调节开花时间的核苷酸序列的用途,表达它的植物以及其生产方法

摘要

本发明涉及编码单细胞绿藻，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhartii)的氨基酸序列的核苷酸序列，其在来自有花植物的植物细胞中表达。序列的表达被用于改变包含转染的植物细胞的植物的开花时间。此外，本发明涉及生产本发明的细胞和/或植物的方法。

说明书

本发明涉及编码单细胞绿藻，莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) 的氨基酸序列的核苷酸序列，其在来自有花植物的植物细胞中表达。序列 的表达被用于改变包含转染的植物细胞的植物的开花时间。此外，本发明涉 及生产本发明的细胞和/或植物的方法。

现有技术

花转变(floral transition)是植物的关键发育过程，因为它们繁殖的时 间决定了个体和它的后代的成就。为了触发花转变，植物必需协调对各种 外部和内部信号的应答，以能够诱导一些基因的表达，这些基因诱导顶端 分生组织从营养性到生殖性的转变(et al.，2006.Cell 125：655-664)。 在转录和翻译后水平上CONSTANS(CO)的控制对于光周期性是关键的， 这是调节花转变的最保守的途径之一(Kobayashi and Weigel.2007.Genes  Dev.21：2371-2384)。

在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中CO的转录作用受到昼夜 节律钟和光周期的控制，与冬季的短日照下相比，在夏季的长日照的白天， 其诱导更丰富的CO的信使RNA(Suárez-López et al.，2001.Nature 410： 116-1120)。CO转录产物水平的这些季节和昼夜节律受到遗传途径的调节， 所述遗传途径包括基因GIGANTEA、FLAVIN-BINDING、KELCHREPEAT、 F-BOX 1和CYCLIN DOF FACTOR 1(Sawa et al.，2007.Science 318： 261-265)。CO的白天的积累受到光的影响，处在光色素系统的控制下 (Valverde et al.，2004.Science 303：1003-1006)，在夜间通过泛素连接酶 CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1(COP1)的方式由蛋白酶体所 降解，COP1是幼苗的光形态发育的关键调节物(Jang et al.，2008.EMBO J. 27：1277-1288)。CO的降解的这些白天和黑夜的循环，与CO的信使RNA 的昼夜节律和季节调节一起，意味着CO在长日照的夜间期间被活化。活 性的CO产生叶的韧皮部中花整合基因(floral integrators)FT的表达，蛋 白质FT从叶移动到顶端分生组织(Corbesier et al.，2007.Science 316： 1030-1033)。一旦处于顶端分生组织中，FT与转录因子FD一起，诱导花 整合基因APETALA1、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSOR OF CONSTANS 1(SOCl)、LEAFY、以及可能的控制花器官发育的花同源异型基因的表 达。

CO-FT模式广泛分布在显花植物和裸子植物中，构成了开花诱导中最 保守的调节元件之一( et al.，2006.Science 312：1040-1043)。在 所有陆地植物中，包括苔藓小立碗藓属(Physcomitrella)(Zobell et al.，2005. Plant Biol.7：266-275)和石松植物卷柏(Selaginella)(本工作)，存在着 与CO同源的基因(CO-样基因或COL)，但是它们不在细菌、真菌和动物 中存在(Robson et al.，2001.Plant J.28：619-631)。然而，除了高等植物的 某些基因例如水稻中的HEADING DATE 1(HD1)、牵牛花(Pharbitis nil) 中的(PnCO)或近年来甜菜中的那个(BvCOL1)之外，植物的进化路线 的COL基因没有能够补足拟南芥的co突变体并因而显示植物到花期的转 变中的功能。拟南芥的蛋白质COL1与CO具有85％的相似性百分比，不 具有与CO相同的功能，因为它不能补足co突变体(Ledger et al.，2001. Plant J.26：15-22)。以前试图证明在苔藓小立碗藓中存在CO的真实直系 同源物已经失败了(Zobell et al.，2005.Plant Biol.7：266-275)。

莱茵衣藻是单细胞的绿藻，由于它易于转化、健壮的遗传学性、代谢 多面性和其单倍体的基因组，被用作模式生物体，近年来发布了它的完整 序列(Merchant et al.，2007.Science 318：245-251)。某些过程，例如趋光 性、同步生长和淀粉的积累受到衣藻中的昼夜节律钟的调节(Mittag et al.， 2005.Plant Physiol.137：399-409)。在这种和其他绿微藻中，生长在一定光 周期下与细胞周期同步，从而培养物群体的大部分在给定的时刻将由同一 分裂期的细胞构成(Bizova et al.，2005.Plant Physiol.137：475-491)。已知 衣藻(roc66)的突变体展现了相比野生型藻类在它的生长节律中稍微更宽 的周期(Matsuo et al.，2008.Genes Dev.22：918-930)。然而，已经证明的 是，昼夜节律钟允许在衣藻中进入细胞周期(Goto and Johnson，1995.J.Cell  Biol.129：1061-1069)，以及光周期对这种信号以及在另一种微藻 Ostreococcus tauri中细胞周期的进展中也具有巨大影响(Moulager et al.， 2007.Plant Physiol.144：1360-1369)。

将果实的生产提前可以呈现商业上的优势。遗传学工具的研究使得将 开花提前到尽可能靠近生长周期内的特定时间成为可能，因而果实的采集 符合最合适的市场期，意味着试验作物的生产中的增产。

本发明的说明

本发明涉及编码单细胞绿藻莱茵衣藻的氨基酸序列的核苷酸序列，其 被转染到来自有花植物的植物细胞中。基因表达被用于改变包含所述序列 的植物细胞的植物的开花时间。

序列SEQ ID NO：1与拟南芥的蛋白质CONSTANS(CO)的氨基酸 序列具有27％的同一性，与来自植物的其他COL蛋白的同一性在20到 30％之间。这种低同一性没有预先提示与上述蛋白质的功能相关的可能的 用途，特别是要记住，蛋白质例如属于拟南芥的同一基因组的COL1与蛋 白质CO具有85％的同一性，但仍不行使与CO相同的功能，因为看起来 它不能补足CO突变体的拟南芥植物(co植物)中这种蛋白质的功能。

