一种基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的生长因子梯度释放微球支架及其制备方法和应用

摘要

一种基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的生长因子梯度释放微球支架，该微球支架是通过如下方法制备获得的：首先制备PLGA均质微球以及TGF-β3和BMP-2/PLGA微球，将两微球分散于ddH2O中制成悬浮液，然后将该悬浮液注入底部设有过滤装置的模具中，采用ddH2O过滤并调整ddH2O在模具中的位置，上述微球在模具中堆积，采用无水乙醇烧结上述微球即形成。本发明制备的微球支架不仅保留了PLGA原有的良好生物相容性，而且显著提高了微球支架力学性能、骨软骨诱导作用和携带种子细胞能力，具有优异的生物相容性，可携带足够量的种子细胞，用于由肿瘤、外伤、严重感染、先天畸形等多种疾病造成的骨软骨缺损的治疗。

说明书

技术领域

本发明涉及一种骨软骨生物修复复合材料及其制备方法和应用，具体涉及一种基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的生长因子梯度释放微球支架及其制备方法和应用。 

背景技术

随着经济和社会生活的发展，骨软骨缺损的发病率逐年上升，据保守估计，美国每年大约有700万因骨科疾病就诊，医疗消耗约2150亿美元。我国每年因多种病因诱发的骨关节病也为数众多，消耗巨大。目前临床采用的关节假体置换为有效的治疗方法之一。但手术置换关节，不仅价格昂贵，且有并发症危险。近年来应用生物学和工程学技术、原理研究开发替代用组织工程软骨为软骨缺损的修复开辟了新途径和新方法。随着组织工程技术发展，组织工程骨软骨因同时具有类似骨、软骨和骨软骨间无缝移行区的结构，完全模拟构建自然的骨软骨结构等优点，逐渐引起了国内外学者的关注，具有广泛的应用前景。因而，加强组织工程骨软骨的应用基础研究，阐明其在软骨组织修复中的作用和转归机制，对于提高对组织工程骨软骨的认识，拓展其应用范围具有重要的科学意义。 

聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物 (poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA) ，在美国已通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。这类材料无毒，无抗原性，具有良好的可降解吸收性、生物安全性和力学强度，可以通过控制成份含量来调节材料的降解速度，是目前骨软骨组织工程研究和应用最为广泛的一类材料。然而由于PLGA材料表面缺乏细胞识别位点以及亲水性和细胞亲和性不足，影响了细胞在其表面上的粘附生长，很大程度上限制了其临床应用。近年来，随着对PLGA改性研究的不断进行, 其性能得到不断优化, 一些新型PLGA材料相继出现。例如：①胶原修饰改性的PLGA 仿生材料，采用离子表面处理方法在材料表面引入功能基团或功能链，可提高支架材料表面的黏附性。采用等离子处理PLGA膜，引入阳离子化的凝胶抗基，有效改善了细胞对PLGA 降解支架材料的亲和性。一种由HA/胶原/PLGA 三层结构组成的纳米复合膜，显著提高了材料的生物活性。②精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD 多肽）修饰改性PLGA，用交联剂将RGD 结合到PLGA 微球表面进行改性，显示提高细胞的粘附和细胞生长率。③羟基磷灰石（hydroxyapatite, HA）修饰改性PLGA，制备磷灰石/PLGA，多孔的PLGA/HA 复合材料具有较好的韧性，提高骨结合能力。 

目前基于PLGA微球的组织工程支架，由于具有制备简便，生物降解可控且降解产物毒性低、缓控释等优点，而受到研究者的青睐。然而基于PLGA微球的组织工程骨软骨在修复软骨缺损中形成新生软骨组织的数量和质量都远未满足临床需要，主要原因是PLGA微球大小不均一，粘附性低，孔隙率不均一，大多数细胞仅帖服在材料表面，无法向材料深部长入，缺乏足量的细胞种植，而无法获得充足的细胞外基质结构，很大程度上限制了PLGA微球支架组织工程软骨在临床的应用。 

