使用甲硫醇和二甲硫醚的混合物增加蛋氨酸产率的方法

摘要

本发明涉及提高L-蛋氨酸产率和有机酸产率的方法。更具体地，本发明涉及方法，其包括以合适的比向O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸以及向具有将蛋氨酸前体转化为L-蛋氨酸活性的酶添加包含甲硫醇和二甲硫醚的混合物以便进行酶反应，由此提高得自所述L-蛋氨酸前体的L-蛋氨酸和有机酸的转化率，从而与常规方法相比增加了L-蛋氨酸收率。

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及提高L-蛋氨酸和有机酸的产率的方法。

相关技术描述

蛋氨酸是人体必需的氨基酸之一并广泛用作动物饲料和食物添加 剂以及用于医药产品的药物水性溶液和其它原材料的组分。蛋氨酸充 当胆碱(卵磷脂)和肌酸的前体，并还用作合成半胱氨酸和牛磺酸的原 材料。此外，其充当硫供体。S-腺苷-蛋氨酸衍生自L-蛋氨酸并充当身 体内的甲基供体，并且其与大脑中各种神经递质的合成有关。还发现 蛋氨酸和/或S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)能预防肝脏和动脉中的类脂积聚 并且有效地治疗抑郁症、炎症、肝疾病和肌肉疼痛(Jeon BR等人，J Hepatol.，2001年三月；34(3)：395-401)。

为了化学合成蛋氨酸，通过5-(β-甲基巯乙基)-乙内酰脲的水解制 备L-蛋氨酸。然而，不利地是化学合成的蛋氨酸以L-型和D-型的混 合物形式存在。因此，本发明者开发了选择性合成L-蛋氨酸的生物方 法并已申请专利(WO 2008/103432)。所述方法简称为“两步法”，其 包括发酵制备L-蛋氨酸前体和将L-蛋氨酸前体酶转化为L-蛋氨酸。 L-蛋氨酸前体优选包含O-乙酰高丝氨酸和O-琥珀酰高丝氨酸。根据克 服常规方法所遭受的问题来评价两步法，所述问题诸如硫化物毒性、 蛋氨酸和SAMe的菌株反馈调节以及胱硫醚γ合酶、O-琥珀酰高丝氨 酸硫化氢解酶和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的中间体降解。另外，与 制备D-蛋氨酸和L-蛋氨酸的常规化学合成方法相比，两步法具有仅对 L-蛋氨酸有选择性和伴随产生有机酸的优点，更具体地，伴随产生作 为有用副产物的琥珀酸和乙酸。将琥珀酸用作涂料、化妆品或医药产 品的原材料，且乙酸在工业领域是非常有用的，包括制备乙酸乙烯基 酯、染色剂、诸如阿司匹林的医药产品和摄影定影液。

在两步法的酶转化反应中，使用具有胱硫醚γ合酶、O-琥珀酰高 丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶活性的酶，并将作为 L-蛋氨酸前体的O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸与甲硫醇混合 以通过酶反应制备L-蛋氨酸和有机酸。

甲硫醇在室温下以气体形式存在并微溶于水，且在碱性溶液中具 有高溶解度。L-蛋氨酸制备的酶转化反应在水溶液中发生。因此，如 果甲硫醇在水溶液中具有较高的溶解度，则有希望显著提高蛋氨酸产 率。

鉴于上述问题，本发明者尝试增加甲硫醇在酶转化反应中的溶解 度以使L-蛋氨酸制备最大化。因此，其发现以合适的比混合的甲硫醇 和二甲硫醚混合物能提高L-蛋氨酸前体至L-蛋氨酸和有机酸的转化 率，因此与常规方法相比能以高收率制备L-蛋氨酸，由此完成本发明。

发明概述

本发明的目的是提供通过使用混合物来提高将L-蛋氨酸前体、O- 乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸转化为L-蛋氨酸的转化率的方法， 所述混合物为硫化合物、二甲硫醚和甲硫醇的混合物，其为用作酶转 化反应底物的另一硫化合物。

发明效果

与在转化反应过程中单独使用甲硫醇相比，通过使用本发明的方 法能提高L-蛋氨酸和有机酸的生产率和纯度。此外，通过提高蛋氨酸 产率能获得节约反应设备成本的经济效益。

附图简述

图1是pH变化的曲线图，其表示在1L间歇反应器中根据供给甲 硫醇溶液或供给甲硫醇和二甲硫醚溶液混合物的酶转化反应率；

图2为表示随着甲硫醇溶液(SMM)和二甲硫醚(DMS)的混合比而 不同的相对活性的曲线图。

优选实施方案的详细描述

为实现上述目的，本发明一方面提供了制备蛋氨酸的方法，其包 括：

1)制备反应溶液，其包含为O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨 酸的蛋氨酸前体、具有将蛋氨酸前体转化为蛋氨酸活性的酶以及甲硫 醇和二甲硫醚的混合物；以及