因而，考虑到上述的低同一性百分比，不能推断的是SEQ ID NO：1 在功能上是与CO可比较的，而事实证明，它可以补足co突变体，并且甚 至促进拟南芥中的早开花。进行补足和开花提前诱导的实验所使用的植 物，拟南芥，已经在许多生物技术过程中被用作模式植物，证明获得的结 果可以推广到任何其他植物品种，特别是在植物界中保守的过程，如同通 过蛋白质CO的方式调节开花的情况一样。这种植物的转化已经被用作实 例，因为转化和监视重组基因表达的技术已经被优化。

在本发明中获得的结果不应当引起事后回溯的分析，因为根据SEQ ID NO：1与CO的27％的同一性百分比，我们不会预计到暗示SEQ ID NO： 1用于加快任何植物开花的可能用途的结果，因为只有通过在植物的基因 组中进行该序列的转化我们才能验证它对开花的影响。最后，基因的同一 性不会使得SEQ ID NO：1的功能显而易见。

本发明的序列SEQ ID NO：1的用途在其果实具有商业价值的各种植 物中的应用，可以产生开花的实质上的提前，结果可以提前果实的生产， 提供相比不包含本发明的蛋白质的植物产生的果实商业上的优势。此外， 在植物培育中刺激开花的提前在原理上将使得尝试将开花尽可能紧密地 拉近到生长周期的特定时间内成为可能，从而随后的果实收获符合给定的 地理区域中最合适的市场期。通常，这反映在被测试的作物的生产方面产 量的提高中。

在这一点上，本发明的第一个方面是包含一核苷酸序列的分离的核酸 用于控制植物的开花时间的用途，所述核苷酸序列编码与序列SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列。

序列SEQ ID NO：1是由单细胞藻类莱茵衣藻的基因组中存在的核苷 酸序列编码的氨基酸序列。所述分离的核酸包含至少一个核苷酸序列，所 述核苷酸序列编码与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的序列或编码 SEQ ID NO：1。在本发明的这些方面中，所述分离的核酸可以是编码核 苷酸序列(cDNA)，如同在SEQ ID NO：14的情况下，或是有或者没有 内含子的核苷酸序列，因而包括了编码SEQ ID NO：1的基因组DNA的 序列(在下文中，所述核苷酸序列将被称为：当前发明或本发明的核苷酸 序列)。也就是说，它们包括这样的核酸序列，其转录产物、信使RNA (mRNA)编码相同氨基酸序列(在下文中，当前发明的氨基酸序列或本 发明的氨基酸序列)。来自于本发明的核苷酸序列的变体序列，其产物是 与序列SEQ ID NO：1编码的蛋白质具有相同功能的蛋白质，也被包括在 内。在它们的N-末端、C-末端和/或在某些内部氨基酸位置上具有修饰的 氨基酸序列，从而蛋白质的功能与本发明的核苷酸序列转录的mRNA序 列的翻译产物是相同的，也被包括在内。氨基酸序列可以由任何核苷酸序 列编码所述核苷酸序列产生本发明的任何氨基酸序列。由于遗传密码是简 并的，一个和相同的氨基酸可以由不同的密码子(三联体)编码，因而相 同的氨基酸序列可以由不同的核苷酸序列编码。

与SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的氨基酸序列是其他生物体或 单细胞藻类的同源序列，其中它们编码的蛋白质具有与所述基因编码的蛋 白质相同的功能。同源序列是指来自不同的物种、具有源自共同祖先序列 的相似表型表达的序列。在序列同源性内，在两种类型的同源性：直系同 源和旁系同源之间产生区别。直系同源的序列属于具有共同祖先的物种。 旁系同源序列是在同一生物体中出现的那些，一种来自另一种的副本。本 发明的这个方面中，与氨基酸序列SEQ ID NO：1具有至少90％同一性的 所有同源的序列都被考虑，包括直系同源和旁系同源。类似地，其转录产 物与本发明的氨基酸序列相同的所有的序列都被包括。

优选的实施方式是包含核苷酸序列的分离的核酸的用途，所述核苷酸 序列编码与序列SEQ ID NO：1具有至少50％同一性的绿藻的氨基酸序列。

来自莱茵衣藻的序列SEQ ID NO：1与其他绿藻，例如，但不限于团 藻(Volvox)的氨基酸序列的同一性是约60％，因而本发明的这个实施方 式包括包含核苷酸序列的任何分离的核酸，所述核苷酸序列编码具有与序 列SEQ ID NO：1至少50％同一性、来自绿藻的氨基酸序列。

本发明的另一个优选的实施方式是包含核苷酸序列的分离的核酸用 于调节植物的开花时间的用途，所述核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO：1。

如本发明的实施例部分中描述的，相对于不含有序列SEQ ID NO：1 的对照植物的开花，用编码本发明的氨基酸序列的核苷酸序列转化的模式 植物拟南芥的开花可以被提前。因而，序列SEQ ID NO：1调节植物的开 花时间。术语“调节开花时间”是指改变营养顶端分生组织向花分生组织 转化发生的时刻，即，开花的时刻。优选的，本发明的核酸序列被用于提 前植物的开花时间。

本发明的另一个方面是包含根据任一前述方面的核酸的表达载体(在 下文中，本发明的载体)用于调节植物的开花时间的用途。

术语“载体”是指具有在具体宿主中复制的能力的DNA片段，如该 术语表明的，可以充当用于扩增与之融合的其他DNA片段(插入物)的 运载体。“插入物”是指与载体融合的DNA片段；对于本发明来说，载体 可以包含与之融合的任何根据前述方面所描述的序列，可以在合适的宿主 中复制。载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体，不排除符合上述载 体定义的其他类型的载体。

再一个方面是用本发明的载体转染的细胞(在下文中，本发明的细胞) 用于调节植物的开花时间的用途，所述载体包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

在本发明的意义上术语“细胞”是指原核或真核细胞。细胞可以是能 够复制转化的外源DNA的细菌，例如，物种大肠杆菌(Escherichia coli)的 任何菌株，或能够将感兴趣的DNA转移到植物中的细菌，例如，根癌土 壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。优选的，细胞是指真核的植物细胞， 在这一组中，更优选的，是指属于植物界的那些细胞。因而，在细胞是植 物细胞的情况下，术语细胞包括实质细胞、分生组织细胞或任何类型细胞 的至少一种细胞，为分化或未分化的。此外，这个定义还包括原生质体(缺 少细胞壁的植物细胞)。