干细胞作为种子细胞一直是组织工程骨研究的热点之一。胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)系全能干细胞，具有无限增殖和体外长期培养后仍具有可诱导产生从滋养层到内、中、外胚层所有细胞的能力，但由于伦理学和致畸发生率偏高等原因使得基于ESCs的组织工程骨研究相对滞后。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）能在体外增殖维持非分化状态并具有分化成骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能，目前已在机体多个组织器官中成功提取到具有分化潜能的MSCs。在多来源的MSCs中，又以人类骨髓间充质干细胞（hBMSC）较多被应用于组织工程骨软骨的研究，这些研究提示：hBMSC将在组织工程骨软骨方面具有广泛的应用前景。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的生长因子梯度释放微球支架，该微球支架微球桥连均匀，表面结构完整，未发生明显溶解，保持理想孔隙率，可形成网状结构，同时PLGA微球支架具有TGF-β3/BMP-2梯度释放特征。 

本发明的另一个目的在于提供上述基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的生长因子梯度释放微球支架的制备方法，该制备方法工艺简单、易于控制。 

本发明还有一个目的在于提供上述基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的生长因子梯度释放微球支架在制备骨软骨生物修复复合材料中的应用。 

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的生长因子梯度释放微球支架，首先制备PLGA均质微球以及TGF-β3和BMP-2/PLGA微球，分别冻干备用，将冻干的上述微球分散于ddH2O中制成悬浮液，然后将该悬浮液注入底部设有过滤装置的模具中，采用ddH2O过滤并调整ddH2O在模具中的位置，上述微球在模具中堆积，采用无水乙醇烧结上述微球，即形成基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的生长因子梯度释放微球支架即TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架。 

其中PLGA为聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物 (poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA) ，TGF-β3为转化生长因子-β3 (transforming growth factor β3,TGF-β3)，BMP-2为骨形态发生蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2, BMP-2 )，ddH₂O为双蒸水。 

本发明所述的PLGA均质微球通过以下方法制备获得：按摩尔比为1:0.3-3，取乳酸和羟基乙酸随机聚合生成PLGA，将PLGA溶于二氯甲烷DCM中形成PLGA溶解液，将PLGA溶解液经过均质形成均质聚合物液滴，将该聚合物液滴与聚乙烯醇PVA混匀后，经搅拌，过滤、洗涤和冻干后形成PLGA均质微球，储存备用即可。 

其中PLGA溶解液中PLGA的质量百分含量为1-5%，聚合物液滴与聚乙烯醇PVA混匀后形成的混合溶液中PVA的质量百分含量为0.1-1.0%，搅拌时间为3-4h，冻干时间为45-50h，储存温度为-20℃。 

采用本发明方法制备获得PLGA微球具有良好梯度释放性能、降解率、生物相容性，同时是一种均一直径的微球，可显著提高力学性能，同时可携带多种功能性的生物生长因子，间充质干细胞在PLGA支架上具有良好的成骨和软骨分化能力。 

采用本发明方法制备的PLGA微球，微球大小均一适中，支架空隙率均一，随着PLGA微球降解形成小而均一的孔隙，进而可形成类似于松质骨的空间结构，可为骨软骨再生重建提供物理支架和最佳的化学环境，伴随种子细胞释放进入支架内部，更有助于后期新生骨软骨组织形成。 

本发明所述的TGF-β3和BMP-2/PLGA微球通过如下方法制备获得：将TGF-β3溶于牛血清白蛋白BSA中制成TGF-β3原液，将BMP-2溶于牛血清白蛋白BSA中制成BMP-2原液，将PLGA溶于二氯甲烷DCM中形成PLGA溶解液，将TGF-β3原液、BMP-2原液和PLGA溶解液混匀，冰上超声搅拌后形成均匀的乳液，将该乳液经过均质形成均质聚合物液滴，将该聚合物液滴与聚乙烯醇PVA混匀后，经搅拌，过滤、洗涤和冻干后形成TGF-β3/BMP-2-PLGA微球，储存备用即可。 

采用本发明方法制备获得的TGF-β3和BMP-2/PLGA微球，其中TGF-β3和BMP-2生长因子作为种子细胞的生长诱导因子，可促进种子细胞向成骨和软骨细胞方向分化，有利于更多的原始细胞和修复细胞向损伤区域聚集，有利于营养物质和废物的扩散。该TGF-β3和BMP-2/PLGA微球安全无毒、具有良好的生物相容性、生物降解性，具有良好的成囊和成膜的性能。 

