纯化疟原虫(PLASMODIUM)和疫苗组合物

摘要

本发明揭示实质上纯化的疟原虫(Plasmodium)子孢子和与附带的非子孢子物质实质上分离的疟原虫子孢子制剂，其中所述疟原虫子孢子制剂的纯度水平提高。本发明还提供包含纯化的疟原虫子孢子的疫苗和医药组合物。本发明还提供纯化疟原虫子孢子制剂的方法。

说明书

技术领域

本申请案涉及真核病原体和寄生虫、尤其疟原虫子孢子阶段寄生虫的纯化。更具体 来说，其涉及实质上纯净的寄生虫和其制备和使用方法。本申请案还涉及减毒和非减毒 的纯化子孢子阶段疟原虫寄生虫的疫苗和医药组合物，以及在疫苗和其它制剂中使用所 述组合物来防止疟疾和其它疾病、治疗疾病和在疟疾疫苗和药物测试中作为感染志愿者 的方式的方法。

背景技术

疟疾是一种估计可影响3亿到5亿人的疾病并且每年杀死100万到300万人。其对 发展中国家、尤其是撒哈拉以南非洲的人民还具有巨大经济影响。恶性疟原虫 (Plasmodium falciparum)占世界上因疟疾死亡病例的大多数。世界旅游组织(World  Tourist Organization)报告，在2000年在世界范围内记录有几乎7亿国际游客，约900 万到访西非、中非或东非，3700万到访东南亚，600万到达南非并且1000万到访大洋 洲。估计每年有超过30,000名来自北美、欧洲和日本的旅客感染疟疾。在100多年中， 每次军事行动，如果发生疟疾传播，美国部队因疟疾而伤亡的人员都多于战火而伤亡者。 二战期间估计因疟疾死亡12,000,000人天数且在越战期间死亡120万人天数。

疟原虫寄生虫通过受感染雌疟蚊(Anopheles)的叮咬和吸血进行传播，所述疟蚊从 黎明活动到黄昏。处于子孢子发育阶段的疟原虫主要通过血流从叮咬位点迁移到肝，其 在肝细胞内繁殖，在恶性疟原虫情形下在每个受感染细胞中产生约10,000到个40,000 个子代。所述肝阶段寄生虫表达一些在子孢子阶段不表达的蛋白质。在所述阶段时，寄 生虫以裂殖子形式重新进入血流，从而表达一些与在子孢子阶段和肝早期阶段表达的蛋 白质不同的蛋白质，并且侵入红细胞，其中额外繁殖每48小时将寄生虫数增加约10到 20倍。与在肝中发育5到10天(其不诱发疟疾的任何症状或体征)不同，未治疗的血 液阶段感染会引发溶血、寒颤、发热和虚脱。恶性疟原虫是引发人类疾病的最危险的四 个主要疟原虫种类(间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫[诺氏疟原虫也可引发人类 疾病])，在恶性疟原虫情形下，所述疾病伴有微循环血流受到破坏和重要器官(例如脑、 肾和肺)代谢变化，如果不紧急治疗经常会导致死亡。

针对恶性疟原虫疟疾的有效疫苗仍为医学的最大挑战之一。尽管一百多年来医生和 科学家们已花费数亿美元进行毕生努力研究，并且发现了许多有前景的实验疫苗，但是 仍然没有可减轻人类重大传染病中任一者的市售疫苗。

一代人以前，公共健康倡导采用氯喹(chloroquine)、DDT和媒介控制计划，这似 乎可在世界范围内降低恶性疟疾的威胁。有效疫苗的缺乏使这些努力难以奏效，但可持 续控制似乎即将达成。

即将成功的承诺很快就失败了，并且失败的原因是多方面的。寄生虫对可负担的高 效抗疟药物的抗性越来越强，媒介控制措施失效，并且在发展中国家的病区，迁移、战 争和经济崩溃越来越常见。因此，恶性疟原虫疟疾再度猖獗，每年使至少25亿人有患 病危险，使3亿到9亿人感染，并杀死100万到300万人。在困扰发展中国家的许多社 会、经济、环境和政治问题中，恶性疟原虫疟疾逐渐被视作是这些不公正的根源和残酷 结果，并且是解决这些复杂问题的巨大障碍。在发展中国家，不利用有效疫苗是不可能 控制恶性疟原虫疟疾的。实际上，考虑到社会、政治和经济现实，我们相信疫苗可成为 可持续控制计划的基本组份，并且在全球根除运动中将需要疫苗。

在过去的25年期间，大多数研究致力于识别寄生虫可赋予免疫力的抗原性亚单位-- 不幸的是，结果不太令人满意。文献中已阐述了研发适宜疫苗中的所述努力和伴随的困 难(纽森维戈V.、F.和R.S.(Nussenzweig V.，F.and R.S.)，高等免疫学(Adv.Immunol.)， (1989)45：283-334；霍夫曼S.L.(Hoffman S.L.)等人，霍夫曼S.L.编辑，疟疾疫苗 研发(Malaria Vaccine Development)：多免疫应答方法(A Multi-Immune Response  Approach)(1996)华盛顿哥伦比亚特区(Washington，D.C.)：ASM出版社，第35到 75页；霍夫曼S.L.和L.H.米勒(L.H.Miller)：霍夫曼S.L.编辑，疟疾疫苗研发：多免 疫应答方法(1996)华盛顿哥伦比亚特区：ASM出版社，第1到13页；爱泼斯坦J.E. (Epstein，J.E.)等人，分子治疗学新见(Curr.Opin.Mol.Ther.)(2007)9：12-24； 里奇T.L.(Richie T.L.)和A.撒罗(A.Saul)，自然(Nature)，(2002)415：694-701)。

人们正不断努力地制造亚单位疟疾疫苗。所述尝试的典型(宝莱迪(Paoletti)等人， U.S.5,766,597，于1998年6月16日颁布)揭示含有编码一种或一种以上环子孢子蛋白 的疟原虫DNA的重组痘病毒，包括称作NYVAC-Pf7的实施例，其可能用作潜在疟疾疫 苗。但随后对所述构成物的测试结果令人失望(奥肯豪斯C.F.(Ockenhouse，C.F.)等人， 传染病杂志(J.Infect.Dis.)(1998)177：1664-73)。

类似地，有人提出另一种候选亚单位环子孢子疫苗并且将其确定为RTS，S/AS02A (斯托特J.A.(Stoute J.A.)等人，传染病杂志(1998)178：1139-44)。文献报道了所 述疫苗在莫桑比克(Mozambique)的一到四岁儿童第一2b期现场试验的结果(阿朗索 P.L.(Alonso，P.L.)等人 柳叶刀(Lancet)(2004)364：1411-1420；阿朗索P.L.等人， 柳叶刀(2005)366：2012-2018；爱泼斯坦J.E.等人，见上文；里奇T.L.、F.和A.撒罗， 见上文)，也报道了另一婴儿2b期现场试验的结果(阿庞特J.J.(Aponte，J.J.)等人(2007)， 柳叶刀370：1543-1551；倍真P.(Bejon，P.)等人(2008)新英格兰医学杂志(NEJM) 359：2521-32；阿布杜拉S(Abdullah，S)等人(2008)新英格兰医学杂志359：2533-44。 已证实疫苗具有中等保护功效。