术语“转染”是指通过质粒、病毒载体(在这种情况下，这也称为转 导)或其他用于转移的工具的方式，将外部的遗传材料导入细胞内。术语 转化优选地用于描述遗传材料向细菌中和非动物真核细胞例如真菌、藻类 或植物中的非病毒的转移。

优选的实施方式是本发明的细胞的用途，所述细胞包含编码氨基酸序 列SEQ ID NO：1的分离的核酸的任何表达产物。

术语“表达产物”在本发明的意义上是指产自根据任何前述方面的核 苷酸序列的表达的任何产物。因而，“产自序列的表达的产物”是指，例 如，获自序列的转录作用的RNA、加工的RNA、产自细胞内RNA的翻译 或随后的核苷酸序列的修饰的蛋白质，条件是产生的序列来源于转移的原 始序列。

另一个优选的实施方式是根据任何前述方面或实施方式的用途，其中 分离的核酸与基因表达调节序列功能性组合。

本发明的核酸通过它的3′末端与基因表达调节序列连接。在本发明中， 术语“基因表达调节序列”是指一种核酸序列，其在DNA序列的转录开 始时、RNA序列或其他未描述的序列的翻译开始时对所提及的本发明的 核酸序列的功能具有影响。举例来说，本发明中考虑的基因表达调节序列 包括启动子及其他较不常见的，例如，某些内含子。

根据优选的实施方式，基因表达调节序列是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3。

序列SEQ ID NO：2是指启动子CaMV 35S的序列，其在植物的任何 组织中产生在它之后的基因的组成型表达。序列SEQ ID NO：3是指SUC2 基因的基因表达调节序列的部分，其编码蔗糖-转运蛋白。这个序列引起在 前的基因在韧皮部维管组织的伴随细胞或伴细胞中的表达。

根据另一个优选的实施方式，根据任何前述方面或实施方式提及的调 节开花的植物属于拟南芥物种。根据另一个优选的实施方式，植物属于番 茄(Solanum lycopersicum)物种。

本发明的另一个方面是用包含核苷酸序列的分离的核酸转染的分离 的细胞，所述核苷酸序列编码与序列SEQ ID NO：1具有至少90％同一性 的氨基酸序列。

术语“转染”是指通过质粒、病毒载体(在这种情况下，这也称为转 导)或其他用于转移的工具的方式，将外部的遗传材料导入细胞内。术语 非病毒方法的转染用于提及哺乳动物真核细胞，而术语转化优选地用于描 述遗传材料向细菌和非动物真核细胞例如真菌、藻类或植物中的非病毒的 转移。对本发明来说，术语转染等价于术语转化。

根据优选的实施方式，细胞包含绿藻的核苷酸序列，所述核苷酸序列 编码与序列SEQ ID NO：1具有至少50％同一性的氨基酸序列。

另一个优选的实施方式是用分离的核酸转染的分离的细胞，所述分离 的核酸包含编码氨基酸序列SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

前述的细胞在下文中将被称为本发明的细胞或当前发明的细胞。

术语“分离的细胞”是指获自任何类型的微生物学的培养物(例如， 但不限于，大肠杆菌(E.coli)或根癌土壤杆菌)或植物组织的细胞。优 选的，细胞是来自有花植物的真核细胞。因而，术语细胞包括实质细胞、 分生组织细胞或任何类型的细胞，分化的或未分化的，的至少一种细胞。 此外，这个定义还包括原生质体(缺少细胞壁的植物细胞)。植物细胞稳 定地或短暂地包含序列SEQ ID NO：1。

本发明的又一个方面是包含本发明的细胞的植物。根据优选的实施方 式，植物属于拟南芥物种。根据另一个优选的实施方式，植物属于番茄物 种。在下文中，我们将通过术语“本发明的植物”或“当前发明的植物” 来提及这些植物。

术语“植物”涵盖其每个部分，其可以以分离的形式或组合地被保存 或培养，以及种质。种质被定义为含有种内的遗传变异性的生物材料，或 可以维持物种或生物体的群体的遗传材料(参见下文：种子、繁殖体或子 代)。植物必需以下述方式包含本发明的细胞，即，所述细胞在特定的组 织中表达(营养发育的具体时刻或取决于其发育的环境条件)或组成型地 表达或异位表达(其在不同于普通的和预期的其他细胞或组织中表达)。

考虑到本发明的序列编码的蛋白质令人惊讶地行使下述功能，即，恢 复从基因组序列中除去CO基因的拟南芥植物(co突变体)的CO基因的 功能，假定本发明的序列在任何植物物种中转移和插入到合适的位置，其 中获自上述序列的产物具有相同的氨基酸序列，因此产生了功能性表达这 些序列的植物，该序列行使与所述植物的内在CO基因相同的功能。在这 种意义上，优选的，所述植物选自以下植物的科，其包括但不限于：禾本 科(Poaceae)、蝶形花科(Fabaceae)、樟科(Lauraceae)、藜科 (Chenopodiaceae)、十字花科(Brassicaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、 伞形花科(Apiaceae)、茄科(Solanaceae)、菊科(Asteraceae)、蕃荔枝科 (Annonaceae)、柿树科(Ebenaceae)、桑科(Moraceae)、仙人掌科 (Cactaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、芸香科(Rutaceae)、葡萄科(Vitaceae)、 猕猴桃科(Actinidiaceae)、凤果科(Bromeliaceae)、芭蕉科(Musaceae)、 山毛榉科(Fagaceae)、桦木科(Betulaceae)、胡桃科(Juglandaceae)、 漆树科(Anacardiaceae)、木犀科(Oleaceae)或白花菜科(Capparaceae)。

优选的，葫芦科的植物选自，但不限于，南瓜属(Cucurbita)、黄瓜 属(Cucumis)、西瓜属(Citrullus)或葫芦属(Lagenaria)。

优选的，茄科(Solanaceae)的植物选自，但不限于，茄属(Solanum) 或辣椒属(Capsicum)。优选的，茄属的植物选自，但不限于，马铃薯(S. tuberosum)、番茄(S.lycopersicum)或茄子(S.melongena)物种。更优 选的，所述植物是番茄(S.lycopersicum)物种。优选的，辣椒属的植物选 自，但不限于，C.angulosum、辣椒(C.annuum)、C.pendulum或C.minimum。