其中TGF-β3原液的最终浓度为1-5μg/mL，BMP-2原液的最终浓度为0.1-0.5μg/mL，PLGA的溶解液中PLGA的质量百分含量为1-5%，TGF-β3原液、BMP-2原液和PLGA溶解液的体积比为1:1:20，冰上超声搅拌时的时间为10-30秒，震动幅度为30-60%；聚合物液滴与聚乙烯醇PVA混匀后形成的溶液中PVA的质量百分含量为0.3-1%，搅拌时间为3-4h，冻干时间为45-50h，储存温度为-20℃。 

本发明所述的PLGA均质微球以及TGF-β3和BMP-2/PLGA微球的粒径为50-300μm。 

本发明所述的PLGA均质微球以及TGF-β3和BMP-2/PLGA微球的质量比1:1。 

本发明采用可编程控制注射泵将该悬浮液注入底部设有过滤装置的模具中，所述的模具为圆柱形玻璃容器，使用输液泵和真空注射泵使ddH₂O在圆柱形玻璃容器中的位置为充满圆柱形玻璃容器下部的1/3-2/3，采用无水乙醇烧结PLGA均质微球以及TGF-β3和BMP-2/PLGA微球0.5-1.5h，形成基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的生长因子梯度释放微球支架即TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架，冷冻干燥后，在-20℃储存即可。 

本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：上述基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的生长因子梯度释放微球支架的制备方法，含以下步骤： 

(1) 制备PLGA均质微球，冻干备用；

(2) 制备TGF-β3和BMP-2/PLGA微球，冻干备用；

(3) 将冻干的TGF-β3和BMP-2/PLGA微球以及PLGA均质微球分散于ddH₂O中制成悬浮液，然后将该悬浮液注入底部设有过滤装置的模具中，采用ddH₂O过滤并调整ddH₂O在模具中用量，在模具中堆积TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球以及PLGA均质微球，采用无水乙醇烧结TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球以及PLGA均质微球，形成基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的生长因子梯度释放微球支架即TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架。

本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的：上述基于聚乳酸-羟基乙酸共聚物的生长因子梯度释放微球支架在制备骨软骨生物修复复合材料中的应用。 

与现有技术相比，本发明具有如下优点： 

 (1) 本发明采用的原材料均为安全无毒的聚合物体系，PLGA由两种单体—乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。在美国PLGA通过FDA认证，被正式作为药用辅料收录进美国药典。

(2) 本发明制备的TGF-β3和BMP-2/PLGA微球中，TGF-β3和BMP-2作为种子细胞的生长诱导因子，可促进种子细胞向成骨和软骨细胞方向分化，有利于更多的原始细胞和修复细胞向损伤区域聚集。 

(3) 本发明制备的TGF-β3和BMP-2/PLGA微球支架有一定的材料力学强度，使PLGA微球支架在修复负重区骨软骨缺损中的应用成为可能，新型合成技术制备PLGA微球支架可减少微球表面变性发生，有利于大量种子细胞进入支架内部，类似于松质骨的空间结构有利于营养物质和废物的扩散，随着PLGA微球降解形成小而均一的孔隙，可为骨软骨再生和重建提供物理支架和最佳的化学环境，有助于后期新生骨软骨组织形成，与周围组织紧密接触，易于操作、最大限度减少创伤，降低手术难度、减少病人痛苦、减少感染危险、疤痕形成和治疗费用。 

(4) 本发明制备获得微球支架中，成骨和软骨诱导因子（BMP-2和TGF-β3）分别沿微球支架两端向对侧以最大浓度梯度释放，种子细胞在PLGA支架内沿生长因子浓度梯度分化诱导形成类软骨和类成骨细胞，并获得类似自然结构的骨、软骨和无缝移行区，可为骨软骨的再生和重建提供最佳的空间环境，为骨软骨再生重建提供最佳的物理化学环境，模拟天然骨软骨组织的细胞外基质成分，使材料具有优异的生物相容性及可调的物理机械性能、生物降解性能，更有助于后期新生骨软骨形成。 

