低免疫原性链霉抗生物素蛋白及其应用

摘要

本发明的课题在于，提供降低链霉抗生物素蛋白所具有的对于哺乳动物的免疫原性(抗原性)的链霉抗生物素蛋白突变体。根据本发明，提供了链霉抗生物素蛋白突变体，其含有如下形成的氨基酸序列，在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中：(a)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸残基的酪氨酸、第71位氨基酸残基的酪氨酸、第89位氨基酸残基的谷氨酸、第91位氨基酸残基的精氨酸和第104位氨基酸残基的谷氨酸中的任意一个以上置换为其它的氨基酸，与野生型链霉抗生物素蛋白相比，该突变体的免疫原性降低。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫原性降低的链霉抗生物素蛋白突变体及其应用。更具体地说，本发明涉及通过向氨基酸导入突变来降低免疫原性的链霉抗生物素蛋白突变体及其应用。

背景技术

抗生物素蛋白与生物素、或链霉抗生物素蛋白与生物素之间的亲和性非常高(Kd=10^－15～10^－14M)，作为生物体二分子之间的相互作用，其为最强的相互作用之一。现在，抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用广泛应用于生物化学、分子生物学、或医学领域中(Green, (1975), Adv. Protein Chem., 29: 85-133; Green, (1990), Methods Enzymol., 184: 51-67)。抗生物素蛋白为来源于卵白的碱性糖蛋白，等电点超过10。另一方面，链霉抗生物素蛋白来源于放线菌(阿维丁氏链霉菌(Streptomyces avidinii))，等电点在中性附近，不含有糖链。这两种蛋白质都形成4聚物，每1个亚基与1分子的生物素结合。分子量为60kDa左右。

近年，提出了该抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白与生物素的高结合能力和抗体分子组合而成的药物输送方法：预定位(Pretargeting)法(Hnatowich, (1987), J. Nucl. Med., 28, 1294-1302)。但是，由于来源于鸡的抗生物素蛋白、来源于微生物的链霉抗生物素蛋白对于人体表现出高的免疫原性，在给予人体后，早期产生抗抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白抗体成为问题，成为阻碍预定位法的实用化的原因之一(Paganelli, (1991),  Cancer Res., 51, 5960-5966)。

为了解决上述问题，过去发表了对于链霉抗生物素蛋白的低免疫原性化进行叙述的论文(Subramanian, (1998), Bioch. and Mol. biol. Int., 43, 357-82)，但链霉抗生物素蛋白对于人体的免疫原性的问题仍然未解决。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：美国专利第5,672,691号。

专利文献2：美国专利第6,022,951号。

非专利文献

非专利文献1：Green, (1975), Adv. Protein Chem., 29: 85-133；

非专利文献2：Green, (1990), Methods Enzymol., 184: 51-67；

非专利文献3：Hnatowich, (1987), J. Nucl. Med., 28, 1294-1302；

非专利文献4：Paganelli, (1991),  Cancer Res., 51, 5960-5966)。

非专利文献5：Mapping the common antigenic determinants in avidin and streptavidin. Subramanian, N等人, Biochemistry and Molecular biology International.1997, 43, 357-82。

非专利文献6：Reduced antibody response to streptavidin through site-directed mutagenesis　Meyer, DL等人, Protein Science.　2001, 10, 491-503。

非专利文献7：Biotin Reagents for Antibody Pretargeting. 4.　Wilbur DS等人, Bioconjugate Chemistry.　2000, 11(4), 569-583。

发明内容

本发明要解决的课题在于，提供作为来源于属于微生物的阿维丁氏链霉菌的蛋白质的链霉抗生物素蛋白所具有的对于哺乳动物的免疫原性(抗原性)得到降低，动物体内的抗链霉抗生物素蛋白抗体产生得到抑制，且维持对于生物素的结合能力的可以用于药物及其它的工业中的各种目的的链霉抗生物素蛋白突变体(低免疫原性链霉抗生物素蛋白)。进一步地，本发明要解决的课题在于，提供使用上述链霉抗生物素蛋白突变体的诊断药物、治疗药物，使用上述链霉抗生物素蛋白突变体的诊断试剂盒、治疗试剂盒。

本发明人为了解决上述问题而精心研究，由链霉抗生物素蛋白的立体结构和五肽出现频率分析，选择在人体内形成抗原位点的氨基酸，选出形成低免疫原性化的低免疫原性化候选氨基酸。接着，在以野生型链霉抗生物素蛋白作为模板的基因序列中形成点突变，向低免疫原性化候选氨基酸转换，实施蛋白质表达并实施蛋白纯化。进一步地，对于这些突变体链霉抗生物素蛋白，使用野生型链霉抗生物素蛋白对食蟹猴进行免疫，使用实施了制备的抗链霉抗生物素蛋白抗血清对反应性进行分析后，鉴定出发现与野生型链霉抗生物素蛋白相比抗血清的反应性降低约40%以上的突变体链霉抗生物素蛋白，从而完成本发明。

即，根据本发明，提供以下的发明。

[1] 链霉抗生物素蛋白突变体，其含有如下形成的氨基酸序列，在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中：(a)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸残基的酪氨酸、第71位氨基酸残基的酪氨酸、第89位氨基酸残基的谷氨酸、第91位氨基酸残基的精氨酸、和第104位氨基酸残基的谷氨酸中的任一个以上置换为其它的氨基酸，与野生型链霉抗生物素蛋白相比，该突变体的免疫原性降低。

[2] [1]记载的链霉抗生物素蛋白突变体，其含有如下形成的氨基酸序列，在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中：(a)第71位氨基酸残基的酪氨酸和第72位氨基酸残基的精氨酸置换为其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸残基的酪氨酸、第89位氨基酸残基的谷氨酸、第91位氨基酸残基的精氨酸、第104位氨基酸残基的谷氨酸中的任一个置换为其它的氨基酸。

[3] [1]或[2]记载的链霉抗生物素蛋白突变体，其在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下任意一个以上的突变：