2)在搅拌所述反应溶液时进行酶转化反应。

本文使用的术语“两步法”是指WO 2008/013432公开的制备L- 蛋氨酸的方法，其包括使用根据所述方法制备的发酵菌株通过葡萄糖 发酵制备O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸的步骤；以及通过酶 转化将O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸连同甲硫醇转化为蛋氨 酸，由此制备L-蛋氨酸。

在下文中，将详细描述本发明。

本发明一方面提供了制备蛋氨酸的方法，其包括：

1)制备反应溶液，其包含为O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨 酸的蛋氨酸前体、具有将蛋氨酸前体转化为蛋氨酸活性的酶以及甲硫 醇和二甲硫醚的混合物；以及

2)在搅拌所述反应溶液时进行酶转化反应。

可在500rpm至1000rpm，优选在600rpm至900rpm且更优选 在700rpm至800rpm下进行步骤2)的搅拌。

本发明的方法还可包括终止酶转化反应，并且在本发明的特定实 施方案中，使用2N HCl终止反应。

此外，本发明的方法还可包括纯化反应溶液中存在的蛋氨酸。特 别地，蛋氨酸的纯化步骤可包括：

1)从所述酶转化反应溶液中分离微生物；

2)将去除微生物的反应溶液脱色和过滤；以及

3)从所述滤液中结晶。

可使用高速离心机或膜过滤器进行分离微生物的步骤。可使用活 性炭进行将去除微生物的溶液脱色和过滤的步骤，但不局限于此。

在制备蛋氨酸的两步法中，使用O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高 丝氨酸作为L-蛋氨酸前体以及使用甲硫醇(CH₃SH)作为底物通过酶转 化反应制备蛋氨酸(WO2008/013432)。对此，将甲硫醇用作能与底物、 O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸反应的硫来源以制备蛋氨酸，从 而通过甲硫醇的反应性可显著影响蛋氨酸的生产效率。然而，甲硫醇 在中性水溶液具有非常低的溶解度并为挥发性的，从而从溶液中迅速 蒸发。因此，如果开发能够提高甲硫醇反应性的方法，则在甲硫醇蒸 发之前能够尽可能使最大量的甲硫醇反应，从而提高蛋氨酸的制备产 率。因此，本发明者意图通过向包含甲硫醇的反应溶液添加另外的物 质来提高甲硫醇反应性。因此，其发现当将二甲硫醚(DMS)作为另一 物质与甲硫醇混合来引发反应时，能提高转化率。

在本发明的特定实例中，当单独使用二甲硫醚时转化反应不发生。 然而，当使用甲硫醇与二甲硫醚的混合物时，与单独使用甲硫醇相比 转化率增加(参见表1和4以及图2)。此外，根据由乙酸导致的pH 下降率，酶的反应速率高于单独使用甲硫醇的反应速率，所述乙酸为 与二甲硫醚混合制备的副产物(参见图1)。此外，当进行混合物的连续 供应时(参见表2)或进行大规模的培养时(参见表3)，与单独使用甲硫 醇相比转化率也提高。因此，本发明的方法能有效用于提高O-乙酰高 丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸转化至L-蛋氨酸的转化率。

在下列反应方案中示出使用具有转化为蛋氨酸的活性的酶将蛋氨 酸前体转化为蛋氨酸的转化反应。

在上述反应方案中，使用O-琥珀酰高丝氨酸或O-乙酰高丝氨酸 的琥珀酸酯或乙酸酯残基取代甲硫醇的CH₃S-残基以制备蛋氨酸。

基于所述反应，可以各种形式添加甲硫醇(CH₃SH)。优选地，可 以甲硫醇气体的形式添加甲硫醇，或还可以将甲硫醇钠溶液用作液体 类型，因为甲硫醇钠溶液和甲硫醇气体在水性反应溶液中显示相同的 反应性质。因此，可直接或以通过将其溶解在氢氧化钠溶液中的甲硫 醇钠溶液的形式使用甲硫醇。然而，由于甲硫醇在室温下以气体形式 存在，因此优选使用通过将甲硫醇溶解在氢氧化钠溶液中制备的甲硫 醇钠溶液。

在本发明中，具有转化为蛋氨酸的活性的酶可包含选自胱硫醚γ 合酶、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶中 的一种或多种。