另一方面，在随后用病原性寄生虫攻击接受者(最重要的是减毒恶性疟原虫攻击人 类宿主)时证实了完整寄生虫、辐射减毒子孢子(通过蚊子暴露递送到人类宿主和通过 静脉内(i.v.)接种递送到动物宿主)在赋予高水平保护性免疫力中的有效性，这是适宜 疫苗研究的早期里程碑(霍夫曼S.L.等人，传染病杂志(2002)185：1155-64)。最终， 此使得人们致力于探索在将这些早期发现转化成包含消毒减毒子孢子的实用疫苗方法 中面临的技术困难(卢克T.C.和S.L.霍夫曼，实验生物学杂志(J.ExP.Biol.)，(2003) 206：3803-3808；霍夫曼S.L.和T.C.卢克，美国专利第7,229,627号和美国公开案 2005/0208078)。其还使人们对利用减毒子孢子的疫苗使用的兴趣普遍增加(梅纳德R. (Menard，R.)，自然2005)433：113-114；沃特斯A.P.(Waters，A.P.)等人，科学(Science) (2005)307：528-530；威克斯M.F.(Wykes，M.F.)和M.F.古德(M.F.Good)，国外 寄生虫学杂志(Int.J.Parasitol.)(2007)37：705-712；伦尼亚L.(Renia，L.)等人，疫 苗专家评论(Expert Rev.Vaccines)，(2006)5：473-481；爱泼斯坦J.E.等人，见上文)。

其它减毒模式也已得到证实。例如，文献显示通过伯氏疟原虫(Plasmodium berghei) 基因变化产生的减毒子孢子可针对伯氏疟原虫疟疾来保护小鼠(卡佩(Kappe)等人，美 国专利7,122,179；穆勒(Mueller)等人，自然(2005)；穆勒等人，美国科学院院 报(PNAS)(2005)；凡代克(van Dijk)等人，美国科学院院报(2005)102：12194-12199)； 沃特斯，美国专利7,550,138；洛鲍伊(Labaied)等人，感染与免疫(Infect.And Immun.) (2007)。最近，已揭示恶性疟原虫的子孢子的遗传减毒(史卡洁克(van Schaijk)等 人，公共科学图书馆·综合(PLoS ONE)(2008)3：e3549)；凡巴斯克尔克(VanBuskirk) 等人，美国科学院院报。

类似地，已阐述疟原虫的化学减毒(珀塞尔(Purcell)等人，感染与免疫(Infect. Immun.)(2008)76：1193-99；珀塞尔等人，疫苗(Vaccine)(2008)26：4880-84)。

还阐述了培养子孢子的未纯化制剂和诱发寄生虫分化到无菌肝阶段的其它方法(卡 佩等人，美国公开案2005/0233435)。

上文所讨论的研究具有某些限制。例如，当通过蚊子叮咬递送到人类宿主的子孢子 产生针对疟疾的有效免疫应答时，所述递送方法明显不是对需要抗疟疾保护的群体进行 疫苗接种的实用方法。小鼠中的其它研究(参见上文)已表明，将减毒子孢子静脉内递 送到小鼠也有效，但相比之下其它递送方式(例如肌内)则无效。然而，如果要将疟疾 疫苗递送到多个个体(包括儿童和老人)，那么静脉内递送方法也不实用。静脉内递送 的危险较大、增加成本，并且患者很可能不会同意使用这种方法进行疫苗接种。因此， 业内需要提供有效的疟疾疫苗，其可提供保护性免疫力，其中可通过多种方法投与所述 疫苗。

考虑到人类疫苗，免疫原的纯度和存在或不存在可能具有免疫原性或毒性的非特异 性附带物质是先前尚未解决的其它基本问题。如上文所论述研究中所用的分离减毒子孢 子制剂含有污染物质和其它附带物质。业内需要研发尤其用于人类的基于子孢子的疫 苗，其采用在消毒条件下制备的、无菌纯化子孢子制剂用于疫苗组合物中。当通过非静 脉内递送方法(例如，肌内、腹膜腔内、皮内、表皮、粘膜、粘膜下、经皮或皮下)投 与所述在消毒条件下制备的纯化子孢子制剂时，所述制剂可能比非纯化制剂还更有效。

发明内容

本发明揭示活的、感染性、实质上纯化的子孢子、尤其疟原虫子孢子(减毒子孢子 以及病原性子孢子)的组合物。本发明还揭示制备活的、感染性、实质上纯化的寄生虫 的方法和使用实质上纯化的减毒子孢子作为疫苗用以防止疟疾的方法。本发明还揭示使 用纯化病原性寄生虫的方法，其可用于评定抗疟疾药物和疫苗的有效性，且可结合抗疟 疾剂(例如氯喹)用于赋予保护性免疫力。

在实施例中，提供使用在消毒条件下产生的无菌、感染性、实质上纯化的减毒疟原 虫子孢子来赋予人类和其它哺乳动物宿主以针对疟疾的保护性免疫力的方法。所述方法 和组合物可用于赋予针对由恶性疟原虫和其它疟原虫种类引发的疟疾的保护性免疫力， 而无可因使用未纯化制剂引起的并发症。

在实施例中，提供实质上纯化的病原性疟原虫子孢子的组合物，以及将其作为研究 工具用于临床测试中和用于预防性疫苗接种方案中的方法。

提供活的、感染性、减毒、实质上纯化的子孢子的组合物，以及向人类和其它哺乳 动物个体投与的剂量、方案和途径。

在实施例中，提供赋形剂中的纯化疟原虫寄生虫，尤其处于发育子孢子阶段的寄生 虫，所述寄生虫代谢活化、具有感染性并实质上不含污染物质。在另一实施例中，在消 毒条件下制备子孢子。在另一实施例中，将子孢子充分减毒以防止发育超过寄生虫生命 周期的肝阶段(成熟裂殖体阶段)。

在另一实施例中，提供在哺乳动物和人类宿主中赋予针对由疟原虫种类引发的疟疾 的保护性免疫力的方法，其包含提供存于赋形剂中且实质上不含附带物质的活的、具有 代谢活性、感染性、减毒疟原虫种类子孢子和投与所述宿主至少一个剂量的所述子孢子 制剂；其中在随后暴露于所述种类的病原性疟原虫子孢子后防止出现疟疾的病理表现并 且针对发展中的疟疾保护宿主。

在另-实施例中，提供通过以下方式来纯化具有代谢活性、感染性寄生虫、尤其疟 原虫子孢子的方法：提供包含子孢子和附带的非子孢子物质的水性纯化前制剂，使所述 制剂依次通过一组尺寸排阻过滤器，所述过滤器包含：a)第一排阻过滤器，其具有能 够保留大于10微米的附带物质并且允许子孢子通过的标称孔径；b)第二排阻过滤器， 其具有能够保留大于约0.6微米的附带物质并且允许子孢子通过的标称孔径；和c)第 三尺寸排阻膜过滤器，其具有能够保留大于1.2微米的实质上所有附带物质并且允许子 孢子通过的精确孔径。随后在具有能够保留子孢子的孔径的收集过滤器上收集实质上纯 化的子孢子，并且随后从收集过滤器洗脱纯化子孢子制剂并以期望浓度重新悬浮。

在另一实施例中，提供用于测定疟疾有关药物、疫苗和诸如此类的功效的组合物。 所述组合物包含活的、实质上纯化的病原性疟原虫寄生虫。

附图说明

图1-PfSPZ的粗制和纯化制剂的显微照片观察(活动3)。以200X放大摄制显微 照片。

图1a-纯化前SGM＝837ng/25,000个PfSPZ(将试样调节到15x 10⁶个PfSPZ/ml)

图1b-纯化后SGM＝0.23ng/25,000个PfSPZ(将试样调节到18x 10⁶个PfSPZ/ml)

图2-PfSPZ的粗制和纯化制剂的显微照片观察(活动6)。以200X放大摄制显微 照片。

图2a-纯化前-SGM＝781ng/25,000个PfSPZ(将试样调节到17.78x 10⁶个 PfSPZ/ml)