(1) 第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸或苏氨酸的突变，

(2) 第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸的突变，

(3) 第72位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，

(4) 第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为天冬氨酸的突变，

(5) 第91位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，

(6) 第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。

[4] 链霉抗生物素蛋白突变体，其含有在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下任意一个以上的突变的氨基酸序列，与野生型链霉抗生物素蛋白相比，该突变体的免疫原性降低：

(1) 第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸或苏氨酸的突变，

(2) 第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸的突变，

(3) 第72位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，

(4) 第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为天冬氨酸的突变，

(5) 第91位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，

(6) 第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。

[5] 链霉抗生物素蛋白突变体，其含有在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下突变的氨基酸序列，与野生型链霉抗生物素蛋白相比，该突变体的免疫原性降低：

(2) 第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸的突变，

(3) 第72位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，

(4) 第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为天冬氨酸的突变，

(6) 第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。

[6] [5]中记载的链霉抗生物素蛋白突变体，其进一步具有以下的突变：

(1) 第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸或苏氨酸的突变，

(5) 第91位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变。

[7] 链霉抗生物素蛋白突变体，其在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下的全部突变：

(1) 第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸的突变，

(2) 第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸的突变，

(3) 第72位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，

(4) 第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为天冬氨酸的突变，

(5) 第91位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，以及

(6) 第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。

[8] DNA，其编码[1]～[7]中的任意一项记载的链霉抗生物素蛋白突变体。

[9] 用抗体标记的链霉抗生物素蛋白突变体，其通过使抗体与[1]～[7]中的任意一项记载的链霉抗生物素蛋白突变体结合而得到。

[10] 治疗剂或诊断剂，其含有[9]中记载的用抗体标记的链霉抗生物素蛋白突变体。

[11] 治疗或诊断试剂盒，其含有(a)[9]中记载的用抗体标记的链霉抗生物素蛋白突变体和(b)用对于链霉抗生物素蛋白具有亲和性的生物素或其衍生物标记的诊断用或治疗用物质。

本发明的突变体链霉抗生物素蛋白的特征在于，在维持对于生物素的结合能力的同时，对于哺乳动物的免疫原性(抗原性)降低，因此动物体内的抗链霉抗生物素蛋白抗体产生得到抑制。本发明的突变体链霉抗生物素蛋白可以用于药物及其它工业中的各种目的中。

附图说明

[图1] 图1表示Biacore分析中的传感图。

[图2] 图2表示对于突变体链霉抗生物素蛋白的抗血清的反应性。

[图3] 图3表示天然型链霉抗生物素蛋白、mcSA040、mcSA072、mcSA314、mcSA414的热变化(thermal shift)测定的结果。

[图4] 图4表示B5209B小鼠scFv-mcSA414(SA)的表达载体的结构。

[图5] 图5表示B5209B scFv-mcSA414通过Ni2＋亲和柱纯化的结果。

[图6] 图6表示通过尺寸排阻色谱将B5209B scFv-mcSA414最终纯化的结果。

[图7] 图7表示B5209B scFv-mcSA414和ROBO1的等温滴定量热测定(ITC)的结果。

[图8] 图8表示B5209B scFv-mcSA414和生物素的等温滴定量热测定(ITC)的结果。

[图9] 图9表示B5209B scFv-mcSA414的差示扫描量热测定(DSC)的结果。

具体实施方式

以下对本发明进行更具体的说明。

本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的特征在于，在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中，具有规定的氨基酸的突变，与野生型链霉抗生物素蛋白相比免疫原性降低。

野生型(天然)的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列在序列表的序列编号2中示出，编码它的碱基序列在序列表的序列编号1中示出。

根据第一方式，本发明的链霉抗生物素蛋白突变体含有如下形成的氨基酸序列，在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中：(a)第72位氨基酸残基的精氨酸置换为其它的氨基酸，且(b)第10位氨基酸残基的酪氨酸、第71位氨基酸残基的酪氨酸、第89位氨基酸残基的谷氨酸、第91位氨基酸残基的精氨酸、和第104位氨基酸残基的谷氨酸中的任意一个以上置换为其它的氨基酸。

根据第二方式，本发明的链霉抗生物素蛋白突变体含有在序列编号2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的氨基酸序列中具有以下任意一个以上的突变的氨基酸序列：

(1) 第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为丝氨酸或苏氨酸的突变，

(2) 第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为丙氨酸或丝氨酸的突变，

(3) 第72位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，

(4) 第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为天冬氨酸的突变，

(5) 第91位氨基酸残基的精氨酸置换为赖氨酸的突变，

(6) 第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为谷氨酰胺或天冬酰胺的突变。

在第10位氨基酸残基的酪氨酸置换为其它的氨基酸的情况下，作为其它的氨基酸的具体例，可以举出甘氨酸、丝氨酸或苏氨酸，特别优选地，可以举出丝氨酸或苏氨酸。

在第71位氨基酸残基的酪氨酸置换为其它的氨基酸的情况下，作为其它的氨基酸的具体例，可以举出甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸，特别优选地，可以举出丙氨酸或丝氨酸。

在第72位氨基酸残基的精氨酸置换为其它的氨基酸的情况下，作为其它的氨基酸的具体例，可以举出甘氨酸或赖氨酸，特别优选地，可以举出赖氨酸。

在第89位氨基酸残基的谷氨酸置换为其它的氨基酸的情况下，作为其它的氨基酸的具体例，可以举出甘氨酸、丙氨酸或天冬氨酸，特别优选地，可以举出天冬氨酸。

在第91位氨基酸残基的精氨酸置换为其它的氨基酸的情况下，作为其它的氨基酸的具体例，可以举出甘氨酸或赖氨酸，特别优选地，可以举出赖氨酸。

在第104位氨基酸残基的谷氨酸置换为其它的氨基酸的情况下，作为其它的氨基酸的具体例，可以举出丝氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺，特别优选地，可以举出谷氨酰胺或天冬酰胺。

