HLA-A*1101限制的WT1肽及含有其的药物组合物

摘要

公开的是：HLA-A*1101限制的WT1肽，具体而言为含有由WT1蛋白质9个邻接氨基酸残基组成的氨基酸序列的肽，能够结合HLA-A*1101分子，并且具有诱导CTL的能力；包含两个肽单体的肽二聚体，所述肽单体各自包含含有至少一个半胱氨酸残基且来自WT1蛋白质的由9个邻接氨基酸组成的氨基酸序列，其中两个肽单体通过二硫键彼此结合，且所述肽二聚体能够结合HLA-A*1101分子并且具有诱导CTL的能力；编码该肽的多核苷酸；含有肽或肽二聚体的用于治疗和/或预防癌症的药物组合物；等等。

说明书

本申请是国际申请日为2007年12月14日的国际申请 PCT/JP2007/074146进入中国、申请号为200780048749.1的题为 “HLA-A*1101限制的WT1肽及含有其的药物组合物”的发明专利申请的 分案申请。

技术领域

本发明涉及HLA-A*1101限制的WT1肽，具体而言为含有由WT1 蛋白质9个邻接氨基酸组成的氨基酸序列的肽，其中该肽具有结合 HLA-A*1101分子的能力，并且具有诱导CTL的能力。本发明也涉及具 有结合HLA-A*1101分子的能力并且具有诱导CTL的能力的肽二聚体， 其中两个肽单体通过二硫键彼此结合，所述肽单体各自含有由WT1蛋 白质9个邻接氨基酸组成并且含有至少一个半胱氨酸残基的氨基酸序 列。此外，本发明涉及编码该肽的多核苷酸、含有其的用于治疗和/或预 防癌症的药物组合物等。

背景技术

WT1基因(Wilms氏肿瘤1基因)被鉴定为负责儿童肾癌Wilms肿 瘤的基因(非专利文件1和2)。WT1是具有锌指结构的转录因子。最初， 认为WT1基因是肿瘤抑制基因。然而，后来的研究(非专利文件3、4、 5和6)显示WT1基因相反在造血肿瘤和实体癌中起到癌基因的功能。

WT1基因在许多类型的恶性肿瘤中高水平表达。于是，已检查无突 变的WT1基因产物(其是自身蛋白质)是否在活体中具有免疫原性。结果 揭示，在肿瘤细胞中高水平表达的衍生自WT1基因的蛋白质通过细胞 内加工进行片段化，产生的肽与MHC I类分子形成复合物，且该复合物 被呈递在细胞表面，而识别这种复合物的CTL可以通过肽接种诱导(非 专利文件7、8和9)。在以WT1肽或WT1 cDNA免疫的小鼠中也显示， 表达WT1基因的移植的肿瘤细胞以高概率被排斥(非专利文件7和10)， 然而生理上表达WT1基因的正常组织没有被所诱导的CTL损伤(非专利 文件7)。使用人细胞的体外实验显示，当使用Db126肽或WH187肽(SEQ ID No：1的氨基酸187-195，SLGEQQYSV)刺激具有HLA-A^*0201的人 外周血单核细胞时，WT1特异性CTL得到诱导，而诱导的CTL对内源 性高水平表达WT1基因的肿瘤细胞具有特异的细胞毒活性，且这种CTL 的细胞毒活性是HLA-A2限制的(非专利文件11)，其中所述Db126肽或 WH187肽具有结合人MHC I类分子之一HLA-A^*0201分子的高能力。 使用与HLA-A^*2402(最常见于日本人HLA-A等位基因)匹配的WT1肽 (WT1235；SEQ ID No：1的氨基酸235-243，CMTWNQMNL)的人细胞体 外实验显示，WT1特异性CTL(TAK-1)得到诱导(非专利文件12)，而诱 导的CTL不抑制正常造血干细胞的集落形成活性，所述正常造血干细胞 部分生理上表达WT1基因(非专利文件12和13)。这些报告强烈提示， WT1特异性CTL不仅在小鼠而且在人类中是可诱导的，这种CTL对以 高水平表达WT1基因的肿瘤细胞具有细胞毒活性，但是对生理上表达 WT1基因的正常细胞不具有细胞毒活性(非专利文件7、10、11、12和 13)。

WT1基因产物作为核蛋白存在，并在细胞质中由蛋白酶体加工以片 段化为肽。片段化的肽由TAP(抗原肽转运体)分子转运到内质网腔中， 与MHC I类分子形成复合物，并且呈递在细胞表面上。作为CTL前体 细胞经TCR识别WT1肽-MHC I类分子复合物的结果，WT1特异性CTL 得到诱导，从而对通过MHC I类分子呈递WT1基因产物的肿瘤细胞施 加细胞毒作用(非专利文件7、8和9)。于是，至少要求用于靶向WT1 基因产物的癌症免疫治疗中的WT1肽是在活体中与MHC I类分子结 合的形式。然而，MHC I类分子是多样的，与各自MHC I类分子结合的 WT1肽的氨基酸序列彼此不同。因此，要求提供与MHC I类各亚型匹 配的肽。然而，迄今为止仅仅已知HLA-A^*2402分子、HLA-A^*0201分子、 HLA-A^*2601分子和HLA-A^*3303分子限制的肽是HLA分子限制的WT1 肽(分别见专利文件1、非专利文件11、专利文件2和专利文件3)。因 此，需要发现HLA-A*1101限制的WT1肽。

专利文件1：WO 2003/106682

专利文件2：WO 2005/095598

专利文件3：日本专利申请号2006-45287

非专利文件1：Daniel A.Haber等人，Cell.1990Jun 29； 61(7)：1257-69.

