正丁醚（MTBE），通过调节pH来分离提取香草醛与副产物愈创木酚。上述发明中，发酵液中香草醛浓度高，转化率高，但转化过程中加入阿魏酸底物的时机不易控制，副产物杂质较多，且微生物菌种难以获得。国内周庆礼等用链霉菌 Streptomyces sp.L1936，通过2次添加底物阿魏酸的发酵，使产物香兰素浓度达到7.12 g/L，摩尔转化率为69.9%（食品与发酵工业, 2004, 30(3): 18-20.）。中国专利CN 101165168A也公布一株链霉菌Streptomyces sp.V-1（CCTCC NO：M 206065,），用CY培养基和大孔吸附树脂DM11，通过发酵过程中，间歇添加阿魏酸浓度到45g/L，产香兰素达到19.2g/L，摩尔转化率为54.5%。这两种一步法中，同样存在转化过程中需多次加入阿魏酸底物以提高发酵液中香草醛的浓度、操作不易控制的问题。

本发明筛选到一株拟无枝酸菌zhp06，通过先培养微生物细胞或将其制备成固定化细胞，然后以游离或固定化细胞作为生物催化剂，转化底物阿魏酸为香草醛。培养的微生物细胞可以反复用于生物转化反应，降低了微生物发酵的成本，并且通过直接提高底物阿魏酸的浓度，提高转化液中香草醛的浓度，产物香草醛容易提取。

发明内容

本发明目的在于提供一株拟无枝酸菌（zhp06），以及用其进行全细胞生物转化阿魏酸制备香草醛的方法。

本发明的技术方案：一种拟无枝酸菌（Amycolatopsis  sp.）zhp06，于2011年7月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011265，该菌株菌体呈细丝状，在固体培养基上菌落呈灰白色或黄色，孢子呈椭球状，适宜生长温度范围28-37℃，且在50-55℃也能生长；16S rRNA基因序列与多株拟无枝酸菌的16S rRNA基因序列相似性达98%~99%。

利用所述拟无枝酸菌（zhp06）或其突变株转化反式阿魏酸生产香草醛的方法，其步骤包括：

（1）拟无枝酸菌（zhp06）或其突变株通过常规培养，离心后得到菌体细胞；

（2）以上述菌体细胞或其固定化细胞作为生物催化剂，与反式阿魏酸为底物的溶液进行转化反应；

（3）采用大孔树脂吸附法提取转化液中的香草醛。

步骤（1）拟无枝酸菌（zhp06）的发酵培养基配方为葡萄糖5～15 g，酵母膏1～20 g，Na₂HPO₄ ·10H₂O 1～10 g，KH₂PO₄ 0.1～2 g，NaCl 0.1～0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.2～0.5 g，CaCl₂·2H₂O 0.01～0.1 g，阿魏酸钠0.05～0.5 g；用自来水定容到1 L，pH7.2～7.4，121℃灭菌20 min。

步骤（2）生物催化剂与转化用底物溶液混合，其重量/体积比例为1:2~1:20，底物溶液的组成为：反式阿魏酸钠的浓度3～40 g/L，Na₂HPO₄ ·10H₂O 1～10 g/L，KH₂PO₄ 0.1～0.5 g/L，pH7.5-9，转化反应温度28～45℃，时间20-70 h。

步骤（3）：当步骤（2）转化反应进行5～12小时后，向转化体系中添加树脂重/体系体积为5%～50%的大孔树脂HZ-16或HZ-802，反应结束后，将树脂过滤出，用两倍于树脂体积的乙酸乙酯或乙醇在35～40℃条件下进行洗脱，加无水硫酸钠静止脱水12～15 h，滤液真空浓缩至香草醛含量200～230g/L，于4℃静置结晶。

培养基中的碳源用淀粉、或蔗糖、或麦芽糖、或果糖代替葡萄糖。

以下是本发明方法的详细描述：

    微生物菌株的筛选与鉴定：

本发明从昆明、无锡等地采集11份土样中分离放线菌，挑取菌落点种于筛选平板上，28℃培养3-5天后，2,4-二硝基苯肼溶液浸湿的滤纸覆盖在菌落上，挑选出现橙色和红色圈的菌株，进行复筛。将复筛的菌株转接于液体发酵培养基培养2-5天，取5mL发酵液离心，湿菌体与含5 g/L的阿魏酸钠混合，37℃转化24-48 h。转化液点样到硅胶层析薄板上，于苯:正己烷:三氯甲烷:乙醚:冰醋酸=4:3:2:1:0.1系统中展层，在265nm显色，分析其转化产物。其中菌株zhp06积累香草醛显著。