优选的，蔷薇科的植物选自，但不限于，蔷薇亚科(Rosoideae)、苹 果亚科(Maloideae)或梅亚科(Prunoideae)。

优选的，芸香科的植物选自，但不限于，柑桔属(Citrus)。更优选的 植物是酸橙(C.aurantium)、C.nobilis、C.grandis、C.limetta、柠檬(C. limon)、C.medica或C.paradisi。

本发明的植物可以含有纯合性、杂合性或半合子性的任何序列。

可以通过基因枪、根癌土壤杆菌或任何允许本发明的任何序列整合到 植物DNA中的其他技术所介导的植物细胞遗传转化，随后进行适合于转 化的植物品种的特征和要求的体外再生，来获得本发明的植物，所述植物 DNA是基因组的、叶绿体的或线粒体的。此外，植物还可以通过杂交， 即，利用本发明的植物的花粉来授粉任何不含本发明的任何序列的其他植 物，或用不含这些序列的植物的其他花粉授粉含有本发明的任何序列的植 物的雌蕊，通过本发明的任何序列的转移来获得。获得本发明的植物的方 法不仅仅限于这个段落中描述的方法。此外，以稳定的或短暂的形式包含 本发明的细胞的植物也被包括在内。

来自本发明中描述的任何植物的花粉、种子、繁殖体、子代或植物部 分。

在本发明中，花粉被认为是遗传学和表型性状的传递者，其可以通过 与提及的花粉相容的任何植物品种的授粉来进行。这样，获得了包含本发 明的任何序列的植物，在相应的杂交和/或选择之后，可以获得其中所述序 列被稳定地整合(虽然它们也可以是短暂表达的)、并且处于适合于在后 代中获得相同的期望特征的拷贝数量的植物。

繁殖体是允许植物中的繁殖或无性繁殖的植物部分，通过它们，获得 新的植物或个体化器官。分离的部分的组织必需回复分生组织的状况用于 产生植物的整套器官。所述繁殖体选自，但不是排他地，包括匍匐枝、地 下茎、块茎或球茎的列表。

术语“子代”是指繁殖的结果，即，通过一个或多个亲本个体的介入 而产生的个体或多个个体。例如，通过有性繁殖获得的植物的子代是种子， 然而植物的子代可以是任何细胞，其产自任何细胞内容物、质体、细胞区 室、DNA或其任何组合的融合。在细胞分裂(例如，当体外生长时)的 过程中，子代是来自分裂的细胞。

本发明的另一个方面是获得本发明的细胞的方法，其包括：

a.将编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列插入到载体中，

b.用根据(a)项获得的载体转化细胞，和

c.选择包含编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列的根据(b)项转化的 细胞。

本发明的任何序列在载体中的插入可以通过构成公知常识的部分的 克隆方法、通过用限制性内切酶切割序列和载体，随后连接它们，使得载 体的序列整合本发明选定的序列来进行。载体在前述段落中定义。

包含本发明选定的序列的载体的选择可以通过一些技术进行，例如，

-通过向培养基添加抗生素选择含有本发明的载体的细胞。这些细胞对 物质例如抗生素的抗性通过由载体的序列中含有的序列所编码的分子的 合成来产生。

-用限制性内切酶消化，通过这种方式获得在载体中插入的某些本发明 的序列的片段。

-检测转化载体中存在的标记物基因，其在植物中的存在表明本发明的 序列的存在。

细胞获自任何类型的微生物学培养物(例如，大肠杆菌(E.coli)或 根癌土壤杆菌)或植物组织。

细胞的遗传转化通过构成公知常识的部分的技术来进行，例如，电穿 孔、通过基因枪、根癌土壤杆菌介导的遗传转化、或允许本发明的任何序 列整合到细胞的DNA中的任何技术。使用这些技术，有可能稳定地将包 括本发明的任何序列的载体导入，从而，在连续的细胞分裂之后，掺入的 序列仍然被表达。短暂地包含本发明的任何序列的细胞也被包括在内。

用包括本发明的任何序列的载体转化的细胞可以在细胞的任何DNA 中掺入所述序列：核的、线粒体的和/或叶绿体的(在这种情况下，通常的 是插入tDNA的序列，tDNA的序列含有本发明的任何序列以及其他序列)， 或仍然作为保持了其自身的自我复制机制的载体的部分。掺入了本发明的 任何序列的细胞的选择通过向给细胞供应营养物的培养基中添加抗生素 来进行。这些细胞对物质例如抗生素的抗性通过由载体或载体的tDNA的 序列中含有的序列所编码的分子的合成来产生。包含SEQ ID NO：1的细 胞也可以通过任何其他技术来选择，所述技术允许辩别SEQ ID NO：1的 存在或缺乏和/或它的表达。

本发明的另一个方面是获得本发明的植物的方法，其包括：

a.再生至少一种植物，其来自于根据上述方法的(c)项获得的细胞，

b.选择根据(d)项再生的一种或多种植物，其至少表达编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列，以及

c.选择根据(b)项获得的一种或多种植物，其展示了对照植物相比 开花的提前。

如果是植物细胞，选定的细胞可以经历器官发生或体细胞胚胎发生的 程序，通过所述程序，通过植物激素和其他化合物的合适组合在它的去分 化之后，产生完整的植物，所述植物含有它起源的原始细胞的遗传材料。 此外，需要适合于每个植物品种的光线和温度的条件。植物细胞是全能性 的，即，它们含有它们所属植物的遗传材料的完整拷贝，而与它们的功能 或在其中的位置无关，因而具有再生完整的新植物的潜力。一旦来自选定 植物细胞的植物被再生，对于编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列或本发明 的任何其他序列(启动子序列，等等)的存在和/或表达进行分析。

所述方法进一步包括选择相对于对照展示了开花的提前或延迟的植 物。选择优选的植物，其展示了相对于对照植物开花的提前。对照植物是 不含有编码SEQ ID NO：1的本发明的序列的植物。优选的，对照植物含 有载体的其余的转化DNA序列，所述载体是用于将本发明的核苷酸序列 插入到所述植物细胞中的载体。对照也可以是野生型植物，它的植物材料 来自于被转化之前的转化植物(其包含编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列)， 其经历了与本发明的植物相同的体外培养步骤，或不经历这些培养步骤。