非专利文件2：Call KM等人，Cell.1990Feb 9；60(3)：509-20.

非专利文件3：Menke AL等人，Int Rev Cytol.1998；181：151-212.综 述。

非专利文件4：Yamagami T等人，Blood.1996Apr 1；87(7)：2878-84.

非专利文件5：Inoue K等人，Blood.1998Apr 15；91(8)：2969-76.

非专利文件6：Tsuboi A等人，Leuk Res.1999May；23(5)：499-505.

非专利文件7：Oka Y等人，J Immunol.2000Feb 15；164(4)：1873-80.

非专利文件8：Melief CJ等人，Immunol Rev.1995Jun；145：167-77.

非专利文件9：Ritz J，J Clin Oncol.1994Feb；12(2)：237-8.

非专利文件10：Tsuboi A等人，J Clin Immunol.2000May； 20(3)：195-202.

非专利文件11：Oka Y等人，Immunogenetics.2000Feb； 51(2)：99-107.

非专利文件12：Ohminami H等人，Blood.2000Jan 1；95(1)：286-93.

非专利文件13：Gao L等人，Blood.2000Apr 1；95(7)：2198-203.

发明内容

本发明拟解决的问题

本发明拟解决的问题是提供HLA-A*1101分子限制的且包含WT1 蛋白质氨基酸序列的肽、编码其的多核苷酸、以及包含其的用于治疗和 /或预防癌症的药物组合物等。

解决问题的方法

作为考虑到上述情况的大量研究的结果，本发明人已发现，在各自 含有由WT1蛋白质9个邻接氨基酸组成的氨基酸序列的肽中，各自具 有结合HLA-A*1101分子的能力的肽能够以高比率诱导WT1特异性 CTL。因此，本发明得以完成。

本发明提供：

(1)含有由WT1蛋白质9个邻接氨基酸组成的氨基酸序列的肽，其 中该肽具有结合HLA-A*1101分子的能力，并且具有诱导CTL的能力；

(2)根据(1)的肽，其中氨基酸序列第9位氨基酸是Lys或Arg；

(3)根据(1)的肽，其中氨基酸序列选自：

Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys(SEQ ID No：2)，

Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg(SEQ ID No：3)，

Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys(SEQ ID No：4)，

Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg(SEQ ID No：5)，

Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys(SEQ ID No：6)，

Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No：7)，

Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg(SEQ ID No：8)，

Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys(SEQ ID No：9)，和

Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys(SEQ ID No：10)；

(4)根据(3)的肽，其中氨基酸序列是Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys(SEQ ID No：2)；

(5)具有结合HLA-A*1101分子的能力并具有诱导CTL能力的肽二 聚体，其中两个肽单体通过二硫键彼此结合，所述肽单体各包含由WT1 蛋白质9个邻接氨基酸组成并包含至少一个半胱氨酸残基的氨基酸序 列；

(6)根据(5)的肽二聚体，其中肽单体的氨基酸序列选自：

Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg(SEQ ID No：3)，

Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No：7)，

Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg(SEQ ID No：8)，和

Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys(SEQ ID No：9)；

(7)治疗或预防癌症的药物组合物，包含(1)的肽和/或(5)的肽二聚 体；

(8)治疗或预防癌症的方法，包括向HLA-A*1101阳性受试者施用 有效量的(1)的肽和/或(5)的肽二聚体；

(9)编码(1)的肽的多核苷酸；

(10)含有(9)的多核苷酸的表达载体；

(11)治疗或预防癌症的药物组合物，包含(9)的多核苷酸或(10)的载 体；

(12)治疗或预防癌症的方法，包括向HLA-A*1101阳性受试者施用 有效量的(9)的多核苷酸或(10)的载体；

(13)WT1特异性CTL，所述WT1特异性CTL由(1)的肽和/或(5) 的肽二聚体诱导；

(14)诱导WT1特异性CTL的方法，包括在(1)的肽和/或(5)的肽二 聚体的存在下培养外周血单核细胞，以从外周血单核细胞诱导WT1特 异性CTL；

(15)诱导WT1特异性CTL的试剂盒，包括(1)的肽和/或(5)的肽二 聚体作为基本组分；

(16)呈递WT1肽的抗原呈递细胞，所述抗原呈递细胞由(1)的肽和 /或(5)的肽二聚体诱导；

(17)诱导呈递WT1肽的抗原呈递细胞的方法，包括在(1)的肽和/ 或(5)的肽二聚体的存在下培养未成熟抗原呈递细胞，以从未成熟抗原呈 递细胞诱导呈递WT1肽的抗原呈递细胞；