在上述反应中，用于制备蛋氨酸且具有转化为蛋氨酸的活性的酶 可为源自微生物菌株的酶，所述微生物菌株属于埃希氏菌属 (Escherichia sp)、假单胞菌属(Pseudomonas sp)、钩端螺旋体(Leptospira  sp)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp)、酵母菌属(Saccharomyces sp)、 色杆菌属(Chromobacterium sp)、诺卡氏菌属(Nocardia sp)、根瘤菌属 (Bradyrhizobium sp)、生丝单胞菌属(Hyphomonas sp)、甲基球菌属 (Methylococcus sp)、甲基菌属(Methylobacillus sp)、亚硝化单胞菌属 (Nitrosomonas sp)、克雷伯氏菌属(Klesiella sp)、芽孢杆菌属(Bacillus  sp)、志贺氏菌属(Shigella sp)、科尔韦尔氏菌属(Colwellia sp)、沙门氏 菌属(Salmonella sp)、酵母或真菌。

在上述转化反应中，当使用O-琥珀酰高丝氨酸作为底物时，酶可 包含选自胱硫醚γ合酶、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰高丝 氨酸硫化氢解酶中的一种或多种，其优选源自属于假单胞菌属 (Pseudomonas sp)、诺卡氏菌属(Nocardia sp)和色杆菌属 (Chromobacterium sp)的微生物菌株，且更优选源自属于绿脓杆菌 (Pseudomonas aurogenosa)、皮疽诺卡氏菌(Nocardia Farcinica)、恶臭 假单胞菌(Pseudomonas putida)和青紫色杆菌(Chromobacterium  Violaceum)的微生物菌株。

在上述转化反应中，当使用O-乙酰高丝氨酸作为底物时，酶可包 含选自胱硫醚γ合酶、O-琥珀酰高丝氨酸硫化氢解酶和O-乙酰高丝氨 酸硫化氢解酶中的一种或多种，其优选源自属于钩端螺旋体 (Leptospira sp)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp)和生丝单胞菌属 (Hyphomonas sp)的微生物菌株，且更优选源自属于迈氏钩端螺旋体 (Leptospira meyeri)、绿脓杆菌(Pseudomonas aurogenosa)、海王生丝单 胞菌(Hyphomonas Neptunium)和青紫棒状杆菌(Corynebacterium  Violaceum)的微生物菌株。

在本发明的特定实施方案中，按照WO 2008/013432所述方法制 备的微生物菌株通过发酵制备O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸， 其在制备L-蛋氨酸的转化反应中作为底物使用，并通过甲醇沉淀从发 酵的溶液中纯化O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝氨酸底物。

此外，从源自青紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)的O-琥珀 酰高丝氨酸硫化氢解酶和源自海王生丝单胞菌(Hyphomonas  Neptunium)的O-乙酰高丝氨酸硫化氢解酶的基因获得制备L-蛋氨酸的 转化反应中使用的酶，其中按照WO 2008/013432所述方法将包含所 述基因的菌株发酵、回收然后分解。

将为上述方法所回收的底物的O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝 氨酸与具有转化为蛋氨酸的活性的酶进行混合来制备转化反应溶液。

以合适的比将其它底物、甲硫醇与二甲硫醚混合并添加至转化反 应溶液，并比较各个情况下的得自O-乙酰高丝氨酸或O-琥珀酰高丝 氨酸的蛋氨酸的转化率。结果显示当甲硫醇∶二甲硫醚比为1∶0.0.5 (mol∶mol)至1∶1(mol∶mol)时，甲硫醇和二甲硫醚的混合比最佳，其中 比优选为1∶0.20(mol∶mol)至1∶1(mol∶mol)，且更优选为1∶0.25(mol∶mol) 至1∶0.5(mol∶mol)。同时，基于甲硫醇的摩尔浓度，优选以5％至25％ 且更优选为20％至25％的比使用二甲硫醚。

本发明的另一方面提供了通过上述方法制备的蛋氨酸。

氨酸可为干粉末形式或溶解在水溶液中的液体形式，其通过纯化 过程而纯化。

根据本发明，使用甲硫醇和二甲硫醚的混合物，将L-蛋氨酸前体 转化为L-蛋氨酸的方法能以高于常规方法的收率制备L-蛋氨酸，因 此，能将制备的蛋氨酸应用于多种领域，其包括动物饲料、食物添加 剂、医药和其它的医药产品原材料。