提取菌株zhp06的染色体DNA，经16S rRNA基因序列测定，测得的16S rRNA基因序列（GenBank JF828149）与多株拟无枝酸菌的16S rRNA的基因序列相似性达98%~99%。并按《放线菌系统学》（科学出版社2007，P363）与《放线菌分类基础》（科学出版社1977）生理生化鉴定，认为属拟无枝酸菌属（Amycolatopsis  sp.）菌株。菌体呈细丝状，固体培养基上呈白色或黄色，孢子呈椭球状，适宜生长温度范围28-37℃，且在50-55℃也能生长；适宜生长的pH值为6-9；适宜生长的NaCl浓度为0-5%；可使牛奶凝固、胨化，使明胶液化，产过氧化氢酶、脲酶、脂酶，淀粉酶活性较低，不能分解纤维素；不能产H₂S、乙酰甲基甲醇，分解葡萄糖产生甲酸等酸性物质较少，可以产吲哚。此菌已于2011年7月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011265。

微生物斜面培养基：葡萄糖、天冬酰胺琼脂培养基，或ISP-2培养基（见《中国菌种目录》，化学工业出版社，2007）。

筛选平板筛选培养基：在斜面培养基中，补加0.5-5g/L的苯甲酸或阿魏酸。

发酵培养基：葡萄糖5～15 g，酵母膏1～20 g，Na₂HPO₄ ·10H₂O 1～10 g，KH₂PO₄  0.1～2 g，NaCl 0.1～0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.2～0.5 g，CaCl₂·2H₂O 0.01～0.1 g，阿魏酸钠0.05～0.5 g，pH 7.2～7.4，用自来水定容到1 L。每500 mL三角瓶装液50 mL，121℃灭菌20 min。

培养基中的碳源除了葡萄糖外，还可以用淀粉、或蔗糖、或麦芽糖、或果糖。

生物催化剂制备与转化反应：

菌体接种于斜面培养基，28-37℃培养3-6天。用无菌水制成孢子悬液，按2%-5%接种量，接入液体发酵培养基，在28-40℃，180～220r/min条件下震荡培养22～40小时，于3000-6000 r/min离心10-15min，得到湿菌体。

以湿菌体或固定化菌体全细胞为生物催化剂，与转化用底物溶液混合，其比例为1:2~1:20（重量/体积），底物溶液的组成为：反式阿魏酸钠的浓度3～40 g/L，Na₂HPO₄ ·10H₂O 1～10 g/L，KH₂PO₄ 0.1～0.5 g/L，pH7.5-9，转化反应温度28～45℃，时间20-70 h。

固定化细胞的方法采用以卡拉胶或壳聚糖或海藻酸钙等为载体的固定化方法，如《生物固定化技术及应用》（P137-157，化学工业出版社，2009）所述。

产物提取：

转化反应5～12小时后，向转化体系中添加5%～50%（树脂重/体系体积）大孔树脂HZ-16或HZ-802，反应结束后，将树脂过滤出，用两倍于树脂体积的乙酸乙酯或乙醇在35～40℃条件下进行洗脱，加无水硫酸钠静止脱水12～15 h，滤液经真空蒸发浓缩至香草醛含量200～230g/L，于4℃静置结晶。

产物分析方法：

采用HPLC分析转化液中产物的成分。如用岛津LC-20AB，系统控制器CBM-20A，UV-VIS检测器SPD-20AV，柱温箱CTO-20A；色谱柱Waters Sunfire C18 5μm 4.6*250mm；检测条件：检测波长 280 nm，柱温 30℃，流动相为0.01%的醋酸溶液:甲醇=7:3，流速为1 mL/min，进样量 20 μL。

本发明的有益效果：分离出一株能转化高浓度阿魏酸生成香草醛的菌株，通过先培养微生物，然后以微生物细胞为催化剂与高浓度底物进行转化反应的方法，制备香草醛，其中生物催化剂可以反复利用。该方法的反应条件温和，环境污染小，生产周期短，转化后产物纯度高，有利于产品的分离纯化，具有良好的应用前景。

生物材料样品保藏：拟无枝酸菌（Amycolatopsissp.）zhp06，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期2011年7月26日，保藏编号为CCTCC NO：M 2011265。

具体实施方式

以下是说明本发明的实例，但不局限于这些实例。

实施例1

按细菌基因组DNA提取试剂盒（上海捷瑞生物工程有限公司）方法提取筛选菌株zhp06的染色体DNA，以细菌通用引物（上游引物ACGGTTACCTTGTTACGACTT，下游引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）通过PCR扩增其16S rRNA基因，委托上海生工有限公司进行测序，测得的16S rRNA基因序列片段，提交至GenBank，登记号为JF828149。与NCBI网站中用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rRNA基因序列进行同源性比对（表1），按《放线菌系统学》进行生理生化特性鉴定，其显著特征是对温度、pH、NaCl的耐受性较强，与最接近的（或同源性最高）的菌株广温拟无枝酸菌Amycolatopsis eurytherma strain NT202和热黄拟无枝酸菌Amycolatopsis thermoflava strain 173573比较（表2），在碳源（如阿拉伯糖、纤维二糖、木糖等）的利用方面有所不同，而在生长温度、NaCl的耐受性方面性质相同，且与广温拟无枝酸菌Amycolatopsis eurytherma strain NT202在明胶分解、淀粉酶、硝酸还原酶、脲酶等酶产生方面完全相同，认为是无枝酸菌属菌株（广温拟无枝酸菌变种），此菌已于2011年7月26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2011265。