(18)诱导呈递WT1肽的抗原呈递细胞的试剂盒，包括(1)的肽和/ 或(5)的肽二聚体作为基本组分；以及

(19)诊断癌症的方法，包括使用(13)的CTL或(16)的抗原呈递细胞。

发明效果

本发明提供HLA-A*1101限制的并含有由WT1蛋白质9个邻接氨 基酸组成的氨基酸序列的肽、编码其的多核苷酸、以及包含其的治疗和 /或预防癌症的药物组合物等。因此，可能在具有HLA-A*1101的受试者 中体内或体外诱导WT1特异性CTL。因为日本人中HLA-A*1101阳性 率是高的(约17.9％)，所以可以在大范围受试者中诱导WT1特异性CTL。

附图说明

图1表示以WT1₂₅₁诱导的CTL的细胞毒活性。

图2表示以WT1₂₇₉诱导的CTL的细胞毒活性。

图3表示以WT1₃₁₂诱导的CTL的细胞毒活性。

图4表示以WT1₃₁₃诱导的CTL的细胞毒活性。

图5表示以WT1₃₃₈诱导的CTL的细胞毒活性。

图6表示以WT1₃₇₈诱导的CTL的细胞毒活性。

图7表示以WT1₃₈₆诱导的CTL的细胞毒活性。

图8表示以WT1₄₁₅诱导的CTL的细胞毒活性。

图9表示以WT1₄₃₆诱导的CTL的细胞毒活性。

图10表示以WT1₃₇₈肽诱导的CTL的细胞毒活性(a、b和c分别表 示使用HLA-A*1101-阳性健康供体1、2和3的PBMC观察到的细胞毒 活性)。

图11表示以WT1₃₇₈肽二聚体诱导的CTL的细胞毒活性(a和b分别 表示使用HLA-A*1101-阳性健康供体1和2的PBMC观察到的细胞毒活 性)。

图12表示以修饰的WT1₃₇₈肽(G→I)诱导的CTL的细胞毒活性(a、 b和c分别表示使用HLA-A*1101-阳性健康供体1、2和3的PBMC观察 到的细胞毒活性)。

图13表示以修饰的WT1₃₇₈肽(G→V)诱导的CTL的细胞毒活性(a、 b和c分别表示使用HLA-A*1101-阳性健康供体1、2和3的PBMC观察 到的细胞毒活性)。

图14表示以WT1₃₇₉肽诱导的CTL的细胞毒活性(a、b和c分别表 示使用HLA-A*1101-阳性健康供体1、2和3的PBMC观察到的细胞毒 活性)。

具体实施方式

一方面，本发明涉及含有由WT1蛋白质9个邻接氨基酸组成的氨 基酸序列的肽，其中该肽具有结合HLA-A*1101分子的能力，并且具有 诱导CTL的能力(在此也称为“WT1肽”)。人WT1蛋白质的氨基酸序列 示于SEQ ID No：1。本发明的肽含有由SEQ ID No：1所示氨基酸序列中 9个邻接氨基酸组成的氨基酸序列。当本发明的肽含有包含半胱氨酸的 氨基酸序列时，可以通过用另一种物质例如另一个氨基酸(例如丝氨酸、 丙氨酸和α-氨基丁酸)置换氨基酸序列中的半胱氨酸、或者通过以本领 域已知的保护基团(例如羧甲基或吡啶基乙基)修饰半胱氨酸的SH基， 来增加稳定性，所述包含半胱氨酸的氨基酸序列例如下述SEQ ID No：3、 7、8或9的氨基酸序列。本发明的肽是癌抗原肽，作为通过抗原呈递细 胞呈递由本发明的肽在细胞内经加工而产生的肽的结果，所述癌抗原肽 可以诱导CTL。

如上所述，本发明目的是获得HLA-A*1101限制的肽。因此，本发 明的肽具有结合HLA-A*1101分子的能力。可以通过本领域已知方法确 定该结合能力。这种方法的实例包括基于计算机的方法(例如Rankpep、 BIMAS或SYFPEITHI)和使用已知具有结合HLA-A*1101分子的能力的 肽的竞争结合测试。例如，可以将确定的结合能力与已知HLA-A*1101 限制的肽的能力相比较，以判断本发明的肽是否具有结合能力。根据本 发明的具有结合能力的肽的实例包括如由实施例1中所述方法确定的与 HLA-A*1101分子亲和力分数为4或更高、优选5或更高、更优选6或 更高的肽。

本发明的肽另外具有诱导CTL的能力。例如在造血肿瘤如白血病、 骨髓异常增生综合征、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤和实体癌如胃癌、结 肠癌、肺癌、乳癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、 子宫癌、宫颈癌或卵巢癌中，WT1基因以其天然形式在高水平表达。因 此，本发明的肽可以在罹患这种疾病的受试者中以高比率诱导CTL。诱 导CTL的能力指体内或体外诱导CTL的能力。可以使用常用方法确定 这种能力，例如其中使用Cr释放测定确定CTL的细胞毒活性的方法。