图2b-纯化后-SGM＝0.65ng/25,000个PfSPZ(将试样调节到16.71x 10⁶个 PfSPZ/ml)

图3-PfLSA-1的阶段特异性表达(恶性疟原虫子孢子对3天肝阶段寄生虫)。

图3a-PfSPZ与抗PfCSP单克隆抗体一起培育。

图3b-PfSPZ与抗PfLSA-1多克隆抗体一起培育。

图3c-3天肝阶段寄生虫与抗PfLSA-1多克隆抗体一起培育。

具体实施方式

目前没有经FDA批准的疟疾疫苗。然而，在过去的30年期间，所公布的结果已证 实，通过多于1,000只恶性疟原虫感染蚊子叮咬来递送投与辐射减毒的恶性疟原虫子孢 子，可在大于90％的暴露个体中提供至少42周的无菌保护性免疫力，并且可有效抵抗 来自全世界的多种恶性疟原虫分离物。尽管这些发现可能很令人兴奋，但由于存在若干 技术困难(包括分离和纯化子孢子以及在消毒条件下分离和纯化子孢子)，其并未提出 疫苗或研发疟疾疫苗的明确方法。此外，许多科学家的工作表明，通过静脉内投与减毒 子孢子仅能在小鼠模型系统中达成优良保护。由于习用于人类免疫中的非经肠非静脉内 投与途径(例如皮下和肌内接种)在所述小鼠模型系统中并不产生足够保护性免疫力， 所以认为不可能研发用于人类的减毒子孢子疫苗。采用认为与恶性疟原虫引发的人类疟 疾更为类似的小鼠模型系统已发现，非经肠非静脉内投与子孢子会产生高水平保护(美 国公开案第2005/0208078号)。业内也已克服了研发医药上可接受的减毒活疟疾疫苗的 许多其它技术困难(尤其是在消毒条件下产生足量的与附带物质分离的子孢子)(尤其 参见霍夫曼SL和TC卢克，US 7,229,627B2，其以引用方式明确并入本文中)。

然而，适于常规用于人类个体中的疫苗需要实质上纯的接种物并且子孢子接种物需 要已从产生其的来源实质上纯化的子孢子。本文提供的疫苗组合物包含呈实质上纯化形 式、实质上不含附带的(来源)物质(其对子孢子本身不具有特异性)的疟原虫子孢子。 另外，在本文所提供疫苗组合物的一些实施例中，疫苗组合物实质上不含污染物质、微 生物和外源性病原体。本发明提供实质上纯化的子孢子和纯化子孢子的方法，以及纯化 子孢子与赋形剂的组合物。

定义

术语“约”或“大约”意指根据业内实践在一个标准偏差范围内。

本文中作为名词使用的“添加剂”是添加到子孢子制剂中以有利于制剂保存的化合 物或组合物。添加剂可包括冷冻保护剂(例如DMSO和甘油)、抗氧化剂和诸如此类。

本文所用“消毒的”意指不引入其它微生物(例如细菌、真菌、致病病毒和诸如此 类)的可检测污染。子孢子制剂的消毒性方法产生无菌子孢子制剂，其不含任一其它类 型的微生物或感染物。使用微生物分析来监测消毒性方法以评定存在或不存在污染。其 包括(但不限于)微生物限制测试(当前版美国药典(USP)<61>，其以引用方式并入 本文中)。

本文所用“附带”物质意指寄生虫粗制剂中对寄生虫本身无特异性的物质。例如， 在子孢子制剂中，附带物质是对子孢子本身无特异性的物质。附带物质包括对生长或产 生子孢子的来源具有特异性的物质、尤其生物碎片、更尤其蛋白质，所述物质与粗制剂 中的子孢子分离。制剂中附带物质使制剂称为“粗”制剂，并且对于子孢子来说，所述 物质包括对发育出子孢子或已分离出子孢子的基质具有特异性的物质。对于从宿主蚊子 的唾液腺剥离并分离的子孢子来说，附带物质是宿主物质、宿主蛋白、唾液腺物质、唾 液和诸如此类。附带物质不包括有意添加到制剂中的组份，例如赋形剂、稀释剂、添加 剂和诸如此类。在一些实施例中，可将已从粗制剂移除的附带物质组份添加回纯化制剂， 以优化对宿主的子孢子感染性、子孢子免疫原性或子孢子呈递。并不将所述反添加物质 视为如本文所定义的附带物质。

本文所用“减毒”意指使得活有机体不能完成其生命周期但不会将其杀死。有机体 可具有复制、表达蛋白和在一些生命周期阶段发育的有限能力，但防止在特定生命周期 阶段发育并且不能发育地进展超过所述阶段。对于本文所揭示减毒疟原虫寄生虫，即在 子孢子阶段暴露于辐射的寄生虫来说，其保留使宿主肝细胞感染并表达阶段特异性蛋白 的能力，但不能发育超过肝阶段，在肝阶段(裂殖子阶段)后不能重新进入感染宿主的 血流，不能引发疟疾的疾病病状。其它减毒疟原虫种类寄生虫可保留以下能力：感染宿 主肝细胞，发育超过肝阶段，在肝阶段(裂殖子阶段)后重新进入感染宿主的血流，和 甚至感染红细胞，但随后在表现出疟疾的疾病病状的阶段之前停止发育。

本文所用“赋予保护性免疫力”是指使群体或宿主(即个体)能产生免疫应答以抵 抗由病原体(例如恶性疟原虫)引发的疾病(例如疟疾)，从而使得与未治疗宿主相比 减少宿主中疾病的临床表现、病状或症状，或使得与未治疗群体相比降低群体内感染或 疾病的临床表现、病状或症状的出现率。

本文所用“污染物”和污染意指外来微生物或病毒污染或病原性污染，其包括(但 不限于)细菌、病毒、支原体、真菌和诸如此类。消毒性工艺经设计以防止引入污染并 且无菌制剂不存在污染。污染物也可为非生物或无机毒性物质。在工艺期间的任一步骤 中可能会偶然或无意地引入污染物。

本文所用“稀释剂”是于其中制备子孢子和子孢子组合物以达成期望浓度的介质。 稀释剂可为(例如)生理盐水或磷酸盐缓冲盐水或介质(例如介质199或介质E199)(具 有鹰氏(Earle′s)平衡盐的介质199)。

“赋形剂”意指作为载剂、媒剂或稀释剂用于医药制剂(例如疫苗)的活性成份的 非活性物质。本文所用赋形剂是在分离和纯化过程期间添加到制剂中以有助于所述过 程、最小化非特异性相互作用或吸附和/或提供体积的成份。赋形剂的实例包括来自任何 来源的非活性蛋白质，例如血清白蛋白，尤其人类血清白蛋白，所述来源包括(但不限 于)从血液纯化，作为重组蛋白来产生或以合成方式产生。可将从蚊子唾液腺剥离的子 孢子置于赋形剂中用于进一步处理。可出于若干原因(包括在整个纯化过程期间维持活 性、增大稳定性或防止分离子孢子的无意损失)向医药制剂中添加赋形剂。

本文所用“免疫应答”意指接受者对引入减毒子孢子的应答，其通常特征在于(但 不限于)产生抗体和/或T细胞。通常，免疫应答可为细胞应答(例如诱发或活化对疟 原虫种类表位具有特异性的CD4+T细胞或CD8+T细胞)、疟原虫特异性抗体的增大 产生的体液应答或细胞和体液应答两种情况。对于疟疾疫苗来说，由包含子孢子的疫苗 建立的免疫应答包括(但不限于)对细胞外子孢子表达的蛋白质或在在寄生虫已进入宿 主细胞(尤其肝细胞和单核细胞，例如树突细胞)后其它阶段寄生虫表达的蛋白质的应 答和/或对所述寄生虫的组份的应答。在本发明中，在随后由感染性有机体攻击时，免疫 应答防止病原性寄生虫发育到引发疾病的无性红细胞阶段。