本发明中所称的与野生型链霉抗生物素蛋白相比免疫原性降低指的是，在将链霉抗生物素蛋白突变体给予人等哺乳动物的情况下免疫原性降低。例如，可以用以下的方法确认免疫原性降低。即，对于本发明的突变体链霉抗生物素蛋白，使用野生型链霉抗生物素蛋白免疫食蟹猴，分析对于得到的抗链霉抗生物素蛋白抗血清的反应性，若对于上述抗链霉抗生物素蛋白抗血清的反应性与野生型链霉抗生物素蛋白相比降低，则可以判断与野生型链霉抗生物素蛋白相比免疫原性降低。在用上述方法判断免疫原性降低的情况下，与野生型链霉抗生物素蛋白相比，本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的免疫原性优选降低为80%以下，进一步优选降低为60%以下，进一步优选降低为20%以下，进一步优选降低为15%以下，进一步优选降低为10%以下，特别优选降低为5%以下。

根据本发明，进一步提供编码上述本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的DNA。本发明的DNA可以通过对编码野生型(天然)链霉抗生物素蛋白的DNA进行位点定向诱变来制备。

编码上述本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的DNA可以整合到载体中来使用。特别地，为了制备本发明的链霉抗生物素蛋白突变体，将编码本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的DNA整合到表达载体中，将该表达载体转化到宿主中，由此可以表达本发明的链霉抗生物素蛋白突变体。

在以大肠杆菌作为宿主的情况下，作为本发明中使用的载体，优选具有复制起点(ori)，进一步具有用于选择所转化的宿主的基因(例如对于氨苄青霉素、四环素、卡那霉素或氯霉素等药物的耐药性基因等)。此外，在表达载体的情况下，优选具有可以在宿主中有效地表达本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的启动子，例如IacZ启动子或T7启动子等。作为这种载体，作为载体的例子，可以举出M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1(ファルマシア)、“QIAexpress系统”(キアゲン)、pEGFP、或pET(此时，宿主优选使用表达T7 RNA聚合酶的BL21)等。此外，在载体中也可以附加用于提高本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的产量的信号序列等。

载体向宿主细胞的导入例如可以使用氯化钙法、电穿孔法来进行。此外，可以附加编码用于提高可溶性的标签，例如谷胱甘肽-S-转移酶、硫氧还蛋白、麦芽糖结合蛋白质的序列。此外，也可以附加编码以容易纯化作为目的而设计的标签，例如多组氨酸标签、Myc表位、血凝素(HA)表位、T7表位、Xpress标签、FLAG肽标签、其它公知的标签序列的序列。

除了大肠杆菌之外，可以举出来源于哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(インビトロゲン社制)、pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8)、来源于昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(ギブコBRL社制)、pBacPAK8)、来源于植物的表达载体(例如pMH1、pMH2)、来源于动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、来源于逆转录病毒的表达载体(例如pZIPneo)、来源于酵母的表达载体(例如“毕赤酵母表达试剂盒(Pichia Expression Kit)”(インビトロゲン社制)、pNV11、SP-Q01)、来源于枯草菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)。

在以CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中的表达为目的的情况下，具有用于细胞内表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan等人, Nature (1979) 277, 108)、MMLV-LTR启动子、EF1α启动子(Mizushima等人, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、CMV启动子等是不可欠缺的，若具有用于选择向细胞的转化的基因(例如通过药物(新霉素、G418等)可以判别的耐药性基因)则进一步优选。作为具有这种特性的载体，可以举出例如pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。

对导入了载体的宿主细胞不作特别限定，其可以为原核生物和真核生物中的任意一种。例如可以使用大肠杆菌、各种动物细胞等。

在使用真核细胞的情况下，宿主例如可以使用动物细胞、植物细胞、真菌细胞。作为动物细胞，可以使用诸如CHO细胞、COS细胞、3T3细胞、HeLa细胞、Vero细胞的哺乳类细胞，或诸如Sf9、Sf21、Tn5等昆虫细胞。在动物细胞中，在以大量表达为目的的情况下，特别优选CHO细胞。载体向宿主细胞的导入例如可以通过磷酸钙法、DEAE葡聚糖法、使用阳离子脂质体DOTAP(ベーリンガーマンハイム社制)的方法、电穿孔法、脂转染法等方法来进行。

作为植物细胞，例如来源于烟草(Nicotiana tabacum)的细胞作为蛋白质生产系统是已知的，可以将其进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，酵母、例如酵母属(Saccharomyces)、例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，丝状菌、例如曲霉属(Aspergillus)、例如黑曲霉(Aspergillus Niger)是已知的。

在使用原核细胞的情况下，可以举出大肠杆菌(E. coli)，例如JM109、DH5α、HB101等，此外枯草杆菌是已知的。

通过本发明的DNA转化这些细胞，将所转化的细胞在体外培养，由此得到本发明的链霉抗生物素蛋白突变体。培养可以根据公知的方法进行。例如作为动物细胞的培养液，例如可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此时，也可以并用胎牛血清(FCS)等血清补充液，也可以进行无血清培养。培养时的pH优选约为6～8。培养通常在约30～40℃下进行约15～200小时，根据需要附加培养基的更换、通气、搅拌。此外，可以添加用于促进细胞的增殖的生长因子。

进一步地，根据本发明，提供通过将抗体结合于本发明的链霉抗生物素蛋白突变体而得到的链霉抗生物素蛋白突变体-抗体结合物、以及含有链霉抗生物素蛋白突变体-抗体结合物的治疗剂或诊断剂。进一步地，可以将上述链霉抗生物素蛋白突变体-抗体结合物与用对于链霉抗生物素蛋白具有亲和性的生物素或其衍生物标记的诊断用或治疗用物质组合，提供为治疗或诊断试剂盒。

即，本发明中，制备癌抗原特异性抗体分子与本发明的链霉抗生物素蛋白突变体的融合体，给予患者，由此可以对于癌细胞特异性地聚集本发明的链霉抗生物素蛋白突变体。接着，将与对于链霉抗生物素蛋白具有亲和性的生物素或其衍生物结合的诊断用或治疗用物质(放射性同位素、低分子化合物、蛋白质等)给予患者，由此可以准确地使物质向癌细胞聚集。本发明中，通过低免疫原性化，抗体产生得到抑制，可以防止由于抗体所导致的早期从体内清除、过敏反应等休克。