本发明的肽可以在氨基酸序列第9位具有Lys或Arg。认为该肽结 合HLA-A*1101分子的能力通过具有这种氨基酸而更高。

本发明的肽中包含的由9个氨基酸组成的氨基酸序列优选是Ala Ala Gly Ser Ser Ser Ser Val Lys(SEQ ID No：2)、Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg(SEQ ID No：3)、Arg Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys(SEQ ID No：4)、Ser Ala Ser Glu Thr Ser Glu Lys Arg(SEQ ID No：5)、Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys(SEQ ID No：6)、Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No：7)、Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg(SEQ ID No：8)、 Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys(SEQ ID No：9)或Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys (SEQ ID No：10)。最优选的，它是Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No：7)。另外，它可以在SEQ ID Nos：2-10 中任一项的9个氨基酸中具有以其他氨基酸置换一至几个、优选一至五 个氨基酸。9个氨基酸或其他置换的氨基酸中任一个可以经过适当修饰。 在任何情况下，本发明的肽保持结合HLA-A*1101分子的能力。

如上所述，本发明的肽可以是任一个肽，只要其含有衍生自WT1 蛋白质并由9个邻接氨基酸组成的氨基酸序列。因此，本发明的肽可以 是例如仅由SEQ ID No：2-10任一项所示氨基酸序列组成的肽，或者是 包含EQ ID No：2-10任一项所示氨基酸序列的WT1蛋白质或其部分。 本发明的肽中包含的氨基酸数目没有具体限制，且该数目可以是例如 9-500、9-300、9-200、9-100、9-50、9-30和9-12个氨基酸。可以将各 种物质附着在本发明的肽中由9个邻接氨基酸组成的氨基酸序列的N末 端和/或C末端。例如，可以附着氨基酸、肽或其类似物。如果将这种 物质附着在本发明的肽上，可以由活体中的酶或者通过例如细胞内加工 等过程对该物质进行加工，且最终，可以产生由9个邻接氨基酸组成的 氨基酸序列，并将其作为与HLA-A*1101分子的复合物呈递在细胞表面， 从而导致诱导CTL的作用。该物质可以是调节本发明的肽的溶解度或增 加其稳定性(对蛋白酶的抗性等)的物质。另外，它可以是将本发明的肽 特异性递送到例如给定组织或器官的物质，或者它可以具有增加抗原呈 递细胞的吸收效率等作用。该物质可以是增加诱导CTL的能力的物质， 例如辅助肽等。

可以通过本领域通用方法或其修改合成本发明的肽。在例如Peptide  Synthesis，Interscience，New York，1966；The Proteins，Vol 2，Academic  Press Inc.，New York，1976；Peptide-Gosei，Maruzen Co.，Ltd.，1975； Peptide-Gosei No Kiso To Jikken，Maruzen Co.，Ltd.，1985；以及Iyakuhin  No Kaihatsu(Zoku)，Vol.14，Peptide-Gosei，Hirokawa-Book store，1991 中对这种方法进行了描述。

也可以使用遗传工程技术制备本发明的肽，所述遗传工程技术基于 编码本发明的肽的核苷酸序列信息。这种遗传工程技术为本领域技术人 员所公知。

另一方面，本发明涉及具有结合HLA-A*1101分子的能力和诱导 CTL的能力的肽二聚体，其中两个肽单体通过二硫键彼此结合，所述肽 单体各包含由WT1蛋白质9个邻接氨基酸组成并含有至少一个半胱氨 酸残基的氨基酸序列(此后称为“WT1肽二聚体”)。与肽单体相比，本发 明的肽二聚体的稳定性通过形成二聚体而增加。本发明的肽二聚体是肿 瘤抗原肽二聚体，作为通过抗原呈递细胞呈递本发明的肽在细胞中经加 工而产生的肽的结果，所述肿瘤抗原肽二聚体可以诱导CTL。

两个肽单体通过存在于单体中的半胱氨酸残基之间的二硫键而结 合，形成本发明的肽二聚体。因此，本发明的WT1肽二聚体中包含的 各个肽单体是如上所述的WT1肽，并且含有至少一个半胱氨酸残基。 本发明的WT1肽二聚体可以是同二聚体或异二聚体。

在本发明的WT1肽二聚体中，肽单体包含的氨基酸序列优选是Pro Ile Leu Cys Gly Ala Gln Tyr Arg(SEQ ID No：3)、Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No：7)、Lys Thr Cys Gln Arg Lys Phe Ser Arg(SEQ ID No：8)或Ser Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gln Lys(SEQ ID No：9)。最优选 的，它是Thr Gly Val Lys Pro Phe Gln Cys Lys(SEQ ID No：7)。

可以使用本领域已知方法制备本发明的WT1肽二聚体。例如，如 果肽单体含有一对半胱氨酸，那么可以通过例如去除所有保护基团(包括 半胱氨酸侧链上的)，然后将产生的单体溶液在碱性条件下空气氧化，或 者在碱性或酸性条件下加入氧化剂以形成二硫键，来制备本发明的WT1 肽二聚体。氧化剂的实例包括碘、二甲基亚砜(DMSO)和铁氰化钾。