(5) 本发明制备的新型梯度释放PLGA微球支架不仅保留了PLGA原有的良好生物相容性，而且还显著提高了PLGA微球支架的力学性能、骨软骨诱导作用和携带种子细胞能力，具有优异的生物相容性，可携带足够量的种子细胞，用于由肿瘤、外伤、严重感染、先天畸形等多种疾病造成的骨软骨缺损的治疗。 

(6) 本发明制备工艺易于控制，操作简便，采用本发明方法制备获得微球支架可最大限度减少创伤，降低手术难度、减少病人痛苦、减少感染危险、疤痕形成和治疗费用，在组织工程骨软骨研究领域具有一定的先进性和创新性，可为组织工程骨软骨研究和临床应用提供新思路和新方法，该支架材料能够实现产业化生产，相关产品具有较大的市场竞争力，可以很好地应用到各类基于软骨缺损的修复中，充分发挥其良好、自然的修复能力，具有广阔的临床应用和市场前景。 

附图说明

图1是实施例2中烧结制备的PLGA微球多孔性的支架的SEM图以及人脐带间充质基质细胞在支架中培养2周时的实时图像，其中序号1和2：表示SEM显示烧结制备的PLGA微球多孔性的支架，序号1的图中可见典型的微连接网状结构，比例尺：序号1和序号2分别为100 μm和50 μm，序号3和4的图是人脐带间充质基质细胞在支架中培养2周时的实时图像，比例尺：1000 μm； 

图2是实施例2中烧结制备的PLGA微球多孔性的支架接种细胞培养3周荧光显微照片，其中序号1表示活细胞和死细胞，序号2的图表示活细胞，序号3的图表示死细胞。比例尺：100 μm。

图3是实施例2中构建的TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架图，其中序号1表示制备的骨软骨整体图，序号2表示微观图。 

具体实施方式

以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。 

实施例1   

1.构建均质PLGA微球

制备直径50μm的PLGA微球。 PLGA组成（摩尔比为1：1的乳酸：羟乙酸，聚合物的分子量 ~25,000）经随机聚合制成PLGA，用二氯甲烷DCM（DCM  30%W/V，质量体积比）溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的质量百分含量为3%，该聚合物溶液通过超声波传感器控制波形发生器，经一个小号同轴喷针头，产生均质聚合物液滴，流入含有0.5%（质量百分含量）PVA的烧杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需搅拌3-4小时，随后硬化形成微球，过滤后用蒸馏水（~1L）以去除残留的PVA。最后，PLGA聚合物微球冻干48小时，-20℃储存，测量微球直径和内部结构、形态备用。

2.构建TGF-β3和BMP-2/PLGA微球 

100 μg BMP-2加入10 mL0.5 μg/mL牛血清白蛋白（BSA）在PBS（磷酸盐缓冲液）得到0.2 μg/mLBMP-2原液。50 μg TGF-β3用25 μg/mL BSA溶解为1 μg/mL的TGF-β3原液，500 mg PLGA溶于5mL DCM （WT6.5克，20%W/V）。250 μLBMP-2和TGF-β3原液分别与5 mL PLGA溶液混合，冰上超声搅拌（50%震动幅度，20秒），形成均匀的PLGA蛋白乳液。该聚合物溶液通过超声波传感器控制波形发生器，经一个小号同轴喷针头，产生均质聚合物液滴，流入含有质量百分含量为0.5%的PVA烧杯中，形成TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物液滴需搅拌3-4小时，随后硬化形成微球，过滤后用蒸馏水（~1L）以去除残留的PVA。最后TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物微球冻干48小时，-20℃储存，测量微球直径和内部结构、形态备用。不同粒径的TGF-β3和BMP-2/PLGA微球通过微粒崩流速控制微球粒径，分批制备获得。