与链霉抗生物素蛋白突变体结合的抗体可以使用各种分子。可以使用多克隆抗体、单克隆抗体中的任意一种。对抗体的亚型不特别限定，优选使用IgG，特别适合使用IgG₁。此外，“抗体”含有全部的改变抗体和抗体片段。可以举出人化抗体、人型抗体、人抗体，来源于小鼠、兔、大鼠、豚鼠、猴等各种动物的抗体，人抗体与来源于各种动物的抗体的嵌合抗体，双抗体、scFv、Fd、Fab、Fab’、F(ab)’₂，但是不限于此。

链霉抗生物素蛋白突变体与抗体的结合物可以使用本领域技术人员公知的方法得到。例如，可以通过化学结合方法(US5,608,060)得到，也可以通过将编码链霉抗生物素蛋白突变体的DNA与编码抗体的DNA连接、使用表达载体等在宿主细胞表达而作为融合蛋白得到。编码链霉抗生物素蛋白突变体的DNA与编码抗体的DNA的连接可以通过编码称为接头的适当的肽的DNA进行。期望的是，保留抗体与靶分子的特异结合力来制备链霉抗生物素蛋白突变体-抗体结合物。

通过以下的实施例对本发明进行具体的说明，但是本发明不被实施例所限定。

实施例

实施例1：低免疫原性链霉抗生物素蛋白的设计

基于序列编号1和2中记载的核心链霉抗生物素蛋白的基因序列和氨基酸序列，对具有满足以下条件的突变的突变体链霉抗生物素蛋白的序列进行研究，设计了具有表1中记载的突变的突变体链霉抗生物素蛋白。

(1) 预测与抗体的融合蛋白在人体内免疫原性尽可能减小的序列，

(2) 尽可能维持对于生物素分子的高亲和力的序列。

[表1]

表1：突变一览表

。

表1中的Y22对应于序列表的序列编号2中记载的氨基酸序列中的第10位氨基酸残基的酪氨酸。表1中的Y22S表示由上述酪氨酸置换为丝氨酸，表1中的Y22T表示由上述酪氨酸置换为苏氨酸。

表1中的Y83对应于序列表的序列编号2中记载的氨基酸序列中的第71位氨基酸残基的酪氨酸。表1中的Y83A表示由上述酪氨酸置换为丙氨酸，表1中的Y83S表示由上述酪氨酸置换为丝氨酸。

表1中的R84对应于序列表的序列编号2中记载的氨基酸序列中的第72位氨基酸残基的精氨酸。表1中的R84K表示由上述精氨酸置换为赖氨酸。

表1中的E101对应于序列表的序列编号2中记载的氨基酸序列中的第89位氨基酸残基的谷氨酸。表1中的E101D表示由上述谷氨酸置换为天冬氨酸。

表1中的R103对应于序列表的序列编号2中记载的氨基酸序列中的第91位氨基酸残基的精氨酸。表1中的R103K表示由上述精氨酸置换为赖氨酸。

表1中的E116对应于序列表的序列编号2中记载的氨基酸序列中的第104位氨基酸残基的谷氨酸。表1中的E116N表示由上述谷氨酸置换为天冬酰胺，表1中的E116Q表示由上述谷氨酸置换为谷氨酰胺。

实施例2：突变体链霉抗生物素蛋白的制备

(1) 野生型核心链霉抗生物素蛋白的碱基序列的合成

利用人工基因合成(Integrated DNA Technologies公司)的服务产生编码序列表的序列编号1所示的核心链霉抗生物素蛋白的基因的碱基序列。

(2) 表达载体的构建

以上述序列作为模板，使用通过PCR在5’端侧附加HindIII位点、在3’端侧附加EcoRI位点的下述引物1和2，进行PCR后，用限制酶HindIII、EcoRI进行处理。

引物1：GCTCTTCAAAGCTTTGGCCGAAGCTGGTATCACTG(序列编号3)

引物2：CTCGAGGAATTCTTAGCTAGCAGCAGAAGGCTTAAC(序列编号4)

将限制酶处理过的样品在电泳后进行凝胶纯化。同样地，对于pPAL7载体(BIO-RAD公司制)也实施酶处理，进行凝胶纯化。使用2×快速连接缓冲液(Rapid Ligation Buffer)和T4DNA 聚合酶(都为Promega公司)，通过指定的方法，对纯化了的载体和PCR产物实施连接。大肠杆菌的转化通过对于50微升的DH5α感受态细胞(TOYOBO公司制造)添加2微升的连接产物来实施。使用Miniprep Kit(QIAGEN公司制)实施质粒的提取，通过对得到的质粒的序列分析实施序列的确认。

(3) 突变株的制作

以上述野生型链霉抗生物素蛋白表达载体作为模板，利用位点定向诱变(Site-Directed Mutagenesis)法，通过碱基序列的置换进行密码子序列的变更，并进行氨基酸序列的变换。即，使变更的碱基序列大致成为中心来设计长度为28～30个碱基的互补引物，以野生型链霉抗生物素蛋白表达载体作为模板实施PCR法。然后，用限制酶DpnI切断模板质粒，进行大肠杆菌的转化。

引物：

Y22S Fw: CACTGGCACCTGGTCGAACCAACTGGGGTC　(序列编号5)

Y22T Fw: CACTGGCACCTGGACTAACCAACTGGGGTC　(序列编号6)

E101D FW: CGTTGGCGGTGCTGATGCTCGTATCAACAC　(序列编号7)

R103K FW: GGTGCTGATGCTAAGATCAACACTCAGTGG　(序列编号8)

Y83A FW: GGAAAAACAACGCCCGTAATGCGCACAGCG　(序列编号9)

Y83S FW: GGAAAAACAACTCGCGTAATGCGCACAGCG　(序列编号10)

R84K FW: GAAAAACAACTATAAGAATGCGCACAGCG　(序列编号11)

E116N FW: CATCCGGCACTACCAATGCGAATGCATGG　(序列编号12)