根据另一个优选的实施方式，编码序列SEQ ID NO：1的核苷酸序列 与基因表达调节序列功能性组合。如上所述，基因表达调节序列决定了表 达本发明的序列的植物组织和/或表达它们的时刻。

在整个说明书和权利要求书中，词语“包含”和它的变体不意图排除 其他技术特征、添加物、成分或步骤。对于本领域的技术人员来说，本发 明的其他目的、优点和特征部分地根据说明书以及部分地根据本发明的实 际应用将变得清楚。为了说明的目的，而不是意图限制本发明，提供以下 的附图和实施例。

附图的说明

附图1显示了SEQ ID NO：1相对于植物的CO蛋白质的大的相似性。

A.基因的结构根据ESTs和通过PCR扩增推导，所述PCR扩增利用 模板eDNA(上方)和根据衣藻基因组数据库预测的基因组序列(下方)。

B.植物的进化分枝的CO和COL蛋白质的进化关系。距树的距离根 据比例画出，相同单位的分枝的长度作为用来推论出系统树的进化距离。 进化关系代表1000个副本。标记了主要的结果群。星号(*)表示95％置 信度的自展值。

附图2显示了在35S启动子控制下的CrCO的表达。

在下文中，编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列将被称为CrCO，它编 码的蛋白质被称为CrCO。

在35S启动子控制下CrCO的表达补足了co突变并且加速开花。

A.在重组植物35S::CrCO中、库co-8(Ler)(35S::CrCO #1)中的植 物中，或库co-10(col-0)(35S::CrCO #2)中的植物中，通过RT-PCR的 CrCO的mRNA的检测。野生型植物col-0和Ler，以及co-8突变体被用 作阴性对照。

B.突变体植物co-8和co-10；col-0和35S::CrCO #2在长日照(LD) 条件下在土壤中生长4周。植物是T3纯合子。

C.在包括阳性对照(SUC2::CO和35S::CO)和阴性对照(co-8)的 35S::CrCO植物中通过RT-PCR的FT的mRNA水平的检测。

植物在长日照条件下在土壤中生长2周，在正午(ZT4)和在下午/ 傍晚(ZT16)收获。

D.某些35S::CrCO系的表型。

附图3显示了在韧皮部专性启动子之下CrCO对拟南芥的开花的作 用。

A.处在韧皮部特异性启动子SUC2(SEQ ID NO：3)的控制下的 CrCO的表达加速了col-0植物中的开花。如果表达受到分生组织特异性启 动子KNATI的控制，早开花不会发生。突变体co-10、野生型col-0和 35S::CO植物(在库col-0中)用作对照。

B.在与A相同的植物中CrCO和FT的表达。

C.在来自植物col-0，35S::CO(col-0)和用SUC2::CrCO或 KNAT1::CrCO转化的植物col-0的核提取物中用特异于CO的抗体对蛋白 质CrCO的免疫检测。H3的检测被用作负载对照。箭头表明在植物 35S::CrCO和SUC2::CrCO中检测的45KDa特异性条带。

D.通过共焦显微镜检查洋葱表皮细胞的核中YFP:CrCO融合物的检 测。

实施例

以下将通过一些试验来说明本发明，所述试验描述了获得编码氨基酸 序列SEQ ID NO：1的核苷酸序列，生产表达它的细胞和植物的方法，以 及所述序列用于调节表达它的植物的开花时间的用途。

实施例1.实验方案

1.1来自植物和藻类的实验材料

对于基因表达和蛋白质生产的分析，拟南芥植物在80％湿度和 75μE/m²光强度的受控条件下的人工气候室中在不同的光周期下生长。拟 南芥植物也在补充有1％(w/v)蔗糖的MS-琼脂固体培养基中在65μtE/m²光强度的SG-1400人工气候室(Radiber SA，Spain)中在不同的光周期下 生长。莱茵衣藻野生型株21gr、细胞壁突变体CW15和转基因系在搅动的 锥形容器中或在充气的圆柱形瓶子中，在控制在22℃的培养室内在Sueoka 培养基或TAP培养基中生长。对于启动子NIA1的诱导，在Sueoka-铵培 养基中生长到中期指数期的藻类通过离心来采集，悬浮在Sueoka-硝酸盐 培养基中，并在各种培养条件下生长。用30μE/m²(低强度)或100μtE/m²(高强度)的光照条件，从LD(16∶8)到SD(8∶16)的条件，使用不同 的光周期。

1.2CrCO的克隆和分析(编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列)

在下文中，编码SEQ ID NO：1的氨基酸序列将被称为CrCO，它编 码的蛋白质被称为CrCO。

分析来自Kazusa的DNA中心的cDNA集合的几个克隆来获得CrCO 的完整ORF。四种这些cDNA(AV628196；Av628285；AV629179； AV638186)的测序显示了单一的mRNA核苷酸序列。从CrCO推导的氨 基酸序列具有410个残基和三个特征性的结构域：i)参与蛋白质-蛋白 质相互作用的、处在氨基末端称为b-boxes的两个锌-指结构域；ii)可能 参与转录活化的中间的酸性结构域；和iii)羧基结构域CCT (CO-COL-TOC1)，已经表明它介导与DNA的相互作用，在与中央振荡 器(central oscillator)功能相关植物蛋白质例如TOC1或应答的其他伪调 节物中是保守的。

1.3开花时间的分析

通过对至少10个个体中同一杆上莲座叶和茎生叶计数，分析在LD受 控条件的房间中在土地中生长的植物的开花时间。数据表示为平均值±均 值标准误差(s.e.m.)。

1.4系统发生分析

CO和CO-样蛋白质之间的进化关系利用从不同数据库推导出的氨基 酸序列来分析，并用CLUSTALX程序来比对。这种比对被用于使用不同 的系统发生指标产生各种进化树。所有这些树显示了非常相似的拓扑结 构，仅显示了用最小进化的指标产生的(附图1B)。利用最小进化(Minimum  Evolution，ME)的方法计算进化关系。通过1000个副本的方式计算的共 有捕集树代表了所分析的蛋白质的进化史。该树根据比例画出，与进化距 离的长度相同单位的分枝的长度作为用来计算系统树。ME树使用邻接算 法在追踪水平1下进行追踪。邻接算法用于产生起始树。仅在配对序列的 比较中移除含有错配的缺口或数据缺失的所有位置(配对删除的选择)。 总起来，在最终结果的集中存在669个位置。用MEGA4程序进行系统发 生分析。比对中使用的序列的登记号码在表1中显示。