3.构建TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架 

将直径为50μm的冻干TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球按质量体积(g/mL)比为2.5%分散在ddH₂O 中，其中TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球的质量比为1:1分别装入20 mL注射器。使用可编程控制注射泵将该悬浮液注入圆柱形玻璃模具（直径4毫米）。模具底部装有过滤器（颗粒保留> 3μm），ddH₂O过滤，微球在模具积累。使用一个额外的输液泵和真空注射器泵，使蒸馏水在模具保持一定水平，使用输液泵和真空注射泵使ddH₂O在圆柱形玻璃容器中的位置为充满圆柱形玻璃容器下部的1/3，堆积PLGA微球、TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球。无水乙醇烧结PLGA微球、TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球1小时，形成TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架，冷冻干燥2天，-20℃储存。

实施例2  

1.构建均质PLGA微球

制备直径100μm的 PLGA微球。 PLGA组成（摩尔比为1：0.3的乳酸：羟乙酸，聚合物的分子量 ~25,000）经随机聚合制成PLGA，用DCM（二氯甲烷）（DCM  30%W/V，质量体积比）溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的质量百分含量为1%，该聚合物溶液通过超声波传感器控制波形发生器，经一个小号同轴喷针头，产生均质聚合物液滴，流入含有0.8%（质量百分含量）PVA的烧杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需搅拌3-4小时，随后硬化形成微球，过滤后用蒸馏水（~1L）以去除残留的PVA。最后，PLGA聚合物微球冻干50小时，-20℃储存，测量微球直径和内部结构、形态备用。

2.构建TGF-β3和BMP-2/PLGA微球 

取BMP-2加入牛血清白蛋白（BSA）在PBS（磷酸盐缓冲液）得到0.3 μg/mLBMP-2原液。取TGF-β3用BSA溶解为2μg/mL的TGF-β3原液，取PLGA溶于DCM得质量百分含量为2%的PLGA溶解液，将BMP-2原液和TGF-β3原液分别与PLGA溶解液按体积比为1:1:20混合，冰上超声搅拌（50%震动幅度，20秒），形成均匀的PLGA蛋白乳液。该聚合物溶液通过超声波传感器控制波形发生器，经一个小号同轴喷针头，产生均质聚合物液滴，流入含有质量百分含量为0.3%的PVA烧杯中，形成TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物液滴需搅拌3-4小时，随后硬化形成微球，过滤后用蒸馏水（~1L）以去除残留的PVA。最后TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物微球冻干50小时，-20℃储存，测量微球直径和内部结构、形态备用。

TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架通过如下方法制备获得： 

采用上述制备获得的直径100 μm TGF-β3和BMP-2 /PLGA 微球以及直径为100μm的空白PLGA微球制备4 mm (高)x 4 mm(直径)的圆柱体结构支架。冻干TGF-β3和BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球分散在ddH₂O （2.5%W/V），其中TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球与空白PLGA微球的质量比为1:1分别装入20 mL注射器。使用可编程控制注射泵将该悬浮液注入圆柱形玻璃模具（直径4毫米）。模具底部装有过滤器（颗粒保留> 3μm），ddH₂O过滤，微球在模具积累。使用一个额外的输液泵和真空注射器泵，使蒸馏水在模具保持一定水平，使用输液泵和真空注射泵使ddH₂O在圆柱形玻璃容器中的位置为充满圆柱形玻璃容器下部的2/3，堆积PLGA微球、TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球。无水乙醇烧结PLGA微球、TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球1小时，形成内部空间为六角形TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架，冷冻干燥2天，-20℃储存。

实施例3  

1.构建均质PLGA微球

制备直径150μm的 PLGA微球。 PLGA组成（摩尔比为1：2的乳酸：羟乙酸，聚合物的分子量 ~25,000）经随机聚合制成PLGA，用DCM（二氯甲烷）（DCM  30%W/V，质量体积比）溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的质量百分含量为5%，该聚合物溶液通过超声波传感器控制波形发生器，经一个小号同轴喷针头，产生均质聚合物液滴，流入含有1.0%（质量百分含量）PVA的烧杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需搅拌3-4小时，随后硬化形成微球，过滤后用蒸馏水（~1L）以去除残留的PVA。最后，PLGA聚合物微球冻干45小时，-20℃储存，测量微球直径和内部结构、形态备用。