E160Q FW: CATCCGGCACTACCCAAGCGAATGCATGG　(序列编号13)。

(4) 重组蛋白质的表达

将整合了野生型链霉抗生物素蛋白和突变体链霉抗生物素蛋白的基因序列的pPAL7表达载体根据常规方法转染到大肠杆菌BL21(BIO-RAD公司)中。各蛋白质的表达如下实施。即，在37度下进行培养直至大肠杆菌培养液的细胞密度为OD(600nm)0.5～0.7，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyanoside)以使其最终浓度为1mM，诱导蛋白质表达，在20度下进行24小时的培养。培养24小时后，通过对菌体进行离心分离而收集细胞，在-20度下保存直至蛋白质纯化。

(5) 重组蛋白质的纯化

重组蛋白质的纯化使用Profinity eXact Protein Purification System(BIO-RAD公司制)的方法实施。以培养容量的1/20添加BugBuster(Novagen公司)，进行细胞的溶解。将离心分离后上清作为总可溶性蛋白质。根据Profinity eXact Mini Spin Columns(BIO-RAD)的用法容量处理所回收的可溶性级分。使用10～20%レディーゲルJ(BIO-RAD公司制)，对总可溶性蛋白质、柱通过级分、洗涤级分、洗脱级分进行SDS-PAGE电泳。电泳后，将蛋白质用SimplyBlue SafeStain(Invitrogen公司制)染色，实施纯化纯度的确认。

实施例3：食蟹猴抗链霉抗生物素蛋白抗血清的制备

对于食蟹猴，每次给予1毫克的重组链霉抗生物素蛋白(PIERCE公司制)，以2周为间隔给予3次。将给予前采血作为第1天(Day1)，在第8、15、29、36、50、57天实施给予(イナリサーチ株式会社)。

实施例4：蛋白质与生物素的结合性的分析

(1) 使用ビアコア生物传感器进行的蛋白质与生物素的相互作用的动力学分析

ビアコア(注册商标)的生物传感器的配体(粘贴在传感器芯片上的物质)为抗小鼠IgG抗体(GEヘルスケアバイオサイエンス社制)。另一方面，作为分析物(在流路系统中流通的物质)，制备生物素化的小鼠抗体和各种链霉抗生物素蛋白突变体，通过Biacore(注册商标)3000(以表面等离振子共振为原理的生物传感器、GEヘルスケアバイオサイエンス社制)进行分子间相互作用的分析。将抗小鼠IgG抗体通过胺偶联法固定化在CM5传感器芯片的全部流通池(flow cell)上。各流通池的固定化量为8000RU。接着，作为参考用，将非生物素化小鼠抗体捕获到流通池1和3中，将生物素化小鼠抗体捕获到流通池2和4中。将各种链霉抗生物素蛋白在1和2或3和4中以流速20微升/分钟负载到运行缓冲液(HBS-EP、GEヘルスケアバイオサイエンス社制)中2分钟。然后，监控样品的解离7分钟。然后，用10mM甘氨酸盐酸缓冲液、pH1.7(GEヘルスケアバイオサイエンス社制)进行再生操作，实施重复测定。使用分析软件BIAevalution ver.4.1，使用1:1结合模型，由得到的传感图进行反应速度论的分析，计算结合速度常数(k_a)和解离速度常数(k_d)。解离常数(K_d)由k_d/k_a求出。

通过Biacore(注册商标)3000(以表面等离振子共振为原理的生物传感器、GEヘルスケアバイオサイエンス社制)进行的重组链霉抗生物素蛋白与生物素的分子间相互作用的动力学分析结果如表2所示。

[表2]

表2：链霉抗生物素蛋白变体与生物素的相互作用动力学

。

得到的链霉抗生物素蛋白变体的解离常数为10^－10M的数量级，与此次我们测定到的野生型链霉抗生物素蛋白的解离常数为相同的数量级。由该结果可知，链霉抗生物素蛋白变体为与野生型同样地与生物素具有非常高的亲和性的蛋白质。认为可以将其应用于现在广泛应用的链霉抗生物素蛋白·生物素技术中。

(2) 使用ビアコア生物传感器进行的蛋白质与食蟹猴抗血清的相互作用分析

ビアコア(注册商标)的生物传感器的配体(粘贴在传感器芯片上的物质)为Amine-PEG₃-Biotin(Thermo SCIENTIFIC)和各种链霉抗生物素蛋白变体。另一方面，作为分析物(在流路系统中流通的物质)，制备用运行缓冲液(HBS-EP、GEヘルスケアバイオサイエンス社制)稀释20倍的食蟹猴抗血清，通过Biacore(注册商标)3000(以表面等离振子共振为原理的生物传感器、GEヘルスケアバイオサイエンス社制)进行分子间相互作用的分析。将Amine-PEG₃-Biotin(Thermo SCIENTIFIC)通过胺偶联法固定化在CM5传感器芯片的全部流通池上。各流通池的固定化量的平均值为160RU。接着，流通池2流通野生型链霉抗生物素蛋白，流通池3、4分别流通各种的2种链霉抗生物素蛋白变体，通过与生物素的结合反应进行固定化。以流通池1作为参考。

将稀释的食蟹猴抗血清设定为测定温度37度，以5微升/分钟负载到运行缓冲液(HBS-EP、GEヘルスケアバイオサイエンス社制)中2分钟。然后，监控样品的解离7分钟。然后，用10mM甘氨酸盐酸缓冲液、pH1.7(GEヘルスケアバイオサイエンス社制)进行再生操作，实施重复测定。使用分析软件BIAevalution ver.4.1，由得到的传感图(图1)导出链霉抗生物素蛋白变体的结合量、抗血清的反应量，用与各流通池结合的链霉抗生物素蛋白的量进行标准化，比较抗血清的反应。即，通过下式得出数值并制成图(图2)：(抗血清的反应后的值－反应前的值)/链霉抗生物素蛋白的结合量。