如本文所定义“静脉内”意指有意直接引入确定的大血管(例如静脉)的管腔中。

本文所用“代谢活性”意指活的，并且能够执行维持性功能和一些生命周期过程。 对于减毒子孢子来说，此术语包括(但不限于)子孢子能够在培养物中和活体内侵入肝 细胞，可能具有分裂和经历一些发育阶段的有限能力，并且能从头表达阶段特异性蛋白 质。

如本文所定义“减轻”意指实质上降低或减缓疟疾的强度、症状和/或病状，其可能 在接种后以其它方式表现。

本文所定义并且对于过滤器的孔径来说，“标称”意指有效孔径并且是指表观孔径 可使球形颗粒通过过滤器以使过滤器排除所述大小的颗粒的90％。

如本文所定义“非经肠”意指不通过消化道，而是通过一些其它途径引入，例如皮 内、皮下、肌内、眼窝内、囊内、脊柱内、胸骨内、静脉内、经皮和诸如此类。

如本文所定义并且在防止疟疾的上下文中使用的“防止”意指防止疟疾的大部分、 最多所有病状和临床表现进行表现。

如本文所定义并且对于子孢子制剂的“纯化”意指与附带物质分离或与被视为不期 望的物质分离。

如本文所定义并且对于子孢子的“无菌”意指不存在任何污染微生物。借助消毒制 备方法获得子孢子的无菌制剂。通过特定分析(包括但不限于无菌度测试(Sterility Test) (当前版美国药典<71>，其以引用方式并入本文中))测定制剂的无菌度。

对于子孢子制剂来说的“实质上纯化的”意指附带的污染的量减少到小于85 ng/25,000个子孢子或附带的污染减少至少18倍。满足上述标准的任一者即足以使子孢 子制剂为“实质上纯化的”。

如本文所定义“治疗性”涉及减少已经表现的临床表现或病状。本文所用“治疗有 效量”意指量足以减少个体中疾病的临床表现、病状或症状，或量足以降低群体内疾病 的临床表现、病状或症状的出现率。

本文所用“疫苗”是包含免疫原试剂和医药上可接受的稀释剂的制剂，可能与赋形 剂、佐剂和/或添加剂或保护剂组合。免疫原可包括全感染物或感染物的分子亚群(由感 染物以合成或重组方式产生)。当投与个体疫苗时，免疫原刺激免疫应答，其在随后用 感染物攻击时保护个体免患疾病或减轻由所述试剂引发的病状、症状或临床表现。在注 射后给予治疗性(治疗)疫苗并打算减少或防止疾病进展。防止性(预防性)疫苗打算 防止初始感染或降低感染速率或负荷。用于针对寄生虫病(例如疟疾)的疫苗中的试剂 可为完全灭活(非活性)寄生虫、减毒活寄生虫(不能完全经历其生命周期)或与寄生 虫相关的纯化或人工制造分子(例如，重组蛋白、合成肽、DNA质粒和表达疟原虫蛋白 的重组病毒或细菌)。如所属领域技术人员容易地了解，疫苗可包含子孢子以及其它组 份(例如赋形剂、稀释剂、载剂、防腐剂、佐剂或其它免疫增强剂或其组合)。

子孢子的纯化

疟原虫种类寄生虫在培养物中在消毒条件下生长以及在疟蚊种(Anopheles-species) 蚊子宿主、最通常斯氏按蚊(Anopheles stephensi)宿主中活体内生长。无菌培养疟原虫 种类肝阶段寄生虫的方法(卡佩等人，美国公开案2005/0233435)和产生减毒和非减毒 疟原虫种类子孢子的方法、尤其使蚊子中的寄生虫生长和减毒、并收获减毒和非减毒子 孢子的方法已为业内所知并且已有所阐述(参见霍夫曼和卢克，美国专利第7,229,627 号、美国公开案第2005/0220822号)。

本发明的纯化方面分离子孢子与附带物质(例如蚊子宿主唾液腺物质)(下文称为 “SGM”)、蚊子特异性物质和任何其它非子孢子物质或组份，由此获得含有子孢子的 实质上纯化的制剂。作为纯化的一方面，子孢子相对于附带的污染物质(例如SGM)浓 缩。此处，使用酶联免疫吸附分析(ELISA)测量制剂的纯度以量化子孢子粗制剂和纯 化制剂中存在的附带的抗原性SGM(下文称为“SGM-ELISA”)。其它方法(例如但 不限于毛细管电泳、质谱、反相色谱、免疫印迹、光散射和紫外光谱)可类似地适于测 量附带物质。对于子孢子从除蚊子外的来源的纯化来说，可类似地调节与待纯化子孢子 的粗制剂中附带物质相关的类似分析(例如ELISA)。适于来自除蚊子唾液腺外的来源 的附带物质的抗原的所述ELISA分析的研发可使用所述领域的技术人员常见的类似方 案。为进行阐释，提供用于附带的SGM的杂质分析的方案。应了解，提供所述方案用 于阐释并且可通过(例如)放大进行修饰，或以其它方式修饰，并且并不打算限制所主 张本发明的范围。

纯化方法

本文揭示纯化活的疟原虫种类(例如恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫或卵形 疟原虫)的方法。

所揭示方法采用不同类型并且具有不同孔径的一系列尺寸排阻过滤器，其以新颖且 不明显方式组装。所述方法将附带物质从活的、游走寄生虫的制剂消除。所述方法的一 方面在于依序尺寸排阻过滤器的孔径并不总是小于其之前的尺寸排阻过滤器的孔径。另 一方面在于一些过滤器提供具有标称孔径的矩阵并且至少一个过滤器提供具有精确孔 直径的径迹蚀刻过滤器。至少一个过滤器具有接近或稍微小于寄生虫的直径的孔径。

举例来说，揭示疟原虫种类子孢子的纯化；然而，所属领域的实践人员应了解，根 据有机体的物理大小，调节过滤器孔径可产生类似纯化。例如，恶性疟原虫子孢子是杆 状，并且直径为约0.8±0.2μm且长度为8.5±1.5μm。霍夫曼SL等人，热带传染病(Tropical  Infectious Disease)，第2版，2006，艾斯维尔(Elsevier)，费城(Philadelphia)，宾 夕法尼亚州，第1027页；徐L.H.(Xu，L.H.)等人，1985，动物研究(Zoo.Res.)6：33-6。

通常在用于纯化的制剂中，剥离150到400只蚊子的唾液腺。子孢子是从唾液腺通 过使其在针和注射器中来回通过(研磨)来释放，并且笼统地纯化这些腺体的子孢子。 然而，可在放大制剂中剥离多若干倍的蚊子，在实施例中最多1,000只蚊子，在另一实 施例中最多5,000只蚊子，在另一实施例中最多10,000只蚊子。子孢子是从唾液腺通过 研磨释放并且通过本文所揭示尺寸排阻过滤方法纯化经研磨唾液腺制剂(纯化前制剂)。 在整个纯化过程中将子孢子维持于赋形剂中，通常1％人类血清白蛋白(HSA)维持于 具有鹰氏盐的培养基199(E-199)中。