2.构建TGF-β3和BMP-2/PLGA微球 

取BMP-2加入牛血清白蛋白（BSA）在PBS（磷酸盐缓冲液）得到0.4 μg/mLBMP-2原液。取TGF-β3用BSA溶解为3μg/mL的TGF-β3原液，取PLGA溶于DCM得质量百分含量为3%的PLGA溶解液，将BMP-2原液和TGF-β3原液分别与PLGA溶解液按体积比为1:1:20混合，冰上超声搅拌（50%震动幅度，30秒），形成均匀的PLGA蛋白乳液。该聚合物溶液通过超声波传感器控制波形发生器，经一个小号同轴喷针头，产生均质聚合物液滴，流入含有质量百分含量为0.8%的PVA烧杯中，形成TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物液滴需搅拌3-4小时，随后硬化形成微球，过滤后用蒸馏水（~1L）以去除残留的PVA。最后TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物微球冻干50小时，-20℃储存，测量微球直径和内部结构、形态备用。

TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架通过如下方法制备获得： 

采用直径150 μm TGF-β3和BMP-2/PLGA微球以及直径为150μm的空白PLGA微球制备4 mm (高)x 4 mm(直径)的圆柱体结构支架。冻干TGF-β3和BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球分散在ddH₂O （2.5%W/V），其中TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球与空白PLGA微球的质量比为1:1，分别装入20mL射器。使用可编程控制注射泵将该悬浮液注入圆柱形玻璃模具（直径4毫米）。模具底部装有过滤器（颗粒保留> 3μm），ddH₂O过滤，微球在模具积累。使用一个额外的输液泵和真空注射器泵，使蒸馏水在模具保持一定水平，使用输液泵和真空注射泵使ddH₂O在圆柱形玻璃容器中的位置为充满圆柱形玻璃容器下部的1/2，堆积PLGA微球、TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球。无水乙醇烧结PLGA微球、TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球1小时，形成内部空间为六角形TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架，冷冻干燥2天，-20℃储存。

实施例4 

1.构建均质PLGA微球

制备直径200μm的 PLGA微球。 PLGA组成（摩尔比为1：3的乳酸：羟乙酸，聚合物的分子量 ~25,000）经随机聚合制成PLGA，用DCM（二氯甲烷）（DCM  30%W/V，质量体积比）溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的质量百分含量为2%，该聚合物溶液通过超声波传感器控制波形发生器，经一个小号同轴喷针头，产生均质聚合物液滴，流入含有0.3%（质量百分含量）PVA的烧杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需搅拌3-4小时，随后硬化形成微球，过滤后用蒸馏水（~1L）以去除残留的PVA。最后，PLGA聚合物微球冻干47小时，-20℃储存，测量微球直径和内部结构、形态备用。

2.构建TGF-β3和BMP-2/PLGA微球 

取BMP-2加入牛血清白蛋白（BSA）在PBS（磷酸盐缓冲液）得到0.5μg/mLBMP-2原液。取TGF-β3用BSA溶解为5μg/mL的TGF-β3原液，取PLGA溶于DCM得质量百分含量为5%的PLGA溶解液，将BMP-2原液和TGF-β3原液分别与PLGA溶解液按体积比为1:1:20混合，冰上超声搅拌（60%震动幅度，10秒），形成均匀的PLGA蛋白乳液。该聚合物溶液通过超声波传感器控制波形发生器，经一个小号同轴喷针头，产生均质聚合物液滴，流入含有质量百分含量为1.0%的PVA烧杯中，形成TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物液滴需搅拌3-4小时，随后硬化形成微球，过滤后用蒸馏水（~1L）以去除残留的PVA。最后TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物微球冻干47小时，-20℃储存，测量微球直径和内部结构、形态备用。

TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架通过如下方法制备获得： 

采用直径200 μm TGF-β3和BMP-2/PLGA 微球以及直径为200μm的空白PLGA微球制备4 mm (高)x 4 mm(直径)的圆柱体结构支架。冻干TGF-β3和BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球分散在ddH₂O （2.5% W/ V），其中TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球与空白PLGA微球的质量比为1:1，分别装入20 mL射器。使用可编程控制注射泵将该悬浮液注入圆柱形玻璃模具（直径4毫米）。模具底部装有过滤器（颗粒保留> 3μm），ddH₂O过滤，微球在模具积累。使用一个额外的输液泵和真空注射器泵，使蒸馏水在模具保持一定水平，使用输液泵和真空注射泵使ddH₂O在圆柱形玻璃容器中的位置为充满圆柱形玻璃容器下部的1/2，堆积PLGA微球、TGF-β3和BMP-2/PLGA 微球。100%乙醇烧结PLGA微球1小时，形成内部空间为六角形TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架，冷冻干燥2天，-20℃储存。

实施例5

1.构建均质PLGA微球

制备直径250μm的 PLGA微球。 PLGA组成（摩尔比为1：0.5的乳酸：羟乙酸，聚合物的分子量 ~25,000）经随机聚合制成PLGA，用DCM（二氯甲烷）（DCM  30%W/V，质量体积比）溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的质量百分含量为2.5%，该聚合物溶液通过超声波传感器控制波形发生器，经一个小号同轴喷针头，产生均质聚合物液滴，流入含有0.6%（质量百分含量）PVA的烧杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需搅拌3-4小时，随后硬化形成微球，过滤后用蒸馏水（~1L）以去除残留的PVA。最后，PLGA聚合物微球冻干49小时，-20℃储存，测量微球直径和内部结构、形态备用。不同粒径的均质PLGA微球通过微粒崩流速控制微球粒径，分批制备获得。

2.构建TGF-β3和BMP-2/PLGA微球 

取BMP-2加入牛血清白蛋白（BSA）在PBS（磷酸盐缓冲液）得到0.35μg/mLBMP-2原液。取TGF-β3用BSA溶解为4.5μg/mL的TGF-β3原液，取PLGA溶于DCM得质量百分含量为3.5%的PLGA溶解液，将BMP-2原液和TGF-β3原液分别与PLGA溶解液按体积比为1:1:20混合，冰上超声搅拌（50%震动幅度，30秒），形成均匀的PLGA蛋白乳液。该聚合物溶液通过超声波传感器控制波形发生器，经一个小号同轴喷针头，产生均质聚合物液滴，流入含有质量百分含量为0.5%的PVA烧杯中，形成TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物液滴需搅拌3-4小时，随后硬化形成微球，过滤后用蒸馏水（~1L）以去除残留的PVA。最后TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物微球冻干49小时，-20℃储存，测量微球直径和内部结构、形态备用。

TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架通过如下方法制备获得： 

采用直径250μm TGF-β3和BMP-2/PLGA 微球以及直径为250μm的空白空白PLGA微球制备4mm(高)x4mm(直径)的圆柱体结构支架。冻干TGF-β3和BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球分散在ddH₂O（2.5%W/V，微球与水的质量体积比），其中TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球与空白PLGA微球的质量比为1:1，分别装入20 mL射器。使用可编程控制注射泵将该悬浮液注入圆柱形玻璃模具（直径4毫米）。模具底部装有过滤器（颗粒保留> 3μm），ddH₂O过滤，微球在模具积累。使用一个额外的输液泵和真空注射器泵，使蒸馏水在模具保持一定水平，使用输液泵和真空注射泵使ddH₂O在圆柱形玻璃容器中的位置为充满圆柱形玻璃容器下部的1/2，堆积PLGA微球、TGF-β3和BMP-2/PLGA 微球。无水乙醇烧结PLGA微球、、TGF-β3和BMP-2/PLGA 微球1小时，形成内部空间为六角形TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架，冷冻干燥2天，-20℃储存。

实施例6

1.构建均质PLGA微球

制备直径300μm的 PLGA微球。 PLGA组成（摩尔比为1：1的乳酸：羟乙酸，聚合物的分子量 ~25,000）经随机聚合制成PLGA，用DCM（二氯甲烷）（DCM  30%W/V，质量体积比）溶解PLGA形成PLGA溶解液，其中PLGA溶解液中PLGA的质量百分含量为5%，该聚合物溶液通过超声波传感器控制波形发生器，经一个小号同轴喷针头，产生均质聚合物液滴，流入含有0.5%（质量百分含量）PVA的烧杯中，形成PLGA聚合物液滴。早期PLGA聚合物液滴需搅拌3-4小时，随后硬化形成微球，过滤后用蒸馏水（~1L）以去除残留的PVA。最后，PLGA聚合物微球冻干48小时，-20℃储存，测量微球直径和内部结构、形态备用。不同粒径的均质PLGA微球通过微粒崩流速控制微球粒径，分批制备获得。