在下文中，参考实施例将更详细地描述本发明的方法和效果。然 而，这些实施例仅出于例示性的目的，并且本发明不意图受这些实施 例的限制。

实施例1：根据甲硫醇和二甲硫醚的混合比来比较得自O-乙酰高丝氨 酸的蛋氨酸的转化率

基于转化反应，以合适的比将二甲硫醚与甲硫醇溶液混合，并将 上述混合物添加至转化反应溶液中以便检测得自O-乙酰高丝氨酸的 蛋氨酸的转化率。

甲硫醇在室温下以气体形式存在，并可以通过将其添加至氢氧化 钠溶液而以甲硫醇钠溶液(甲硫醇钠，CH₃S-Na，2.14M，15％，Tokyo  Chemical industry，Japan)的形式存在。在本实施例中，使用2.14M的 甲硫醇钠溶液进行实验。在下文中，指定2.14M的甲硫醇钠溶液作为 甲硫醇溶液。将甲硫醇溶液和二甲硫醚溶液(13.38M，99％，arkema， France)以合适的摩尔比(mol∶mol)混合，并搅拌以制备混合溶液。

通过将50μl的转化酶溶液和0.1mM的作为辅因子的吡哆醛5’- 磷酸酯(Sigma，USA)添加至1ml的O-乙酰高丝氨酸溶液(500mM)来 制备转化反应溶液。通过将从发酵液中纯化的O-乙酰高丝氨酸溶解在 磷酸缓冲溶液(pH 7.5)中来制备O-乙酰高丝氨酸溶液。

将按照WO 2008/013432公开的方法而制备的 CJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL菌株作为发酵菌株。在5L的发酵罐中接 种CJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL菌株，并通过分批补料发酵进行50至 100小时的培养。通过甲醇沉淀从发酵液中纯化O-乙酰高丝氨酸。从 使用源自海王生丝单胞菌(Hyphomonas Neptunium)的pCJ-MetZ-CL而 转化的E.coli W3110菌株中获得转化酶，其中按照WO 2008/013432 公开的方法将菌株发酵，然后回收和分解。将甲硫醇和二甲硫醚的混 合物添加至制备的转化反应溶液以诱发酶反应。对此，调整甲硫醇和 二甲硫醚的混合物的加入量直至甲硫醇的最终量变为0.04mM。在 33℃的温度和800rpm的搅拌下进行10分钟的反应。对于反应的终 止，加入0.2N的HCl溶液以终止所述反应。通过HPLC分析最终产 物蛋氨酸的浓度。在WO2008/013432公开的条件下进行分析。

以反应中所用的制备的蛋氨酸的摩尔数与底物的摩尔数(mol/L) 的百分比(％)来计算得自O-乙酰高丝氨酸的蛋氨酸的转化率(％)。当从 1mol的O-乙酰高丝氨酸和甲硫醇制备1mol的蛋氨酸时，将转化率(％) 视为100％。在下列表1中示出分析结果。

[表1]

比较不同混合比的甲硫醇溶液(SMM)和

二甲硫醚(DMS)之间的O-乙酰高丝氨酸的转化率

如表1所示，当以1∶0.25(mol∶mol)的比加入甲硫醇溶液和二甲硫 醚的混合物时，与单独使用甲硫醇相比蛋氨酸的产率增加至34％。当 将甲硫醇溶液和二甲硫醚的混合比增加至大于1∶0.25时，相对活性不 进一步增加，而维持在高水平。

作为对照组，当仅以与1∶1的甲硫醇和二甲硫醚混合物中所包含 的相同量向转化反应溶液加入二甲硫醚时，未发现生成蛋氨酸，这表 示单独使用二甲硫醚不能制备蛋氨酸。因此，建议将二甲硫醚与甲硫 醇混合以提高甲硫醇的反应性，由此提高蛋氨酸的产量。

实施例2：使用甲硫醇和二甲硫醚的混合物的蛋氨酸转化反应

为检测在与实施例1相同的条件下蛋氨酸提高的产量是否持发 生，当随时间持续添加甲硫醇和二甲硫醚的混合物时检测蛋氨酸的产 量。当每隔10分钟添加甲硫醇溶液以及其与二甲硫醚的混合物时，使 用相同的转化反应溶液将反应维持30分钟。在30分钟之后，终止反 应，并通过HPLC检测产生的蛋氨酸量。在甲硫醇溶液和二甲硫醚的 混合比为1∶0.25(mol∶mol)的条件下进行反应，在实施例1中在该比率 观察到蛋氨酸的最高产量。在下列表2中示出结果。

[表2]