当各肽单体包含两个或更多半胱氨酸残基时，也可以通过上述方法 制备本发明的WT1肽二聚体。对于这种情况，由于不同类型的二硫键 而获得异构体。可选择地，可以通过选择半胱氨酸侧链保护基团的组合 而制备本发明的WT1肽二聚体。保护基团组合的实例包括MeBzl(甲苄 基)基团和Acm(乙酰氨基甲基)基团、Trt(三苯甲基)基团和Acm基团、 Npys(3-硝基-2-吡啶基硫代)基团和Acm基团、以及S-Bu-t(S-叔丁基) 基团和Acm基团的组合。例如，对于MeBzl基团与Acm基团的组合的 情况，可以通过去除除了MeBzl基团之外的保护基团和除了半胱氨酸侧 链上的保护基团之外的保护基团，将产生的单体溶液进行空气氧化，以 形成受保护的半胱氨酸残基之间的二硫键，然后去保护并使用碘氧化， 以形成先前以Acm保护的半胱氨酸残基之间的二硫键，来制备WT1肽 二聚体。

另一方面，本发明涉及治疗或预防癌症的药物组合物，所述药物组 合物包含HLA-A*1101限制的WT1肽和/或WT1肽二聚体。WT1基因 在各种癌症和肿瘤中高水平表达，所述癌症和肿瘤包括造血肿瘤例如白 血病、骨髓异常增生综合征、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤和实体癌如胃 癌、结肠癌、肺癌、乳癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列 腺癌、子宫癌、宫颈癌或卵巢癌。因此，本发明的药物组合物可用于癌 症的治疗或预防。当将本发明的药物组合物施用于HLA-A*1101阳性受 试者时，WT1特异性CTL由该药物组合物中包含的HLA-A*1101限制 的WT1肽或WT1肽二聚体诱导，而受试者中的癌细胞被这种CTL损伤。

本发明的药物组合物除了作为活性成分的HLA-A*1101限制的 WT1肽和/或WT1肽二聚体之外，可以包含例如载体、赋形剂等。本发 明的药物组合物中包含的HLA-A*1101限制的WT1肽或WT1肽二聚体 诱导WT1特异性CTL。因此，本发明的药物组合物可以包含合适的佐 剂，或可以与合适的佐剂一起施用以增强诱导效率。优选佐剂的实例包 括但不限于完全或不完全弗氏佐剂和氢氧化铝。

可以依赖于状况例如疾病类型、受试者的状况或靶位点，适当选择 本发明的药物组合物的施用方法。这种方法的实例包括但不限于皮内施 用、皮下施用、肌内施用、静脉内施用、经鼻施用和经口施用。可以依 赖于状况例如疾病类型、受试者的状况或靶位点，适当选择本发明的药 物组合物中包含的肽或肽二聚体的量，以及本发明的药物组合物的剂量 形式、施用次数等。该肽的单次剂量通常为0.0001mg-1000mg，优选 0.001mg-1000mg。

另一方面，本发明涉及治疗或预防癌症的方法，包括将有效量的 WT1肽和/或WT1肽二聚体施用于HLA-A*1101阳性受试者。治疗或预 防的癌症可以是任一种，且其实例包括造血肿瘤例如白血病、骨髓异常 增生综合征、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤和实体癌如胃癌、结肠癌、肺 癌、乳癌、生殖细胞癌、肝癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、 宫颈癌或卵巢癌。

另一方面，本发明涉及确定HLA-A*1101阳性受试者中WT1特异 性CTL的存在或量的方法，包括：

(a)将WT1肽和HLA-A*1101分子的复合物与来自受试者的样品反 应；并

(b)确定该样品中所含的识别复合物的CTL的存在或量。来自受试 者的样品可以是任一种，只要其可能含有淋巴细胞。样品实例包括体液 例如血液或淋巴和组织。可以使用本领域技术人员已知方法例如生物素 -链霉抗生物素蛋白方法，将WT1肽和HLA-A*1101分子的复合物制 备为例如四聚体或五聚体。可以通过本领域技术人员已知方法测量识别 这种复合物的CTL的存在或量。在本发明的这一方面，可以将复合物标 记。可以将已知标记例如荧光标记或放射性标记用作标记。标记使得 CTL存在或量的确定容易且快速。

因此，本发明也提供在HLA-A*1101阳性受试者中确定WT1特异 性CTL存在或量的组合物，其含有HLA-A*1101限制的WT1肽。

另外，本发明提供在HLA-A*1101阳性受试者中确定WT1特异性 CTL存在或量的试剂盒，其含有HLA-A*1101限制的WT1肽。

另一方面，本发明涉及使用WT1肽和HLA-A*1101分子复合物产 生WT1特异性CTL的方法，包括：

(a)将该复合物与样品反应；并

(b)获得该样品中所含的识别复合物的CTL。WT1肽和 HLA-A*1101分子的复合物如上所述。样品可以是任一种，只要其可能 含有淋巴细胞。样品实例包括来自受试者的样品，例如血液和细胞培养 物。可以使用本领域技术人员已知方法例如FACS或MACS获得识别该 复合物的CTL。本发明允许培养获得的WT1特异性CTL，并将其用于 治疗或预防各种癌症。

因此，本发明也涉及WT1特异性CTL，可以通过使用WT1肽和 HLA-A*1101分子的复合物产生WT1特异性CTL的方法获得所述WT1 特异性CTL。

另一方面，本发明涉及编码HLA-A*1101限制的WT1肽的多核苷 酸。本发明的多核苷酸可以是DNA或RNA。可以基于HLA-A*1101限 制的WT1肽的氨基酸序列确定本发明的多核苷酸的碱基序列。可以通 过合成DNA或RNA的已知方法(例如化学合成方法)、PCR方法等制备 所述多核苷酸。