表1.COL蛋白质的登记号码

  蛋白质   NCBI登记号码   TIGR基因的No.   CO   Q39057   At5g15840   HD1   NP_910686   Os06g16370   CrCO   AM940003   --   AtCOL1   O50055   At5g15850   AtCOL2   Q96502   At3g02380   AtCOL3   Q9SK53   At2g24790   AtCOL4   Q940T9   At5g24930   AtCOL5   Q9FHH8   At5g57660   AtCOL6   Q8LG76   At1g68520   AtCOL7   Q9C9A9   At1g73870   AtCOL8   Q9M9B3   At1g49130   AtCOL9   Q9SSE5   At3g07650

 AtCOL10   Q9LUA9   At5g48250  AtCOL11   O23379   At4g15250  AtCOL12   Q9LJ44   At3g21880  AtCOL13   O82256   At2g47890  AtCOL14   O22800   At2g33500  AtCOL15   Q9C7E8   At1g28050  AtCOL16   Q8RWD0   At1g25440  OsCOL1   XP_473042   Os04g42020  OsCOL2   XP_506861   Os02g39710  OsCOL3   BAD37550   Os06g44450  OsCOL4   BAD27992   Os02g08150  OsCOL5   NP_001057441   Os06g19444  OsCOL6   XP_467550   Os02g49230  OsCOL7   BAA33200   Os03g22770  OsCOL8   NP_910981   Os07g47140  OsCOL9   XP_469510   Os03g50310  PpCOL1   AB185925   --  PpCOL2   P000371   --  PpCOL3   P012466   --  SmCOL   C_1160095   --  VcCOL   C_10319   --  OtCOL   C_Chr_00010305   --  GsCOL   GS55410   --

1.5基因表达的分析

来自衣藻的细胞或拟南芥的幼苗的总RNA通过TRIZOL方案 (Invitrogen)提取。通过Northern印迹分析利用放射活性标记的探针，或 通过半定量的RT-PCR利用被分析的每种基因特异性的引物来监视基因表 达，用QIAGEN Quick prime RT试剂盒构建cDNA。α-微管蛋白(TUA1) 或泛素-10(UBQ)的表达水平分别用作衣藻和拟南芥中的对照。对于昼 夜节律的基因表达，编码衣藻光系统Ⅱ的叶绿素a/b的结合蛋白的基因 CABII的表达水平被用作对照。数据显示为至少三个不同实验的平均值。 这项工作中使用的引物的完整列表在表2中显示。

表2.引物和PCR条件的列表

对于CrCO基因，PCR条件是94℃ 30秒、65℃ 30秒和72℃ 60秒 的30个循环。对于TUA1基因，PCR条件是94℃ 30秒、65℃ 30秒和 72℃ 60秒的27个循环。对于FT基因，PCR条件是94℃ 30秒、60℃ 30 秒和72℃ 60秒的30个循环。对于UBO基因，PCR条件是94℃ 30秒、 65℃ 30秒和72℃ 60秒的20个循环。

在相应的附图中出现的蛋白质的名称在表2的第1栏中显示。第2栏 显示了在国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库中蛋白质的登记号码， 或DOE联合基因组学会(JGI)(http://www.igi.doe.gov/)对SmCOL、 VcCOL、OtCOL的基因组序列编码。GsCOL的氨基酸序列可以从Galdieria  sulphuraria的基因组计划的网站(http://genomics.msu.edu/gladieria/)下载。 第3栏显示了，对于拟南芥和水稻的，基因组研究机构(TIGR)的基因的 登记号码。

1.6免疫学的和蛋白质分析技术

蛋白质通过研磨法在研钵中在存在液氮和提取缓冲液和来自SIGMA 的蛋白酶抑制物混合物的情况下从冷冻的植物材料提取，提取缓冲液：Tris HCl 50mM(pH 8.0)；EDTA 1mM(pH 8.0)；甘油10％(v/v)；KCl 50mM； MgCl₂ 10mM；PMSF 10mM。藻类用相同的缓冲液通过简短的超声处理 来破坏(10W功率在Branson超声发生器中30秒2次)。从植物和藻类产 生的粗提取物在4℃在16000rpm离心30分钟，采集上清液。沉淀物用于 淀粉测量。Western印迹的分析使用商业上可获得的(AbCAM)针对CO 和antiH3的抗体作为核对照。

1.7藻类和植物的转化

拟南芥的野生型和突变体植物通过土壤杆菌属介导的花浸法来转化。 对于CrCO在拟南芥中的表达，植物用载体alligator 2转化。在显微镜下 通过种子中GFP的存在来选择CrCOox植物，分析在第一代中它们的花的 表型。当它们在角果中展示100％的荧光时，直接选择这一代中的纯合的 植物。

质粒pENSG-YFP:GW(来自Dr.Nieves Medina-Escobar，University of  Málaga)用于产生用来测定核定位的荧光融合蛋白。这个质粒产生YFP 蛋白质与克隆在YFP基因3′末端处gateway位置克隆的cDNA所表达蛋白 质的氨基-末端融合物，该cDNA处在35S启动子的控制下，并且与植物 中土壤杆菌属介导的表达是相容的。

对于可硝酸盐诱导的CrCO表达载体的构建，C-standard Gateway盒 (Invitrogen)根据厂家的说明书导入pNIA1载体的多聚接头的EcoRV位 点，获得载体pNIAG。包括潮霉素抗性盒的pHyg3载体的HindIII片段导 入pBS SK+载体的HindIII位点，kpnI片段导入pNIAG载体的相同位点， 产生pNIAHG载体，通过测序确认它反义克隆到Gateway盒中。CrCO的 ORF通过PCR扩增，通过重组克隆到pDONR221载体中。使用的引物是 SEQ ID NO：12(正向)和SEQ ID NO：13。通过这种扩增的方式，获得 cDNA序列，其在SEQ ID NO：14(CrCO)中示出。CrCO插入物载体被 用作pNIAHG载体中重组的反应L的底物，获得最终的载体 pNIAHG::CrCO。通过在Sueoka-铵培养基中的潮霉素抗性来选择转化的藻 类，在存在硝酸盐的情况下验证基因的表达。