实施例5：在计算机芯片上进行的链霉抗生物素蛋白的免疫原性的分析

利用Epibase T-细胞表位谱分析服务(Algonomics公司)，在计算机芯片上对于野生型链霉抗生物素蛋白、mcSA072、mcSA040、mcSA314、mcSA414实施免疫原性(immunogenicity)的分析(Desmet, (2005), Proteins, 58, 53-69; ES126528)。预测中使用的同种异型选择在高加索人(Caucasian)、东方人(Oriental)、印欧人(Indo-European)、美国黑人(Afro-American) 和西非人(West African)、南太平洋群岛人(Austronesian)、混血人(Mestizo)中出现频率为30%以上的那些。对于各同种异型，利用结晶结构或基于结晶结构模型化的最近的结构，使用含有独自侧链的配置方法的方法(Desmet, (2002), Proteins, 48, 31-34)。接着计算受体与靶肽的结合自由能，基于该结合力的强度进行抗原性强度的分类(Kapoerchan, (2009), Mol. Immunol. 47(5), 1091-1097)。

对于37种DRB1、8种DRB3/4/5、23种DQ、10种DP、总计78种的HLA II类受体进行同种异型水平的谱分析，结果在表3、表4中示出。由表示决定性表位的数目的表3可知，野生型链霉抗生物素蛋白的DBR1表位最少，而DRB3/4/5表位最多，另一方面，mcSA314、mcSA414的DP表位消失，而DQ表位增加。由总结有影响的同种异型的表4可知，与其它的蛋白质相比，mcSA314、mcSA414的表位的数目减少。由这些结果可知，免疫原性的预测结果为mcSA314＜mcSA414＜野生型链霉抗生物素蛋白的顺序(左边的免疫原性低)。

[表3]

表3：在计算机芯片上进行的T细胞表位测定(Epibase)的结果

。

[表4]

表4：在计算机芯片上进行的T细胞表位测定(Epibase)的结果

。

实施例6：链霉抗生物素蛋白的蛋白质热稳定性评价

对于根据实施例2制备的以下5种蛋白质实施热变化测定：天然型链霉抗生物素蛋白、mcSA040、mcSA072、mcSA314、mcSA414(Vedadi, (2006), Proc Natl Sci USA., 103(43), 15835-15840)。在实时PCR用管(PCR Tube Strip, Flat Cap Strip, BIO-RAD公司制)中制备样品以使各样品的最终浓度如下所述。将SYPRO Orange稀释5000倍，使各蛋白质为10μM，缓冲液为1×PBS。此外，以加速蛋白质的热变性为目的，将甘氨酸盐酸溶液的浓度制备成终浓度0M、0.5M、1M、2M。以反应体积20μl进行。测定装置使用CFX96实时PCR检测系统(BIO-RAD公司制)。CFX96实时PCR检测系统的程序模式使用FRET检测用模式，以温度上升为每10秒上升0.5℃的程序进行反应以及检测。

对热变化分析的结果进行分析，分析结果是，改变了的链霉抗生物素蛋白、mcSA040、mcSA072、mcSA314、mcSA414在100℃下表现出与天然型链霉抗生物素蛋白同等的热稳定性(图3)。由此暗示上述突变使免疫原性降低，但是对热稳定性无影响。

实施例7：改变单克隆抗体的制备

(1) 由杂交瘤细胞制备总RNA

作为产生单克隆抗体B5209B(IgG2b)的杂交瘤细胞，使用日本特开2008-290996号公报中记载的产生单克隆抗体B5209B的杂交瘤。该产生单克隆抗体B5209B的杂交瘤以保藏号FERM P-21238于2007年(平成19年)3月2日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所 专利生物保藏中心(日本国茨城县筑波市东1-1-1中央第6号(邮政编码305-8566))，进而以保藏号FERM BP-10921于2007年(平成19年)10月16日移交国际保藏。

将1×10⁷个上述产生单克隆抗体B5209B(IgG2b)的杂交瘤细胞用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤一次后，向细胞沉淀中加入Trizol液(Invitrogen公司制)1ml，进行可溶化。使提取液通过20G注射针2次切断DNA后，根据Trizol液附属的说明书通过氯仿抽提、异丙醇沉淀、80%乙醇洗涤来纯化总RNA，将其溶解在含有焦碳酸二乙酯的灭菌蒸馏水中。通过琼脂糖凝胶电泳确认得到的总RNA未分解。

(2) IgG重链V区(VH)cDNA的合成和克隆

以5μg B5209B 总RNA 作为模板，作为3’-引物，基于小鼠IgG2b 重链C区5’端的cDNA序列使用引物(5’-ccaagcttaggggccagtggatagactg-3’)(序列编号14)，使用SuperScript cDNA合成试剂盒(Invitrogen公司制)，根据试剂盒的说明书，合成第一链cDNA。向得到的第一链cDNA中加入Novagen公司小鼠Ig-引物组(Mouse Ig-Primer Set)的MuIgVH5’-A引物，使用高保真PCR体系(Expand High Fidelity PCR System)(Roche Diagnostics公司制)扩增双链cDNA。将得到的双链cDNA通过TA克隆法亚克隆到pGEM-T载体(Promega公司制)中，导入到大肠杆菌DH5α中，得到含有质粒的载体。将与6个克隆有关的质粒DNA用Qiagen Plasmid Midi Kit(Qiagen公司制)纯化，根据常规方法确定DNA碱基序列。鉴定出抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列为序列编号16记载的氨基酸序列中从第1位到第122位的氨基酸序列。

(3) 抗ROBO1单克隆抗体B5209B的IgG 轻链N末端氨基酸序列的确定

使用蛋白G柱(GE Healthcare公司制)，根据所附的说明书，由含有单克隆抗体B5209B(IgG2b)的杂交瘤无血清培养上清进行抗体的纯化。

使用SDS-PAGE对纯化的单克隆抗体B5209B进行电泳。将电泳凝胶转移到PVDF膜后，进行考马斯染色。切出所染色的IgG轻链的带，通过Edman降解法确定N末端氨基酸序列(DIQMT)。

(4) B5209B小鼠-scFv-mcSA414的表达载体的构建(图4)