A-用于纯化的物质制备

每次将经研磨剥离产物(纯化前制剂)一起接收于单个管中。这是SGM纯化前制 剂。其代表约100,000到10亿个子孢子、优选100万个子孢子，且更优选至少2500万 个子孢子。SGM在纯化前制剂中的测量量通常介于300ng与12,000ng/25,000个子孢 子之间，更通常介于400ng与1,100ng/25,000个子孢子之间。随后将纯化前制剂用赋 形剂稀释到10ml。在纯化持续期间将溶液和试样保持在15℃与30℃之间。

B-纯化程序

使用蠕动泵以至少1ml/min但不超过1000ml/min，优选至少2ml/min但不超过500 ml/min的流速，且更优选以至少3mL/min且不超过200mL/min的流速，将稀释过的纯 化前制剂泵送通过一系列尺寸排阻过滤器。通过每一过滤器的相应通量是至少1L/hr/m²但不超过2000L/hr/m²，优选3L/hr/m²到1500L/hr/m²，且最优选至少125L/hr/m²但不 超过250L/hr/m²。过滤器通常用医药级硅酮管串联连接。优选初始过滤器(1号过滤器) 或初始的两个过滤器(1号和2号过滤器)是矩阵过滤器并且由聚丙烯制得，然而，也 可使用尼龙、混合纤维素酯和硼硅酸盐玻璃或所属领域的技术人员已知的其它物质。优 选倒数第二个过滤器(3号过滤器)是膜过滤器，最优选径迹蚀刻聚碳酸酯过滤器，但 也可使用所属领域的技术人员已知的具有类似性质的其它过滤器。在消毒程序中，过滤 器是无菌的。在一个实施例中，串联连接三个过滤器(1号过滤器、2号过滤器和3号 过滤器)并且通过死端式过滤(dead end filtration)将子孢子捕获到4号过滤器上。可使 用其它过滤器。或者，可仅使用一个或两个过滤器(如下文第59段中所述)，然而使 用三个过滤器最佳。在一个实施例中，1号过滤器是标称孔径为至少约2.5微米但不超 过30微米，优选至少约5微米但不超过20微米的膜矩阵。在一个实施例中，所用过滤 器的标称孔径为约10微米，过滤面积为17.5cm²。(Polygard-CN奥普特-密理博 (Optiscale-Millipore)目录号SN1HA47HH3)。在一个按比例放大的实施例中，过滤 面积是1800cm²。2号过滤器(也为膜矩阵)的标称孔径为至少约0.3微米但不大于约 1.2微米。在一个实施例中，孔径是约0.6微米，且过滤面积为17.5cm²。(Polygard-CN 奥普特过滤器-密理博目录号SN06A47HH3)—小于疟原虫的直径。在一个按比例放大 的实施例中，过滤面积是1800cm²。在一个实施例中，3号过滤器是具有精确孔隙直径 和一致孔径的径迹蚀刻膜过滤器，并且孔径为至少1.2微米但不大于3微米—大于前一 过滤器的标称孔径。在一个实施例中，所用过滤器的孔径为1.2微米，且过滤面积为11.3 cm²。(埃斯波(Isopore)膜，直径为47mm-密理博目录号RTTP04700)保持在斯文- 洛克(Swin-Loc)过滤器支架(沃特曼(Whatman)目录号420400)中。在一个按比例 放大的实施例中，过滤面积是127cm²。在配备有埃斯波膜的搅拌式超滤试池(密理博， 型号8200)中利用4号过滤器捕获过滤物质，所述埃斯波膜为90mm直径且过滤面积 为28.7cm²，并且径迹蚀刻孔径不超过0.8微米，优选不超过0.6微米，并且优选不超过 0.2微米。在一个实施例中，孔径是0.4微米(密理博目录号HTTP09030)。在一个按 比例放大的实施例中，过滤面积是162cm²。在另一按比例放大的实施例中，过滤面积 是63cm²。将系统用介质洗涤若干次。当搅拌式试池中的滞留物体积达到约40ml时， 打开搅拌式试池容器出口并通过重力排放，留下约5ml到10ml残余滞留物，尽管可通 过其它方法(例如由压缩气体(例如氮)或机械装置(例如活塞)施加压力)减小滞留 物体积，但重力法是优选方法。将所述残余滞留物以及使用纯化介质的三次洗涤液总共 约35ml收集并转移到通常35ml无菌橡树岭(Oak Ridge)型离心管或类似离心管(管 的大小将根据制剂的体积变化)中。将在35ml橡树岭型管中的介质中的纯化子孢子以 5,000g到25,000g，优选以16,300g离心2分钟到12分钟，优选5分钟，从而使子孢 子成丸状。倾析出上清液介质。所述步骤另外通过移除保留于上清液中的更易漂浮的较 小物质和可溶物质来纯化子孢子。

使用3尺寸排阻过滤器方法，所述程序可使纯化子孢子制剂中的附带物质比纯化前 制剂中的附带物质显著减少大于200到10,000倍(减少因子)。残余SGM在无菌纯化 子孢子的纯化制剂中的量通常小于25ng附带物质/25,000个子孢子(相对于SGM的初 始量减少97％以上)、优选小于15ng/25,000个子孢子(减少98％)，且更优选小于1 ng/25,000个子孢子(99.9％)。本文所述每一纯化制剂中的污染SGM通常比初始经研 磨纯化前唾液腺物质中的SGM减少数千倍，每一纯化制剂是从纯化前唾液腺物质衍生 得。优选地，纯化减少因子是至少15倍、更优选地，纯化因子是至少1,500倍且最优选 为至少3,500倍。实例1中所述10个活动中的减少因子的几何平均值是1625，在纯化 过程期间SGM减少99.93％。

例如，从实例1(表2)中所示剥离蚊子唾液腺分离的纯化子孢子制剂含有0.19ng 到1.01ng范围的SGM/25,000个子孢子并且附带的SGM的减少百分比在99.91％到 99.97％范围内。或者，下文第59段中所述方法提供具有不超过85ng SGM/25,000个子 孢子制剂(附带的SGM物质减少95％)并且认为其实质上纯化的。表2中10个生产活 动(使用3尺寸排阻过滤器)的纯化制剂中的SGM的几何平均值是0.51ng SGM/25,000 个子孢子，95％置信区间为0.34ng到0.67ng SGM/25,000个子孢子。

在一替代实施例中，从上文第56段中所述过滤器组除去3号过滤器并且使用2尺 寸排阻过滤器方法(1号中间过滤器和2号中间过滤器)。如上文第56段中所述捕获子 孢子。在所述实施例的一实例中，如所述装载并纯化1,555ng/25,000个子孢子的粗制剂 (减去3号过滤器)。在收集(在0.4微米或0.45微米过滤器上)并重新悬浮后，纯化 制剂含有84ng/25,000个子孢子。此处，减少因子大于18倍并且移除94.6％SGM污染。 认为所述制剂为实质上纯化的。

纯化子孢子的产率范围为起始制剂中的30％到100％子孢子数，通常介于50％与70％ 之间。

所述方法有效减少粗子孢子制剂中的污染。随后保存子孢子。在实施例中，冷藏保 存子孢子(丽芙J.L.(Leef J.L.)等人，世界卫生组织通告(Bull WHO)57(增刊1) (1979)87-91；奥吉A.U.，F.(Orjih A.U.，F.)和纽森维戈RS，美国热带病与卫生学杂 志(Am.J.TroP.Med.Hyg.)(1980)29(3)：343-7)。在实施例中，通过冻干保存 子孢子。在实施例中，通过冷藏保存子孢子。其它保存方法为所属领域的技术人员所知。

减毒

已知诱发疟原虫子孢子减毒的若干方式。所述方式包括可遗传的遗传改变、基因突 变、辐射暴露和于致突变化学物质中暴露、于代谢抑制化学物质中暴露和于环境条件(例 如高或低温或压力)中暴露。