用于GST:CrCO的生产的载体通过CrCO插入物载体与pDESR15质 粒(Invitrogen)的分子重组来构建。谷胱甘肽-sephadex柱(GE Healthcare) 中的克隆和纯化如厂家所描述的来进行。

实施例2.结果

2.1.莱茵衣藻中CONSTANS的同源物的鉴定

EST(表达序列标签)的数据库常常含有CrCO的EST，但是对于基 因COL(CONSTANS-LIKE)EDP03468仅一个EST可以被鉴定。此外， 使用对基因的内部部分设计的引物，来自不同生长条件的cDNA作为模 板，通过逆转录PCR(RT-PCR)从EDP03468未能扩增到信号。然而， ROC66的表达被描述为轻微但可检测的，看起来受到昼夜节律钟的调节。 考虑到它与CO的大的序列差异，以及它与COL家族的蛋白质的相似性， ROC66可以被认为是藻类的COL基因。显著地，在研究的所有生长条件 中，CrCO的完整序列可以通过RT-PCR测试来扩增，产生大约1.4kb的 片段，其与莱茵衣藻的基因组序列中最新的版本中基因的预想大小一致 (附图1A)。CrCO基因的结构在从EST、从RT-PCR扩增和从莱茵衣藻 基因组的数据库中的前述序列收集的信息的基础上产生(附图1A)。CrCO 拥有在Volvox cartieri的基因的序列中保守的四个内含子，但所述内含子 不在植物、苔藓小立碗藓(Physcomitrella patens)或石松植物江南卷柏 (Selaginella moellendorfi)的基因中。CrCO的编码序列(1230nt)类似 于CO的，它的mRNA含有处在5′和3′末端的短序列。从CO和CrCO推 出的氨基酸序列的完全同一性是27％，相似性是37％。在b-boxes的保守 区中，氨基酸的同一性达到43％，而在CCT结构域中，同一性达到78％。 与获自数据库的植物的其他COL序列的同一性在20到30％之间变动(表 3)。总体上，结果强烈地表明，CrCO是正常地在莱茵衣藻中表达的CO 的唯一真实的同源物。

表3.植物进化树的蛋白质COL家族的几个代表性成员的序列同一性

  CO   HD1   PpCOL1   SmCOL1   CrCO   VcCO   OtCOL   GsCOL   CO   100   46.6   34.8   36.4   26.7   26.9   24.3   23.0   HD1   100   33.0   32.6   26.1   25.7   22.1   21.0   PpCOL1   100   49.4   29.1   30.9   22.5   22.7   SmCOL   100   32.5   29.4   23.4   22.2   CrCO   100   62.2   19.8   22.2   VcCO   100   19.5   21.7   Oncol   100   19.0   GsCOL   100

数字表明每对蛋白质之间氨基酸的同一性百分比。CrCO与植物的序 列的同一性大于与其他prasinophyte藻类例如Ostreococcus tauri(OtCOL) 或与红藻Galdieria sulphuraria(GsCOL)的COL蛋白质的同一性。 PpCOL1：小立碗藓COL1；SmCOL：江南卷柏COL；VcCO：Volvox cartieri COL。

从CrCO推出的氨基酸序列，与光合真核谱系的COs和COLs的其他 序列一起，用于产生进化树的比对(附图1B)。在附图1B的树中，CrCO 与团藻属-CO(Volvox-CO，VcCO)归组，其是另一种显示了原始的多细 胞结构的绿藻。内含子的基因结构和位置在藻类的两个序列之间是相似 的，这是从两个物种的进化接近性预期的(附图1B)。这个基础分枝非常 靠近组I，其包括CO和HD1蛋白，已知它们分别在拟南芥和水稻中的光 周期开花方面具有中心性的作用。相比之下，在单细胞的海洋绿藻 Ostreococcus tauri和红藻Galdieria sulphuraria的基因组草图中存在的CO 的同源物是远离这个组而分枝的(96％捕集)与组II的COL成员一起(附 图1B)。

COL基因在属于其他分类群例如硅藻门(Bacillariophyta) (Thalassiosira pseudonana和Phaeodactylum tricornutum)、甲藻门 (Dinophyta)(Amphidium operculata)、裸藻门(Euglenophyta)(Euglena  gracilis)或定鞭藻门(Haptophyta)(Emiliana huxley)的不同物种的ESTs 的基因组草图或数据库中没有发现。因而，可能最终进化到陆生植物的进 化分枝包括CO的真实同源物，尽管藻类的新的基因组的测序可能改变这 种情况。

2.2.在各种启动子的控制下CrCO在拟南芥中的表达加速了花转变

CrCO的总cDNA克隆到35S启动子的控制下到植物的表达载体中(参 见方法)。过量表达CrCO的早先的构建体被转化到零突变体co-8和co-10 中，以及野生生态型Ler和Columbia中。在转化植物中，CrCO基因的表 达通过RT-PCR来测量(附图2)。在所有情况下，CrCO在35S启动子 35S::CrCO植物)下的表达补足了co突变体(附图2A和2B)，所有的植 物显示了早开花的表型(表4)。反之，在Ler和Col-0的转化植物中，在 载体的标志物和早开花的表型之间观察到直接的共分离，证明了CrCO也 可以在野生型植物中赋予早开花(表4)。

表4.野生型、突变体和转基因植物在长日照(LD)生长条件中的开花 时间

表格中的数据显示为在LD条件中计算了叶总数的10个植物的平均值 ±s.e.m.。每个植物的基因库在每个基因型旁边的括号中显示。这项工作 中描述的转基因植物全部是T3植物(第三代)。