构建具有图4记载的结构的B5209B小鼠-scFv-mcSA414的表达载体。该表达载体中的B5209B小鼠-scFv-SA的碱基序列在序列编号15中记载，氨基酸序列在序列编号16中记载。抗体的重链可变区(VH)的氨基酸序列对应于序列编号16中第1位到第122位的氨基酸序列，抗体的轻链可变区(VL)的氨基酸序列对应于序列编号16中记载的氨基酸序列中第142位到第248位的氨基酸序列，

(5) B5209B小鼠-scFv-mcSA414的培养方法

转化大肠杆菌BL21(DE3)，用含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基，在28℃条件下培养20小时左右。从平板挑取单个菌落，将其接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的LB实验培养基(3mL)中之后，在28℃下振荡培养(140rpm左右)18小时左右。然后，在含有50μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基(1L)中对前培养液的全部量进行传代培养，在28℃下振荡培养(125rpm)。在OD600=0.8的时点添加终浓度0.5mM的IPTG，由此进行表达诱导，接着培养一夜。

(6) B5209B小鼠-scFv-mcSA414的制备法

从菌体内可用性级分回收目的蛋白质，通过Ni2＋亲和柱HisTrap HP(GE Healthcare公司制)进行粗纯化。此时，流动相使用50mM Tris-HCl、200mM NaCl、pH 8.0缓冲液，使用50mM Tris-HCl、200mM NaCl、500mM咪唑、pH 8.0缓冲液阶段性地进行洗脱(图5)。回收目的蛋白质洗脱级分，用50mM Tris-HCl、200 mM NaCl、pH 8.0缓冲液透析后，通过尺寸排阻色谱进行最终纯化。所使用的柱是HiLoad 26/60 Superdex 200(GE Healthcare)，流动相使用50mM Tris-HCl、200 mM NaCl、pH 8.0缓冲液。通过SDS-PAGE确认最终纯化产物。通过尺寸排阻色谱进行的最终纯化和SDS-PAGE的结果在图6中示出。

实施例8：B5209B小鼠-scFv-mcSA414的活性评价

(1) 与ROBO1的结合性

通过等温滴定量热测定(ITC)，进行有关B5209B小鼠-scFv-mcSA414与ROBO1的相互作用的热力学分析。图7表示使用PBS为溶剂，在25℃条件下，对于B5209B小鼠-scFv-mcSA414(3.7μM)，每次滴加一定量ROBO1时的测定结果。

由此算出的解离常数为3.3×10^－8(1/M)，焓变化量(ΔH)为－16.1kJ/mol，此外熵变化量(ΔS)为－22 J/mol·K。若与scFv相比，则ΔH未发现显著变化。另一方面，ΔS降低1/40左右，亲和性方面发现大致一位数左右的降低。进一步地，在结合比方面，暗示对于B5209B小鼠-scFv-mcSA414 4聚物结合2分子的ROBO1，认为有可能4聚物中邻接的2个抗原结合部位由于位阻而只有1个能够识别ROBO1。

(2) 小鼠-scFv-mcSA414与生物素的结合性评价

通过等温滴定量热测定(ITC)，对B5209B小鼠-scFv-mcSA414与生物素的结合活性进行评价。图8表示使用PBS为溶剂，在25℃条件下，对于B5209B小鼠-scFv-SA(9μM)，每次滴加一定量生物素(90μM)时的测定结果。

由此算出的解离常数为5.6×10^－8(1/M)，焓变化量(ΔH)为－25.5kJ/mol，此外熵变化量(ΔS)为检测限以下。

(3) 小鼠-scFv-mcSA414的热稳定性评价

通过差示扫描量热测定(DSC)，对B5209B小鼠-scFv-mcSA414的热稳定性进行评价。此时的结果在图9中示出。溶剂使用PBS。B5209B小鼠-scFv的热稳定性为50℃附近，因此推测，B5209B小鼠-scFv-SA的scFv结构域的变性温度为Tm 51.4℃，1分子的完全变性温度为Tm 108℃。此外，未检出链霉抗生物素蛋白结构域4聚物解离温度，因此推测，中途4聚物未解离而完全变性。

序列表

<110>  Perseus Proteomics Inc.

<120>  低免疫原性链霉抗生物素蛋白及其应用

<130>  101018A　

<160>  16

<210>  1

<211>  381

<212>  DNA

<213>  阿维丁氏链霉菌

<220>

<221>  CDS

<222>  (1)..(381)

<400>  1

gcc gaa gct ggt atc act ggc acc tgg tat aac caa ctg ggg tcg act         48

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr          

1               5                   10                  15               

ttc att gtg acc gct ggt gcg gac gga gct ctg act ggc acc tac gaa         96

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu          

            20                  25                  30                   

tct gcg gtt ggt aac gca gaa tcc cgc tac gta ctg act ggc cgt tat        144

Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr           

        35                  40                  45                       

gac tct gca cct gcc acc gat ggc tct ggt acc gct ctg ggc tgg act        192

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr          

    50                  55                  60                           

gtg gct tgg aaa aac aac tat cgt aat gcg cac agc gcc act acg tgg        240

Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp          

65                  70                  75                  80           

tct ggc caa tac gtt ggc ggt gct gag gct cgt atc aac act cag tgg        288

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp          

                85                  90                  95               

ctg tta aca tcc ggc act acc gaa gcg aat gca tgg aaa tcg aca cta        336

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu          

            100                 105                 110                  

gta ggt cat gac acc ttt acc aaa gtt aag cct tct gct gct agc            381

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser              

        115                 120                 125                      

<210>  2

<211>  127

<212>  PRT

<213>  阿维丁氏链霉菌

<400>  2

Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr

1               5                   10                  15     

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

            20                  25                  30         

Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

        35                  40                  45             

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

    50                  55                  60                 

Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65                  70                  75                  80 