已揭示通过辐射暴露诱发子孢子减毒的方法(例如，参见霍夫曼和卢克，美国专利 第7,229,627号、美国公开案第2005/0220822号)并且以引用方式并入本文中。可将子 孢子减毒至少100Gy但不超过1000Gy，优选地120到200Gy，并且最优选地约150Gy。 本文所揭示疫苗的疟原虫寄生虫的减毒允许子孢子阶段寄生虫保留代谢活性、感染性和 侵入肝细胞的能力(效力)；同时确保寄生虫不会发育到完全成熟的肝裂殖体阶段，不 会重新进入宿主血流、侵入红细胞或达到可引发疾病的发育阶段(安全性)。所述领域 的技术人员可以常规方式确定寄生虫的发育阶段并且视需要调节减毒。

肝细胞疟原虫感染的生物学为活体外分析提供证实效力和安全的机会。通常，子孢 子主要通过血流、但可能通过淋巴系统从蚊子叮咬位点迁移到肝。在肝中，其在肝细胞 内繁殖，在恶性疟原虫情形下每个感染细胞产生约10,000至40,000个子代(裂殖子)。 所述肝阶段寄生虫表达在子孢子中或在稍后发育阶段不表达的多种蛋白质。在肝中发育 到裂殖子阶段后，其从肝细胞释放并重新进入血流，从而表达与在子孢子阶段和肝早期 阶段表达的蛋白质不同的一组不同阶段特异性蛋白质，并且侵入红细胞，其中额外繁殖 每48小时使寄生虫数增加约10到20倍。与在肝中发育5到10天(其不诱发疾病的任 何症状或体征)不同，未经治疗的血液阶段感染会引发溶血、寒颤、发热和虚脱和疟疾 的许多其它症状和体征。

效力分析

可通过使用免疫荧光分析(IFA)测量人类肝细胞培养物中的恶性疟原虫肝阶段抗 原-1(PfLSA-1)的表达来评定纯化辐射-减毒恶性疟原虫子孢子的感染效力水平。PfLSA-1 是一种子孢子不表达，但恶性疟原虫寄生虫(减毒和野生型)在顺利侵入肝细胞后表达 的蛋白质(图3)。PfLSA-1的表达指示减毒子孢子具有代谢活性。

在感染前约24±6小时，以1∶1比率使用杜贝克氏改良鹰氏培养基(Dulbecco′s  modified Eagle′s medium)与补充有10％胎牛血清和2％青霉素(penicillin)/链霉素 (streptomycin)溶液的F-12海姆氏(Ham′s)混合物(HC-04生长培养基)来接种人类 肝细胞(细胞系HC-04[1F9]，参见帕拉楚日J.(Prachumsri，J.)和N.伊马阔(N. Yimamnuaychok)，U.S.7,015,036)。将细胞以4.0×10⁴个细胞/0.3ml/孔的浓度接种到 涂布有巢蛋白-IV型胶原-层粘连蛋白(Entactin Collagen-IV Laminin，ECL)(阿普斯特 (Upstate)的8孔来博泰克普诺克斯(Lab Tek Permanox)(NUNC)腔室载玻片中， 并在37±1℃、5％CO2和80％相对湿度下培育。在接种后24±6小时，单层铺满达到> 80％时，从每一孔中抽吸出培养物上清液，更换0.3ml新鲜HC-04生长培养基并放回培 育箱中。

将减毒恶性疟原虫子孢子用HC-04生长培养基稀释到500个子孢子/μl的浓度。在 抽吸300μl培养基后，随后向每一孔中添加50μl稀释寄生虫试样，使每一孔中含有2.5 ×10⁴个细胞，从而感染HC-04细胞。将经感染肝细胞培育3±0.5小时，通过缓慢抽吸 上清液用HC-04生长培养基洗涤三次，并用0.3ml新鲜培养基/孔来培养。每天观察培 养物中存在污染的任何迹象，共观察三天。在不存在污染时，每天从个别孔抽吸出培养 物上清液并更换0.3ml新鲜HC-04生长培养基并放回培育箱中。在感染后72±6小时， 以显微镜观察培养物中可能的污染。在不存在污染时，将培养物用0.3ml磷酸盐缓冲盐 水(PBS)洗涤三次，于室温下用0.3ml冷甲醇(存储于-20℃下)固定，使用0.3ml PBS 再洗涤三次并存储在0.3ml冷甲醇中。载玻片可在2℃到8℃下的冰箱中存储最长72小 时，直到使用作为一级抗体的抗PfLSA-1多克隆兔血清和经阿莱克萨荧光-488(Alexa  fluor-488)标记的抗兔二级抗体对其进行免疫荧光染色。从经染色载玻片移除塑料腔室 和垫片。使用韦可塔谢尔德(Vectashield)封固剂(媒介)封固载玻片并用盖玻片覆盖。 通过使用具有相位差的落射荧光显微镜对每孔中所有表达PfLSA-1的寄生虫进行计数来 评价载玻片(图3)。如果制剂在任何步骤中都没有污染并且发荧光的寄生虫数量是至 少200/孔，则认为子孢子有效。

疫苗组合物

已提供包含减毒和病原性两种活的疟原虫子孢子的医药组合物和在疫苗和药物测 试中使用所述组合物作为防止性疫苗组合物来防止疾病的方法和作为病原性攻击组合 物来感染志愿者的方法(尤其参见霍夫曼USSN US2005/0220822)。已考虑不同种类的 减毒子孢子用于疫苗中。所述子孢子包括通过不同方法(包括可遗传的遗传改变、基因 突变、辐射暴露和化学暴露)减毒的子孢子。已阐述针对恶性疟原虫(史卡洁克等人， 公共科学图书馆·综合(2008)3：e3549)以及鼠类特异性疟原虫种类(卡佩等人，美国 专利7,122,179；凡代克等人，美国科学院院报(2005)102：12194-12199，洛鲍伊等人， 感染与免疫(2007)75：3758)通过寄生虫的直接遗传操作产生的不同减毒分离物。在实 施例中，通过于γ辐射中暴露达成人类特异性疟原虫的辐射减毒。(霍夫曼S.L.等人. (2002)185：1155-1164)。本文所提供纯化方法打算纯化完全感染的子孢子以及减毒 子孢子。

在实施例中，可对减毒疟原虫子孢子进行遗传操作以含有其它疟原虫种类或其它病 原性有机体的外源性基因，其可在感染之前、期间或之后表达。

还涵盖包含纯化病原性子孢子的接种方法。例如，可将病原性子孢子投与同时用有 效抗无性红细胞阶段寄生虫的抗疟疾药(例如氯喹)治疗的个体，或投与随后用有效抗 无性红细胞阶段寄生虫的抗疟疾药治疗的个体，由此防止由活体内寄生虫引发的病状， 同时允许寄生虫刺激保护性免疫力应答。罗斯顿博格M.(Roestenberg，M.)等人(2009) 新英格兰医学杂志361：468-478；彭波DJ.(Pombo，DJ.)等人(2002)柳叶刀360：610-617。

无菌的纯化病原性子孢子也可用于攻击方案，以在对预先用疫苗和疫苗方法治疗的 志愿者进行的攻击研究中评定这些疫苗和疫苗接种方法的有效性。类似地，在评定化学 预防性药物和治疗剂的有效性的研究中，纯化病原性子孢子可用于产生疟疾的症状、体 征或病状。