另一方面，本发明涉及含有所述多核苷酸的表达载体。可以依赖于 所要引入本发明的表达载体的宿主类型、使用目的等，适当选择表达载 体的类型、除多核苷酸序列之外所含序列等。通过将本发明的表达载体 施用于HLA-A*1101阳性受试者，以在活体中产生HLA-A*1101限制的 WT1肽及诱导WT1特异性CTL，并在受试者中损伤造血肿瘤细胞或实 体癌细胞，可能治疗或预防造血肿瘤或实体癌。

另一方面，本发明涉及治疗或预防癌症的药物组合物，包括多核苷 酸或表达载体。在此方面，本发明的药物组合物的组成、施用方法等如 上所述。

另一方面，本发明涉及治疗或预防癌症的方法，包括将有效量的多 核苷酸或表达载体施用于HLA-A*1101阳性受试者。治疗或预防的癌症 的实例包括造血肿瘤例如白血病、骨髓异常增生综合征、多发性骨髓瘤 或恶性淋巴瘤和实体癌如胃癌、结肠癌、肺癌、乳癌、生殖细胞癌、肝 癌、皮肤癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫癌、宫颈癌或卵巢癌。

另一方面，本发明涉及含有所述表达载体的细胞。可以通过例如以 表达载体转化宿主细胞例如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞而制 备本发明的细胞。可以从各种方法中适当选择将表达载体引入宿主细胞 的方法。通过培养转化的细胞、且回收并纯化产生的WT1肽，可以制 备本发明的肽。

另一方面，本发明涉及WT1特异性CTL，所述WT1特异性CTL 由HLA-A*1101限制的WT1肽和/或WT1肽二聚体诱导。本发明的CTL 识别WT1肽和HLA-A*1101分子的复合物。因此，本发明的CTL可用 于特异性损伤HLA-A*1101阳性和高水平表达WT1的肿瘤细胞。

另一方面，本发明涉及治疗或预防癌症的方法，包括将WT1特异 性CTL施用于HLA-A*1101阳性受试者。可以依赖于状况例如疾病类型、 受试者的状况或靶位点，适当选择WT1特异性CTL的施用方法。这种 方法的实例包括但不限于静脉内施用、皮内施用、皮下施用、肌内施用、 经鼻施用和经口施用。

另一方面，本发明涉及诱导WT1特异性CTL的方法，包括在 HLA-A*1101限制的WT1肽和/或WT1肽二聚体的存在下培养外周血单 核细胞，以从外周血单核细胞诱导WT1特异性CTL。外周血单核细胞 来自的受试者可以是任一个，只要其是HLA-A*1101阳性的。通过在 HLA-A*1101限制的WT1肽和/或WT1肽二聚体的存在下培养外周血单 核细胞，从在外周血单核细胞中包含的CTL前体细胞诱导WT1特异性 CTL。通过向受试者施用根据本发明获得的WT1特异性CTL，可能在 HLA-A*1101阳性受试者中治疗或预防造血肿瘤或实体癌。

另一方面，本发明涉及诱导WT1特异性CTL的试剂盒，包含 HLA-A*1101限制的WT1肽和/或WT1肽二聚体作为基本组分。优选的， 该试剂盒用于诱导WT1特异性CTL的方法。本发明的试剂盒除了 HLA-A*1101限制的WT1肽和/或WT1肽二聚体之外，可以包含例如获 得外周血单核细胞的工具、佐剂、反应容器等。一般而言，试剂盒附有 说明书手册。通过使用本发明的试剂盒，可以有效诱导WT1特异性CTL。

另一方面，本发明涉及通过HLA-A*1101分子呈递WT1肽的抗原 呈递细胞(例如树突细胞)，所述细胞由HLA-A*1101限制的WT1肽和/ 或WT1肽二聚体诱导。通过使用本发明的抗原呈递细胞，可以有效诱 导WT1特异性CTL。

另一方面，本发明涉及治疗或预防癌症的方法，包括将通过 HLA-A*1101分子呈递WT1肽的抗原呈递细胞施用于HLA-A*1101阳性 受试者。可以依赖于状况例如疾病类型、受试者的状况或靶位点，适当 选择抗原呈递细胞的施用方法。这种方法的实例包括但不限于静脉内施 用、皮内施用、皮下施用、肌内施用、经鼻施用和经口施用。

另一方面，本发明涉及诱导通过HLA-A*1101分子呈递WT1肽的 抗原呈递细胞的方法，包括在HLA-A*1101限制的WT1肽和/或WT1肽 二聚体的存在下培养未成熟抗原呈递细胞，以从未成熟抗原呈递细胞诱 导通过HLA-A*1101分子呈递WT1肽的抗原呈递细胞。未成熟抗原呈 递细胞指例如可以成熟为抗原呈递细胞的未成熟树突细胞的细胞。未成 熟抗原呈递细胞所来自的受试者可为任一种，只要其是HLA-A*1101阳 性的。因为未成熟抗原呈递细胞包含于例如外周血单核细胞中，所以可 以在WT1肽和/或WT1肽二聚体的存在下培养这种细胞。