比较在1.5mL的管规模中按照连续

供应甲硫醇溶液或二甲硫醚混合物的转化率

如表2所示，与单独使用甲硫醇相比，30分钟之后转化率增加至 约15％。

实施例3：在1L的间歇反应器中O-乙酰高丝氨酸的酶转化反应

为检测大型反应器中转化反应的效率，在1L的间歇反应器中使 用500mL的700mM的O-乙酰高丝氨酸进行反应。在流速为3.0mL/ 分钟下，连续供应甲硫醇溶液或1∶0.25(mol∶mol)的甲硫醇和二甲硫醚 的混合物时，酶转化反应进行60分钟。将各个溶液中包含的甲硫醇的 量调整为相同。反应温度为33℃并在700rpm下进行搅拌。以与上述 实施例相同的方式制备转化酶液并添加10mL。添加0.1mM的作为辅 因子的吡哆醛5’-磷酸酯(Sigma，USA)。在约3小时之后，通过HPLC 检测制备的蛋氨酸的量。在下列表3中示出结果。

[表3]

比较在1L的间歇反应器中按照

供应甲硫醇或二甲硫醚混合物的转化率

如表3所示，当以1∶0.25(mol∶mol)的比添加甲硫醇溶液和二甲硫 醚的混合物时，与单独使用甲硫醇相比，转化率增加至约18％。

基于O-乙酰高丝氨酸的转化反应，除蛋氨酸之外还制备了作为产 物的乙酸酯，因此发生pH下降。在诱发反应之后，当供应甲硫醇溶 液以及甲硫醇和二甲硫醚的混合物时，由于通过将其溶解在NaOH中 而以液体形式供应甲硫醇，因此pH增加。然而，在完成供给之后， pH降低。当乙酸(在使用O-乙酰高丝氨酸作为底物的情况下)或琥珀 酸(在使用O-琥珀酰高丝氨酸作为底物的情况下)作为转化反应的副产 物而产生时，通过pH下降率来反映酶的反应率。如图1所示，当使 用1∶0.25(mol∶mol)的甲硫醇和二甲硫醚的混合物时，发现与单独使用 甲硫醇相比，随pH下降率的酶反应率相对高。

实施例4：按照二甲硫醚和甲硫醇的添加量的O-琥珀酰高丝氨酸的酶 转化反应

还使用O-琥珀酰高丝氨酸作为用于蛋氨酸的酶转化反应的底物 以便进行制备蛋氨酸和琥珀酸的反应。

在如实施例1中的1.5mL的管规模中，将不同量的二甲硫醚加入 至甲硫醇溶液，然后比较得自O-琥珀酰高丝氨酸的蛋氨酸的转化率。 以1∶0、1∶0.25、1∶0.35和1∶1(mol∶mol)的甲硫醇与二甲硫醚的比添加 二甲硫醚。通过将50μl的转化酶液和0.1mM的作为辅因子的吡哆醛 5’-磷酸酯添加至1ml的O-琥珀酰高丝氨酸溶液(500mM)来制备转化 反应液。通过将从发酵液纯化的O-琥珀酰高丝氨酸溶解在磷酸缓冲溶 液(pH 7.5)中制备O-琥珀酰高丝氨酸溶液。在5L的发酵罐中，将通过 WO 2008/013432公开的方法而制备的CJM-BTJ/pCJ-metA-CL菌株接 种，并通过分批补料发酵进行50至100小时的培养。通过甲醇沉淀从 发酵液中纯化O-琥珀酰高丝氨酸。从使用源自青紫色杆菌 (Chromobacterium violaceum)的pCJ-MetZ-CL而转化的E.coli W3110 菌株获得转化酶，其中按照WO 2008/013432公开的方法将所述菌株 发酵，然后回收和分解。添加0.05mL的酶。将甲硫醇和二甲硫醚的 0.02mL的各个混合物以不同比例添加至制备的转化反应溶液中以便 诱发酶反应。调整各个溶液以包含相同量的甲硫醇。在33℃的温度和 800rpm的搅拌下使反应进行10分钟。对于反应的终止，加入0.2N 的HCl溶液以终止反应。通过HPLC分析最终产物蛋氨酸的浓度。在 表4中示出结果。

[表4]

比较按照添加量的O-琥珀酰高丝氨酸转化率

如表4所示，当以1∶0.35(mol∶mol)的比添加甲硫醇溶液和二甲硫 醚的混合物时，与单独使用甲硫醇相比活性增加至约10％。当以1∶0.25 和1∶1(mol∶mol)的比添加甲硫醇和二甲硫醚的混合物时，与1∶0.35 (mol∶mol)的混合物比相比，酶活性未显著提高，但与单独使用硫醇相 比，各个酶活性增加至约9％和7％。

工业应用

如上述实施例所述，本发明提供了提高蛋氨酸的转化率的方法， 由此将其应用于包括动物饲料、食物添加剂和药物的各个领域中。