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp

                85                  90                  95     

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

            100                 105                 110        

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

        115                 120                 125        

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 3

gctcttcaaa gctttggccg aagctggtat cactg　         35

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 4

ctcgaggaat tcttagctag cagcagaagg cttaac          36

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 5

cactggcacc tggtcgaacc aactggggtc　               30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 6

cactggcacc tggactaacc aactggggtc　               30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 7

cgttggcggt gctgatgctc gtatcaacac　               30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 8

ggtgctgatg ctaagatcaa cactcagtgg　               30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 9

ggaaaaacaa cgcccgtaat gcgcacagcg　               30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 10

ggaaaaacaa ctcgcgtaat gcgcacagcg　               30

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 11

gaaaaacaac tataagaatg cgcacagcg　                29

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 12

catccggcac taccaatgcg aatgcatgg　                29

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 13

catccggcac tacccaagcg aatgcatgg　                29

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述：合成DNA

<400> 14

ccaagcttag gggccagtgg atagactg                   28

<210>  15

<211>  1191

<212>  DNA

<213>  小鼠

<220>

<221>  CDS

<222>  (1)..(1191)

<400>  15

atg gcc gag gtg caa ttg gtg gag tct ggg gga ggc gta gtg cag cct         48

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro          

1               5                   10                  15               

gga ggg tcc ctg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc agt         96

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser          

            20                  25                  30                   

acc tat gac atg tct tgg gtt cgc cag act cca gac aag agg ctg gag        144

Thr Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu          

        35                  40                  45                       

ttg gtc gca acc att aat agt aat ggt ggt agt acc tat tat cca gac        192

Leu Val Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp          

    50                  55                  60                           

agt gtg aag ggc cga ttc acc agt tcc aga gac aat gcc aag aac atc        240

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ser Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile          

65                  70                  75                  80           

ctg tac ctg caa atg agc agt ctg aag tct gag gac aca gcc atg tat        288

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr          

                85                  90                  95               

tac tgt gca aga gag gca tta cta cgg ccc cct tac tat gct ttg gac        336

Tyr Cys Ala Arg Glu Ala Leu Leu Arg Pro Pro Tyr Tyr Ala Leu Asp          

            100                 105                 110                  

tac tgg ggt cag gga acc tca gtc acc gtc tcc tcg gcc ggc ggg ggc        384

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly          

        115                 120                 125                      

ggt agc ggc ggt ggc ggg tcg ggc ggt ggc gga tcg gat atc ctc gat        432

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Asp          

    130                 135                 140                           

att cag atg acc cag tct cca gct tca ctg tct gca tct gtg gga gaa        480

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu          

145                 150                 155                 160          

act gtc acc atc aca tgt gga gca agt gag aat att tac ggt gct tta        528

Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala Leu          

                165                 170                 175              

act tgg tat cag cgg aaa cag gga aaa tct cct cag ctc ctg atc tat        576

Thr Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr          

            180                 185                 190                  

ggt gca atc aat ttg gca gat gac aag tca tcg agg ttc agt ggc agt        624

Gly Ala Ile Asn Leu Ala Asp Asp Lys Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser          

        195                 200                 205                      

gga tct ggt aga cag tat tct ctc aag atc agt agc ctg cat cct gac        672

Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro Asp          

    210                 215                 220                          

gat gtt gca acg tat tac tgt caa aat gtg tta agt act cca ttc acg        720

Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Phe Thr           

225                 230                 235                 240          

ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa gcc gcg ggt tct tct ggt        768

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Ala Gly Ser Ser Gly          

                245                 250                 255              

tct ggt tct gcg gcg gaa gct ggt atc act ggc acc tgg tcg aac caa        816

Ser Gly Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Ser Asn Gln          

            260                 265                 270                   

ctg ggg tcg act ttc att gtg acc gct ggt gcg gac gga gct ctg act        864

Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr          

        275                 280                 285                      

ggc acc tac gaa tct gcg gtt ggt aac gca gaa tcc cgc tac gta ctg        912

Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu          

    290                 295                 300                          

act ggc cgt tat gac tct gca cct gcc acc gat ggc tct ggt acc gct        960

Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala          

305                 310                 315                 320          

ctg ggc tgg act gtg gct tgg aaa aac aac tcc aag aat gcg cac agc       1008

Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Ser Lys Asn Ala His Ser          

                325                 330                 335              

gcc act acg tgg tct ggc caa tac gtt ggc ggt gct gat gct aag atc       1056

Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Asp Ala Lys Ile          

            340                 345                 350                  

aac act cag tgg ctg tta aca tcc ggc act acc cag gcg aat gca tgg       1104

Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Gln Ala Asn Ala Trp          

        355                 360                 365                      

aaa tcg aca cta gta ggt cat gac acc ttt acc aaa gtt aag cct tct       1152

Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser          

    370                 375                 380                          

gct gct agc ggg gcc cgt cac cat cat cac cac cat taa                   1191

Ala Ala Ser Gly Ala Arg His His His His His His                          

385                 390                 395                               

<210>  16

<211>  396

<212>  PRT

<213>  小鼠

<400>  16

Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro

1               5                   10                  15     

Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

            20                  25                  30         

Thr Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu

        35                  40                  45             

Leu Val Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp

    50                  55                  60                 

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ser Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile

65                  70                  75                  80 

Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr

                85                  90                  95     

Tyr Cys Ala Arg Glu Ala Leu Leu Arg Pro Pro Tyr Tyr Ala Leu Asp

            100                 105                 110        

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly

        115                 120                 125            

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Asp

    130                 135                 140                

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Glu

145                 150                 155                 160

Thr Val Thr Ile Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Ala Leu

                165                 170                 175    

Thr Trp Tyr Gln Arg Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr

            180                 185                 190        

Gly Ala Ile Asn Leu Ala Asp Asp Lys Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser

        195                 200                 205            

Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Leu His Pro Asp

    210                 215                 220                

Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Val Leu Ser Thr Pro Phe Thr

225                 230                 235                 240

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala Ala Gly Ser Ser Gly

                245                 250                 255    

Ser Gly Ser Ala Ala Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Ser Asn Gln

            260                 265                 270        

Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr

        275                 280                 285            

Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu

    290                 295                 300                

Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala

305                 310                 315                 320

Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Ser Lys Asn Ala His Ser

                325                 330                 335    

Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Asp Ala Lys Ile

            340                 345                 350        

Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Gln Ala Asn Ala Trp

        355                 360                 365            

Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser

    370                 375                 380                

Ala Ala Ser Gly Ala Arg His His His His His His

385                 390                 395