还验证的是，过量表达CrCO的植物是否能够活化CO的主要靶点、 花整合基因FT的表达。纯合的35S::CrCO植物在LD(16小时光照和8 小时黑暗)中在固体培养基中生长，在时间ZT 4和ZT 16分析FT的表达 (附图2C)。使用的植物是野生型植物、co突变体植物和过量表达CO的 植物(35S::CO)作为对照。在所有情况中，35S::CrCO的早开花的表型与 高水平的FT表达匹配，甚至在早晨，此时FT的水平在野生型植物中是低 的(附图2C)。在非诱导的SD条件下35S::CrCO植物也早开花，这伴随 着FT的高表达水平。因而，表达CrCO的转基因植物的早开花的表型可 能归功于FT所介导的、对于光周期的开花所描述的同样的过程。35S::CO 植物显示了与早开花相关的其他多效性的表型，例如，棒状的角果、雄性 不育性和顶生花的增多。类似地，35S::CrCO植物具有降低的大小，在角 果、顶生花的形成方面的缺陷，常常不能产生成熟的种子，带有在晚期发 育阶段退化的花(附图2D，a-d)。这些最后提及的植物(附图2D，c-d) 显示了极小的大小，极早的开花，是通过开花的天数和叶的总数来评估的， 以及CrCO和FT的mRNA的非常高的水平。

通过在维管束中系统性信号的表达，CO促进LD下的开花。为了确 定在这些组织中CrCO的特异性表达是否也可以促进开花，CrCO被导入 拟南芥的col-0植物中处于蔗糖转运启动子SUC2的控制下，已知该启动 子在韧皮部的维管组织的伴细胞中优先地表达。在启动子SUC2之下CrCO 的表达(SUC2::CrCO植物)诱导了野生型植物Col-0中的早开花(附图 3A和表4)，并且补足了co突变。用构建体SUC2::CrCO转化的植物在 LD条件中在第一个花芽出现时大约8.6±0.2片叶，而Col-0显示了在相 同条件下19.9±0.5片叶(表4)。然而，当CrCO的cDNA在KNATI基因 的启动子的控制下表达时，其表达对于顶端分生组织是专性的，被导入 Col-0植物中，开花不改变(附图3A和表4)。KNATI::CrCO植物在20.4 ±0.7片叶时开花(表4)。为了确认在SUC2::CrCO植物中观察到的早开 花的表型是由于光周期性的活化，通过RT-PCR验证FT的表达。有效地， 与对照植物相比，FT在LD和在SD下在这些植物中以高水平表达，它伴 随着CrCO的高水平表达(附图3B)。然而，虽然它们展现了高水平的 CrCO，当CrCO处在对分生组织专性的启动子的控制下表达时，没有观察 到与野生型植物相比更高水平的FT(附图3B)。

使用免疫印迹显示在库Col-0中过量表达CrCO的植物显示了核提取 物中CrCO蛋白质的高水平的生产(附图3C)。在库Col-0中在表达处于 启动子SUC2和KNATI控制下表达的CrCO的植物中，CrCO蛋白质的存 在也通过免疫印迹来测试。与mRNA数据一致，在35S::CrCO和 SUC2::CrCO植物中可以检测到蛋白质，但是在co-10突变体中，以及在 其中CrCO的表达受到启动子KNATI的控制的植物中检测不到(附图3C)。

用含有CO与绿色荧光蛋白(GFP)的翻译融合物的载体转化植物显 示了GFP:CO融合物的核内存在。CrCO被克隆到质粒pENSG-YFP:GW中， 其产生与GFP的黄色变体(YFP)的氨基-末端融合。这个载体通过粒子 轰击与在相同条件下表达CO(YFP:CO)的对照载体一起导入表皮的细胞 中。如在附图3D中所见的，YFP:CrCO通过共焦显微镜在核中检出，类 似于过量表达YFP:CO融合物的植物，表明CrCO也可以定位在核中。

实施例3.CrCO是CO的真实的同源物

虽然蛋白质CrCO保持了与CO的约27％的同一性，用CrCO转化的 植物令人惊讶地具有早开花的表型。相比之下，COL1，在拟南芥中CO 的串联重复物，其在氨基酸上保持了与CO的超过85％的同一性，如果它 在35S启动子下表达，不能补足co突变。这表明，CrCO的结构类似于 CO的结构，并且它可能涉及基于FT的转录作用提出的相同的核复合物。 事实是，它可以补足Ler库中的co-8突变和Col-0库中的co-10两者，表 明CrCO可以有效地替换据推测参与转录作用的修饰的超分子复合物中的 CO。

在本发明中，已经显示的是，如CO一样，CrCO在韧皮部特异性基 因的启动子SUC2的控制下的表达引起拟南芥中的早开花。甚至在非诱导 的SD条件下，SUC2::CrCO植物显示了相比野生型植物更高的FT表达水 平，这可以解释观察到的早开花的表型。相比之下，在分生组织基因的特 异性启动子KNATI之下CrCO的表达不促进早开花，没有检出FT的表达。 KNATI::CO植物也是这种情况。

总之，当在维管组织中特异性地表达时，CrCO是功能性的，这进一 步支持了在植物的同源基因中CO的功能的保守性，尽管存在相当大的种 族距离分隔它们。

基因表达和调节的光周期依赖性表现为光合生物的基本过程，因为预 测白天和季节的光信号允许选择每年或每日的最佳时刻产生阶段的转变。 在这一点上，对于控制发育的几个关键过程，例如休眠、分枝的形成或花 转变，植物具有适应的光周期调节。在这种调节途径中，COL蛋白质看起 来具有重要的作用，因为这个家族的成员受到光线和昼夜节律钟的调节。 同时，它们参与由光线调节的控制过程，例如，胚轴的延伸、分枝和开花 时间的PHYB-依赖性控制。在调节花转变的许多基因之中，CO-FT模式 看起来在双子叶植物和单子叶植物的大部分科中存在，并且参与从草本植 物到树木的开花控制。与调节开花的其他系统例如看起来特异于某些双子 叶植物的FLC/春化作用途径相比，COL基因在苔藓植物例如小立碗藓、 石松植物例如江南卷柏和几种微藻的基因组中存在(本发明中描述的)。

在拟南芥中CO与CrCO的功能互补性证明是令人惊讶的，因为它意 味着在绿藻门的谱系中自很早起COL基因就已经参与昼夜节律的调节和 繁殖的控制，并且这些特征在它们的进化中被保留了。co突变在拟南芥或 在其他植物中不是致死性的，然而它可能构成了植物适应新环境的能力方 面的关键特征。在衣藻中，细胞周期和生长受到昼夜节律钟和光周期的调 节，这通过取决于夜晚/白天的长度、细胞周期的关键成分的峰值表达方面 的改变所证明。

根据在本发明中提出的结果，可以推断CO功能的保守性对于植物响 应外界光信号和促进发育的转变的能力是关键的。