由于包含无菌纯化子孢子的组合物和疫苗减少或消除附带物质或污染会引发不需 要的免疫应答、外来病原感染或其它意外结果的风险，所以已经纯化的无菌活病原性子 孢子、以及已经纯化的无菌减毒活子孢子通常比其非无菌、未纯化对等部分更有用。通 常通过非经肠和本文所述其它途径投与包含纯化减毒活疟原虫种类子孢子的疫苗。所述 疫苗用于防止或减轻疟疾的严重性、其表现、症状或其病状。

在实施例中，包含在消毒条件下制备的减毒纯化子孢子的组合物和疫苗在先前未暴 露于引发疟疾的病原体中或经暴露但未完全受保护的人类和其它哺乳动物个体中提供 部分、增强或完全保护。所述组合物和疫苗可类似地用于减少因可引发疟疾的寄生虫(包 括疟原虫种类，例如恶性疟原虫或间日疟原虫和诸如此类)而发生可引发疾病的感染的 机会，并且减少在受感染时生病的机会，减轻在受感染时疾病(例如发热)的严重性， 降低寄生虫在受感染人员中的浓度，或降低暴露于疟疾寄生虫中的群体中因疟疾所致的 死亡率。在许多情形下，与未免疫个体相比，即使部分保护经免疫个体或延迟经免疫个 体被寄生虫感染或因感染而患病的时间也是有益的。类似地，在约30％群体中产生所述 益处中的任一种的疫苗治疗策略都可对社区卫生和居住在所述社区中的个体健康产生 显著影响。在包含病原性子孢子的其它实施例中，所揭示组合物可用于证实疫苗、疟疾 治疗药物和疟疾的其它治疗和防止措施的功效。

提供防止个体中的疟疾的方法。所述方法包含投与个体在消毒条件下制备并且包含 可有效防止疟疾的量的实质上纯化的减毒活疟原虫子孢子的疫苗。

根据所述方法投与疫苗的个体可为易于感染疟疾寄生虫的任一人类或其它哺乳动 物。对于所述方法来说，投与可通过消化道(例如经口)来进行，或者投与可为非经肠 投与，包括但不限于经粘膜、鼻内、表皮、皮肤、肌内、皮下、皮内、粘膜下、静脉内 和诸如此类投与。此外，投与可通过连续输注或单次或多次浓注以及由微型针调介的递 送来进行。

熟练的从业人员通过评价与疟疾感染相关的临床或病理表现(例如温度升高、头痛、 疲劳、昏迷或寄生红细胞的百分比)可容易地确认疟疾的防止和/或治疗。因此，根据本 发明的方法，在投与包含纯化减毒活疟原虫子孢子的疫苗后，个体中疟疾的临床体征、 症状或病理表现显示改良或不存在。

可使用业内已知的方法确定疫苗和免疫原的有效且最佳剂量范围。根据本文所揭示 的例示分析提供关于达成抗疟疾效应的适当剂量的指南。更具体来说，可由所属领域的 技术人员外推本文和所引用参考文献中阐述的免疫类型的结果以提供测试接种计划表。 用不同剂量以计划间隔接种志愿者个体并且评价在随后用感染性寄生虫攻击时测试血 样抵抗疟疾的水平。可使用所述结果分离哺乳动物(尤其人类)个体的有效免疫的最佳 免疫剂量和投药方案(计划表)。有效赋予保护性免疫力的剂量是以1到6次投与的投 药方案投与5,000到400,000个纯化减毒子孢子、更尤其剂量为以至少2次投与的投药 方案投与15,000到270,000个纯化减毒子孢子，且最尤其剂量为以3或4次投与的投药 方案投与25,000到150,000个纯化减毒子孢子。

可通过标准测试测量个体中的免疫应答，所述测试包括但不限于评定体液和细胞免 疫应答，包括但不限于：测量抗原特异性或寄生虫阶段特异性应答；通过业内已知的方 式直接量测周边血液淋巴细胞；天然杀伤细胞细胞毒性分析(普罗文西(Provinciali) 等人，(1992)免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)155：19-24)、细胞增殖分析(弗 伦怀德(Vollenweider)等人(1992)免疫学方法杂志149：133-135)、免疫细胞和亚群 的免疫分析(莱夫勒(Loeffler)等人，(1992)细胞计量术(Cytom.)13：169-174；雷 沃替尼(Rivoltini)等人，(1992)癌症免疫与免疫治疗(Can.Immunol.Immunother.) 34：241-251)；和细胞调介的免疫力的皮肤测试(Chang等人.(1993)癌症研究(Cancer  Res.)53：1043-1050)。已阐述测量免疫系统强度的各种方法和分析，例如，科林根 (Coligan)等人(编辑)(2000)当前免疫学方案)(Current Protocols in Immunology)， 第1卷，威利父子公司(Wiley&Sons)。

所提供疫苗包含实质上不含附带物质的纯化减毒活疟原虫子孢子的消毒和非消毒 组合物，和具有医药上可接受的稀释剂、赋形剂或载剂的组合物。在随后用感染性寄生 虫攻击时，这些疫苗可有效防止或减轻疟疾。调配医药组合物和疫苗的方法已为所属领 域的技术人员熟知(例如，参见雷明顿(Remington)，药学技术与实践(The Science and Practice of Pharmacy)，第21版，亨特利臣(Hendrickson)编辑(USIP：2005))。

本发明涵盖在消毒条件下制备或以其它方式制备且包含纯化的减毒或非减毒活疟 原虫子孢子以及适当稀释剂和缓冲剂的疫苗组合物。稀释剂(通常为磷酸盐缓冲盐水 (PBS)或生理盐水(NS))具有不同缓冲容量pH和离子强度。所述组合物还可包括 赋形剂，例如血清白蛋白，尤其人类血清白蛋白。血清白蛋白可从天然来源(例如人类 血液)纯化得或通过重组DNA或合成技术产生。所述组合物还可包括添加剂，例如抗 氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)和/或防腐剂或低温保存剂。还可向聚合化合物 (例如聚乳酸、聚乙醇酸等)的微粒制剂或脂质体中引入所述物质。(例如，参见雷明 顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第18版(1990)，马克出版公司 (Mack Publishing Co.)，伊斯顿，宾夕法尼亚州，18042，第1435到1712页，其以引 用方式并入本文中)。

为测定疫苗的有效量，普通熟练从业人员通过考虑接受者的治疗背景、年龄和一般 健康状况将能够确认适当剂量。所选剂量取决于期望治疗效果、投与途径和期望治疗持 续时间。可由所属领域的技术人员通过适当人类临床试验确认用于测定剂量量的实验， 其中评价不同投药方案激发抵抗疟疾的能力。

所揭示疫苗和使用这些疫苗的揭示方法可以单一组份形式用于疫苗方案中，每一组 份又包含待分开投与个体的离散疫苗。方案可包括依次用减毒疟原虫种类子孢子和其它 类型的疟原虫疫苗免疫，即所谓的初免-加强策略。所述策略可包括减毒子孢子作为初免 和疟原虫相关重组蛋白质或佐剂中的蛋白质作为加强，或反之亦然。所述策略还可包括 表达疟原虫相关蛋白质的疟原虫相关DNA疫苗或重组病毒(例如腺病毒)作为初免和 纯化减毒子孢子疫苗作为加强，或反之亦然。其还可包括用减毒疟原虫种类子孢子和某 种形式的红细胞内阶段寄生虫(包括灭活的和活的减毒寄生虫)依次或混合免疫。包含 单独组份的疫苗复合物可称作疫苗方案、初免/加强方案、组份疫苗、包含单独疫苗组份 的组份疫苗试剂盒或组份疫苗包装。例如，疫苗复合物可包含作为组份且包含纯化、消 毒、减毒活子孢子的疫苗。复合物可另外包含一种或一种以上重组或合成亚单位疫苗组 份，其包括但不限于重组蛋白、合成多肽、编码这些要素本身或功能上纳入重组病毒、 重组细菌或重组寄生虫中的DNA。疫苗组份还可包括细胞外发育到肝早期阶段的消毒减 毒无菌子孢子。