另一方面，本发明涉及诱导通过HLA-A*1101分子呈递WT1肽的 抗原呈递细胞的试剂盒，包含HLA-A*1101限制的WT1肽和/或WT1肽 二聚体作为基本组分。优选的，该试剂盒用于诱导抗原呈递细胞的方法。 本发明的试剂盒包含的另一个组分等如上所述。本发明的试剂盒可用于 有效诱导通过HLA-A*1101分子呈递WT1肽的抗原呈递细胞。

另一方面，本发明涉及抗HLA-A*1101限制的WT1肽或编码该肽 的多核苷酸的抗体。本发明的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。

另一方面，本发明涉及诊断癌症的方法，包括使用WT1特异性CTL、 通过HLA-A*1101分子呈递WT1肽的抗原呈递细胞、或抗HLA-A*1101 限制的WT1肽或编码该肽的多核苷酸的抗体。优选的，将WT1特异性 CTL用于本发明的诊断方法。例如，通过将CTL、抗原呈递细胞或抗体 与来自HLA-A*1101阳性受试者的样品温育，或者将其施用于 HLA-A*1101阳性受试者，并确定例如其位置、位点或量，可能诊断癌 症。可以将CTL、抗原呈递细胞或抗体进行标记。通过附着标记，可以 有效实施本发明的诊断方法。

实施例

下列实施例对本发明进行更详细说明，但不将其解释为对其范围的 限制。

实施例1：WT1肽的选择

使用RANKPEP(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html)选择 衍生自来自WT1蛋白质(SEQ ID No：1)的肽、具有高的结合HLA-A*1101 分子的能力的WT1₂₅₁、WT1₂₇₉、WT1₃₁₂、WT1₃₁₃、WT1₃₃₈、WT1₃₇₈、 WT1₃₈₆、WT1₄₁₅和WT1₄₃₆。这些肽的氨基酸序列、SEQ ID No：1氨基 酸编号及与HLA-A*1101分子的亲和力分数示于表1。

表1

B-LCL细胞的制备

通过Ficoll-Hypaque梯度密度离心方法从收集自HLA-A*1101阳性 健康供体的外周血分离外周血单核细胞(PBMC)。然后将PBMC在含有 10％FCS的RPMI 1640培养基中以约1x10⁷的密度接种于24孔细胞培 养板中，并加入B95-8细胞(产生EB病毒的细胞)培养上清液。将其以 5％CO₂在37℃培养约1个月。获得以EB病毒转化的B-LCL细胞，其 是B细胞肿瘤细胞。经证实，产生的B-LCL细胞不表达WT1基因。通 过将B-LCL细胞与20μg/ml WT1₂₅₁、WT1₂₇₉、WT1₃₁₂、WT1₃₁₃、WT1₃₃₈、 WT1₃₇₈、WT1₃₈₆、WT1₄₁₅或WT1₄₃₆温育2小时来脉冲B-LCL细胞，并 以80Gy放射线进行照射。在后面实验中将产生的B-LCL细胞(此后称 为以WT1肽脉冲的B-LCL细胞)用作抗原呈递细胞。

WT1特异性CTL的诱导

在含有20μg/ml WT1₂₅₁、WT1₂₇₉、WT1₃₁₂、WT1₃₁₃、WT1₃₃₈、WT1₃₇₈、 WT1₃₈₆、WT1₄₁₅或WT1₄₃₆的完全培养基(45％RPMI、45％AMI-V培养 基和10％人AB血清)中将3x10⁶个自身PBMC于24孔细胞培养板中以 5％CO₂在37℃培养1周以获得相应细胞。将2x10⁶个产生的相应细胞 与1x10⁶个以相同WT1肽脉冲的B-LCL细胞在完全培养基中共培养1 周(第一次刺激)。将PBMC与以WT1肽脉冲的B-LCL细胞另外共培养 三次(第二至第四次刺激)，所述培养在如下加入的20IU/ml(终浓度) IL2条件下进行：第二次刺激：刺激起始后三天起，每隔一天两次；第 三和第四次刺激：从刺激起始后那天起，每隔一天三次。使用负选择柱 重力上料(Negative Selection Columns Gravity Feed)试剂盒(StemSp) 浓缩所得细胞，从而CD8阳性T细胞比率变为约80％，并使其与以WT1 肽脉冲的B-LCL细胞共培养(第五次刺激)。将最后刺激后5天获得的 CD8阳性T细胞(CTL)用于细胞毒活性的测量。

CTL的细胞毒活性

使用⁵¹Cr释放测定测量CTL的细胞毒活性。CTL细胞(此后称为 效应细胞)以1∶1至30∶1的比率(E/T比)与已整合了⁵¹Cr的靶细胞在200 μl培养基中混合，并在96孔细胞培养板中以5％CO₂于37℃培养4小 时。将用与诱导CTL的相同的WT1肽脉冲的B-LCL细胞(BLCL-Ps)和 没有以WT1肽脉冲的B-LCL细胞(BLCL-NPs)用作靶细胞。培养后，通 过离心收集上清液。使用液体闪烁计数器测量释放到上清液中的⁵¹Cr 量。使用下列公式确定细胞毒活性(％)：

