力复霉素产生菌地中海拟无枝菌酸菌U32丙氨酸脱氢酶基因克隆及表达

摘要

丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.1)可逆催化丙氨酸脱氨生成丙酮酸和NADH.它是生物体内的氨基酸代谢和氨同化途径的关键酶.在地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U32中,丙氨酸脱氢酶的活力与力复霉素的生物合成有负相关现象,其活力受KNO3全局效应的调控.根据结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)和天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)的丙氨酸脱氢酶氨基酸的保守序列和地中海拟无枝菌酸菌U32对氨基酸密码子的使用偏好,设计一对简并PCR引物.以此引物从地中海拟无枝菌酸菌U32中扩增到一555bp的片段,并以此片段为探针从地中海拟无枝菌酸菌U32 基因组cosmid文库中成功的克隆到了丙氨酸脱氢酶结构基因(ald).它编码了一个371个氨基酸的蛋白质,基因的GC含量为72.5%,符合链霉菌的基因结构特征.在起始密码子的上游6个碱基处,有一典型的链霉菌核糖体结合位点(RBS):AGGAGG,第75位的氨基酸为赖氨酸,是丙酮酸结合位点.以pET28b为载体,在E.coli BL21(DE3)中高效表达了ald基因.用IPTG在22℃时诱导得到的丙氨酸脱氢酶活力最高.用His-Tag柱纯化了表达的丙氨酸脱氢酶.酶学性质研究表明该酶专一性以L-Ala和NAD(H)为底物.