表1 同源性分析表

表2 生理生化特性对照表

实验项目zhp0612是否产生气生菌丝+++气生菌丝颜色：   白色+++是否产生水溶性色素未—+是否能够利用下物质生产酸：   l-(+)-阿拉伯糖w++d-(+)-纤维二糖w++糊精/葡聚糖ww—d-(+)-果糖+++d-(+)-半乳糖w++内消旋肌醇—+—d-(+)-乳糖ww+d-(+)-麦芽糖w——d-(-)-甘露醇w++d-(+)-松三糖—未—d-(-)-山梨醇—++蔗糖———d-(+)-海藻糖—++d-(+)-木糖w++分解   明胶++—生长温度：   10°C———45°C+++NaCl(5%,w/v)中是否生长+++产物：  未淀粉酶——未硝酸还原酶++未脲酶++未

 1，表示Amycolatopsis eurytherma strain NT202；2，表示Amycolatopsis thermoflava strain 173573；+，表示阳性；w，表示微阳性；—，表示阴性。

实施例2~6： 

拟无枝酸菌.zhp06孢子悬液以5%接种量，分别接入以麦芽糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉为碳源的发酵培养基。35℃，180r/min条件下震荡培养24小时。取20 mL发酵液于5000 r/min离心10min，弃除上清液，菌体与10mL含12g/L阿魏酸的转化底物溶液混合，在35℃，180 r/min转化48 小时，取样测定香草醛浓度，结果如表3。

发酵培养基组成：碳源5 g，酵母膏10 g，Na₂HPO₄ ·10H₂O 5g，KH₂PO₄ 0.5 g，NaCl 0.2 g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，CaCl₂·2H₂O 0.1g，阿魏酸钠0.1 g，pH7.2～7.4，用自来水定溶到1 L。每500 mL三角瓶装液50 mL，121℃灭菌20 min。

表3 不同碳源培养拟无枝酸菌zhp06的转化液中产物分布的情况

 不同碳源阿魏酸（g/L）香草酸（g/L）愈创木酚（g/L）香草醛（g/L）香草醇（g/L）香草醛摩尔转化率（%）实施例2麦芽糖1.490.820.555.080.4054.1实施例3果糖2.020.390.255.480.6658.3实施例4葡萄糖1.910.640.274.960.6452.7实施例5可溶淀粉1.340.900.335.310.6356.5实施例6蔗糖1.560.730.295.060.5153.8

实施例7 

按照实施例4的方法培养微生物，100mL发酵液于5000 r/min离心10min，得到菌体细胞3.5g，加入20mL 16g/L阿魏酸的底物溶液混合，在35℃，180 r/min转化24小时。每次转化完成后再次离心，加入同样的底物溶液。重复转化7次，结果如表4：

表4 拟无枝酸菌zhp06全细胞重复转化产物的情况

试验次数香草醇（g/L）香草醛（g/L）香草酸（g/L）愈创木酚（g/L）阿魏酸（g/L）香草醛摩尔转化率（%）第1次0.343.510.760.565.60.28第2次0.553.823.641.580.040.30 第3次0.947.971.810.460.140.64 第4次0.957.411.300.400.360.59 第5次0.798.021.400.240.760.64 第6次0.878.211.850.090.230.65 第7次1.397.933.250.151.170.63

实施例8 

按实施例4的方法，得到菌体细胞5g，用生理盐水配成50%菌悬液，与浓度为5.4%的卡拉胶溶液按体积比1:2，在58℃下混合均匀，并立刻用冷的0.3M氯化钾溶液浸泡，于10℃下硬化4h，得到固定化细胞29g。取10 g 固定化细胞与10 mL 16 g/L阿魏酸的底物溶液混合，在37℃静置转化24小时，取样测定转化液的香草醛浓度，取出固定化细胞，重新加入同样的底物溶液，重复转化3次，转化液中香草醛浓度分别为5.6g/L、5.3 g/L、4.4 g/L。

实施例9-11

按实施例5的方法，得到菌体细胞5 g，分别与加入20 mL含20g/L、30g/L与40g/L阿魏酸的底物溶液混合，在35℃，180 r/min转化12 小时，加入2g大孔树脂HZ-16，继续转化48小时，测定转化液中香草醛浓度，如表5。

表5 不同底物浓度的转化情况

 底物浓度（g/L）香草醇（g/L）香草醛（g/L）香草酸（g/L）愈创木酚（g/L）阿魏酸（g/L）实施例9200.617.880.036.460.46实施例10300.1910.030.065.510.65实施例11400.4610.082.164.52 

实施例12 

收集1L转化液，其中香草醛浓度5.34g/L，加入300 g树脂HZ-16，在35℃吸附3 h，滤出树脂，加入600mL乙酸乙酯，于35℃ 洗脱2次，每次2 h，得到的乙酸乙酯洗脱液约1200mL进行减压蒸馏，当乙酸乙酯中香草醛的浓度约为22%时停止蒸馏，于4℃静置结晶，得到3.66g 香草醛粗品，纯度95%。