(样品上清液中的⁵¹Cr释放-自发性⁵¹Cr释放)/(最大⁵¹Cr释放- 自发性⁵¹Cr释放)x100

其中自发性⁵¹Cr释放是当已整合了⁵¹Cr的靶细胞在相同条件下单 独培养时所观察到的⁵¹Cr释放，且最大⁵¹Cr释放是当使用1％Triton X-100将已整合了⁵¹Cr的靶细胞完全裂解时观察到的⁵¹Cr释放。结果显 示于图1-9。图中，纵轴代表比裂解(％)，而横轴代表E/T比。使用实 线代表BLCL-Ps，并使用点线代表BLCL-NPs。经证实，与BLCL-NPs 相比，以WT1₂₅₁、WT1₂₇₉、WT1₃₁₂、WT1₃₁₃、WT1₃₃₈、WT1₃₇₈、WT1₃₈₆、 WT1₄₁₅或WT1₄₃₆诱导的CTL特异性损伤作为与HLA-A*1101分子的复 合物呈递WT1肽的BLCL-Ps。将以WT1₂₅₁、WT1₂₇₉、WT1₃₁₃、WT1₃₃₈或WT1₃₈₆诱导的CTL用于下面的其他实验。

CTL对内源性表达WT1的细胞的细胞毒活性

使用上述方法确定以WT1₂₅₁、WT1₂₇₉、WT1₃₁₃、WT1₃₃₈或WT1₃₈₆诱导的CTL对表达WT1的B-LCL的细胞毒活性。表达WT1的细胞是 指引入人WT1基因、并在细胞中表达WT1蛋白质、并在HLA-A*1101 分子上呈递由加工所得的约9个氨基酸组成的肽的B-LCL。结果显示于 图1、2、4、5和7中。图中，使用短划线代表表达WT1的B-LCL。经 证实，以WT1₂₅₁、WT1₂₇₉、WT1₃₁₃、WT1₃₃₈或WT1₃₈₆诱导的CTL对内 源性表达WT1基因的细胞具有细胞毒活性。

WT1肽二聚体的制备

将227.5mg WT1₃₇₈肽单体、227.5mg N-葡甲胺(N-methylglucamine) (NMG)和23ml水的混合物通过在室温下搅拌约2天而空气氧化。向得 到的混合物加入2g乙酸钠溶于5ml水中的水溶液，并将该混合物在室 温下搅拌约20分钟。将200ml水和约200ml乙腈加入产生的溶液中， 并将混合物经Kiriyama漏斗过滤(滤纸号5C)，并以水洗涤(约50mlx3)。 将约200ml水加入残余物，并将残余物冻干以获得158mg粗WT1₃₇₈肽二聚体。

粗WT1肽二聚体的纯化

将158mg粗WT1₃₇₈肽二聚体溶解于9ml DMSO并注射到ODS C₁₈柱(5cmΦx50cm L，YMC Co.，LTD.)，所述ODS柱与HPLC(Shimadzu， LC8AD型)附着，并用HPLC泵以溶液1(H₂O/1％AcOH)平衡。将柱放置 约30分钟，并在360分钟内以浓度梯度0％到40％的溶液2(CH₃CN/1％ AcOH)洗脱。在220nm监控UV吸收时，使用自动级分收集器收集含 有WT1肽二聚体的级分。将收集的级分组合，注射到ODS C₁₈柱(4.6 mmΦx25cm L，YMC Co.，LTD.)，所述ODS柱与HPLC(Hitachi，L-4000 型)附着，并以17％的溶液2平衡，并在30分钟内以浓度梯度0％到47％ 的溶液2过洗脱，以在20.51分钟的保留时间获得46.6mg纯化的WT1₃₇₈肽二聚体。

FAB.MS 2365.0(理论值：2342.70)Na⁺F＝0.25％

通过WT1肽二聚体诱导CTL

根据上述方法，使用来自HLA-A*1101阳性健康供体1-3的PBMC 检查产生的WT1₃₇₈肽二聚体、WT1₃₇₈肽、修饰的WT1₃₇₈肽(G→I)(SEQ ID No：11)和修饰的WT1₃₇₈肽(G→V)(SEQ ID No：12)以及WT1₃₇₉肽 (SEQ ID No：13，公开于WO 2002/28414)诱导CTL的能力。结果示于图 10-14。图中，纵轴代表比裂解(％)，而横轴代表E/T比。使用实线表示 BLCL-Ps，并使用点线表示BLCL-NPs。经证实，WT1₃₇₈肽二聚体具有 诱导CTL的能力。另外，发现各WT1₃₇₉肽诱导CTL的能力远低于WT1₃₇₈肽的能力，所述WT1₃₇₉肽的氨基酸序列通过WT1蛋白质氨基酸序列中 一个氨基酸不同于WT1₃₇₈肽，且因此，与已知肽相比，本发明的WT1 肽具有卓越且出乎意料的作用。

工业适用性

本发明提供了HLA-A*1101限制的WT1肽、编码该肽的多核苷酸、 含有其的药物组合物等。因此，本发明可用于医药等领域，例如，预防 或治疗高水平表达WT1基因的各种造血肿瘤和实体癌的药物组合物的 开发和制备领域。

序列表自由文本

SEQ ID NO：11：修饰的WT1肽

SEQ ID NO：12：修饰的WT1肽