2.构建TGF-β3和BMP-2/PLGA微球 

取BMP-2加入牛血清白蛋白（BSA）在PBS（磷酸盐缓冲液）得到0.1μg/mLBMP-2原液。取TGF-β3用BSA溶解为1μg/mL的TGF-β3原液，取PLGA溶于DCM得质量百分含量为1%的PLGA溶解液，将BMP-2原液和TGF-β3原液分别与PLGA溶解液按体积比为1:1:20混合，冰上超声搅拌（50%震动幅度，30秒），形成均匀的PLGA蛋白乳液。该聚合物溶液通过超声波传感器控制波形发生器，经一个小号同轴喷针头，产生均质聚合物液滴，流入含有质量百分含量为0.5%的PVA烧杯中，形成TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物液滴，早期TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物液滴需搅拌3-4小时，随后硬化形成微球，过滤后用蒸馏水（~1L）以去除残留的PVA。最后TGF-β3和BMP-2/PLGA聚合物微球冻干48小时，-20℃储存，测量微球直径和内部结构、形态备用。

TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架通过如下方法制备获得： 

采用直径300μm TGF-β3和BMP-2/PLGA 微球以及直径为300μm的空白空白PLGA微球制备4mm(高)x4mm(直径)的圆柱体结构支架。冻干TGF-β3和BMP-2/PLGA微球和空白PLGA微球分散在ddH₂O（2.5%W/V，微球与水的质量体积比），其中TGF-β3和 BMP-2/PLGA微球与空白PLGA微球的质量比为1:1，分别装入20 mL射器。使用可编程控制注射泵将该悬浮液注入圆柱形玻璃模具（直径4毫米）。模具底部装有过滤器（颗粒保留> 3μm），ddH₂O过滤，微球在模具积累。使用一个额外的输液泵和真空注射器泵，使蒸馏水在模具保持一定水平，使用输液泵和真空注射泵使ddH₂O在圆柱形玻璃容器中的位置为充满圆柱形玻璃容器下部的1/2，堆积PLGA微球、TGF-β3和BMP-2/PLGA 微球。无水乙醇烧结PLGA微球、、TGF-β3和BMP-2/PLGA 微球1小时，形成内部空间为六角形TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架，冷冻干燥2天，-20℃储存。

以下为上述实施例构建的TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架的应用试验： 

1.hBMSCs培养

自体hBMSCs 的体外培养和成骨诱导从患者骼后上棘经穿刺抽取骨髓10-20 mL，将获取的骨髓置于Percoll 分离液上（密度1.073 g/L，Pharmacia 公司，美国），骨髓与分离液的比例为1∶2，2 550 r/min 离心30 min， 吸取中间云雾状细胞层，以2×10⁷ cell/cm² 的密度接种于培养皿，进行体外细胞扩增，取第四代hBMSCs备用。

表1实验分组共计10组 

FactorLevels微球直径50、100、150、200、250、300μm生长因子TGF-β3, BMP-2

以下为实施例2中构建的TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架的应用试验：

经消毒灭菌处理，50-100 μLhUCMSCs细胞悬液加入实施例2中制备获得的TGF-β3/ BMP-2梯度释放PLGA微球支架，最终细胞浓度约25 million cells/mL。接种细胞6小时后，加入培养液，每两天换液一次，共培养6周。培养液包括：DMEM-high glucose, 10% 小牛血清（FBS）, 25 μg/mL 抗坏血酸（ascorbic acid）, 1% 非必需氨基酸（non-essential amino acids, NEAA）和1% 抗生素（antibiotics）。置入细胞孵育箱备用，培养条件：温度37℃、CO₂浓度90%，结果如图1，图2和图3中所示。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。