已阐述来自世界不同地方西非、东非、东南亚等的恶性疟原虫品系。利用一种品系 的减毒子孢子免疫的志愿者呈现可抵抗其它品系(霍夫曼S.L.等人(2002)传染病杂志 (J.Inf.Dis.)，185：1155-1164)。在一实施例中，在子孢子组合物或疫苗调配物中组 合疟原虫种类的多个分离物和/或品系。

已知若干疟原虫种类可在人类中引发疟疾，主要为恶性疟原虫和间日疟原虫。其它 疟原虫种类也会引发疟疾，包括三日疟原虫和卵形疟原虫。已知诺氏疟原虫也可引发人 类疾病。在一实施例中，在疫苗调配物中组合两种或两种以上疟原虫种类。在又一些实 施例中，疫苗方案的单独组份可衍生自不同物种，例如一些剂量来自恶性疟原虫并且其 它剂量来自间日疟原虫。

在另一实施例中，子孢子可为转基因或重组寄生虫，即包括并且表达DNA序列或 基因的寄生虫，所述DNA序列或基因对含有其的寄生虫种类的来说是外来物，本文中 称作转基因。(例如，参见弗兰克-法雅(Franke-Fayard)等人，分子与生化寄生虫学(Molec. and Biochem.Parasitol.)2004在完整生命周期中以高水平组成性表现GFP的伯氏疟原 虫基准线(A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high  level throughout the complete life cycle.)137：23-33；温格尼克K.(Wengelnik，K.)等人.欧 洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)1999，恶性疟原虫TRAP的A域和凝血酶敏感蛋白 相关基元参与蚊子唾液腺的侵入过程(The A-domain and the thrombospondin-related  motif of Plasmodium falciparum TRAP are implicated in the invasion process of mosquito  salivary glands.)，18：5195-5204)。所属领域的技术人员应了解，可根据本文所揭示方 法以与产生转基因寄生虫的母体寄生虫相同的方式和相同程度纯化转基因寄生虫(即含 有转基因的寄生虫)。

最近公布的结果报告，啮齿动物疟疾系统中的跨物种保护作用已显示对发生于人类 疟疾系统中的情况具有高程度的可预测性(赛达各M.(Sedegah，M.)等人(2007)寄 生虫免疫学(Parasite Immunol.)29：559-565)。这表明，包含恶性疟原虫的疫苗组合物 可提供针对间日疟原虫和/或其它人类疟原虫种类的保护性免疫力。

医药组合物可在室温和诸如此类条件下保存、冷冻保存、冻干、喷雾干燥、冷藏或 热稳定化。

上述说明和以下实例二者仅具有例示性和说明性，并非对所主张的本发明的限制。 此外，本发明并不限于所述的特定实施例，因此当然可变化。此外，由于本发明的范围 仅受其权利要求书的限制，故用于阐述特定实施例的术语并不打算具有限制性。

除非另有定义，否则本文所用全部科技术语的含义是本发明所属领域的技术人员通 常所理解的含义。所属领域的技术人员还应了解，与本文所述的方法和物质类似或等效 的任何方法和物质也可用于实践或测试本发明。此外，本文所提及的所有专利、专利申 请案和出版物都以引用方式并入本文中。

除非上下文另外明确指出，否则本文中和附带的权利要求书中所用的单数形式 “一”、“或”和“所述”包括复数形式的指示物。因此，例如，提及“减毒子孢子疫 苗”包括多种所述子孢子，并且提及“所述试剂”包括提及所属领域的技术人员已知的 一种或一种以上试剂和其等效物等。

此外，在生命周期中具有代谢活性、存活但减毒的且能够导致疟疾的临床表现和病 状的子孢子可不同地称为减毒子孢子、活的减毒子孢子和具有代谢活性的活的减毒子孢 子。

说明书和权利要求书中所列的数字参数为可随本发明的期望性质而变化的近似值。 在最低限度上且并非试图限制权利要求书范围的均等论(doctrine of equivalent)的应用， 每一数字参数均应至少根据所报告的有效数位的数字，通过应用普通舍入技术来解释。 尽管如此，仍然应尽可能精确地报告具体实例中所列的数值。然而，从实验测量获得的 任一数值固有地包含来自其实验测量的标准偏差的一定误差。

借助于上述教示内容可对本发明实施多种修改和改变。因此，应理解，可在附带的 权利要求书内以不同于所阐述具体内容的方式来实践本发明。

以下实例进一步阐释本发明。其仅对本发明具有阐释性并且揭示本发明某些实施例 的各种有益性质。所述实例不应理解为限制本发明。

实例

实例1-附带的SGM测定-ELISA

可通过所提供方法纯化任何疟原虫种类的子孢子。本文所提供实例阐述恶性疟原虫 子孢子(PfSPZ)的纯化。然而，其它实施例采用间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原 虫和/或诺氏疟原虫。又一些实施例采用所述寄生虫的混合物。又一些实施例采用每一种 类的减毒子孢子。又一些实施例采用减毒子孢子，其包括并表达对所述寄生虫为外来物 的DNA序列或基因

A-抗SGM兔抗血清的制备

i)从蚊子提取唾液腺

为产生针对蚊子唾液腺的兔抗血清，通过将10到14日龄养虫室饲养的斯氏按蚊置 于4℃冰箱约5分钟而将其固定。将固定化蚊子简单地置于含有70％乙醇的皮氏培养皿 (Petri dish)中并且随后转移到含有1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)的皮氏培养皿中。从每 只蚊子手动剥离一对唾液腺，置于显微镜载玻片上的1X PBS中，并转移到含有20μl 到30μl 1X PBS的1.7ml透明无菌微管(爱思进科技公司(Axygen Scientific Inc.)， CA)中。以每日计，剥离约100只蚊子并将30μl PBS中的100对唾液腺置于-70℃下的 冷冻机中。在已针对一种免疫获得足够唾液腺时，从冷冻机移除小瓶，解冻到室温并汇 集。

ii)唾液腺处理

对于初次接种来说，从1,000只蚊子剥离唾液腺并在-70℃下存储。在接种当天，通 过三个额外冷冻-解冻循环使用干冰/乙醇浴并在室温下解冻来对试样进行解冻，汇集并 解离。使唾液腺在最终体积为600μl的1X PBS中重构成并且用孟他奈德(Montanide) ISA 720(SEPPIC公司费尔菲尔德，纽泽西州)乳化。

对于所有随后免疫来说，从500只蚊子剥离唾液腺并每日在-70℃下存储。在接种当 天，将试样解冻，汇集并用研棒(肯特(Kontes)EF2488A)均质化。用添加到池中的 100μl PBS冲洗研棒。将试样重构成到600μl PBS的最终体积并在重构成后在30分钟 内乳化。

iii)唾液腺乳化

获得2ml玻璃小瓶(两个小瓶用于佐剂对照；两个小瓶用于佐剂中的唾液腺)。通 过5微米过滤用注射器提取750μl孟他奈德ISA 720佐剂。将700μl过滤佐剂注射到每 一玻璃小瓶中。向对照小瓶中添加300μl PBS并且向实验小瓶中添加300μl存于PBS 中的唾液腺。用橡胶塞塞住小瓶。进一步用铝密封盖盖住每一小瓶并且用压接机压所述 密封。将小瓶置于涡流垫的小孔中，胶带向下，并涡旋30分钟。

iv)乳液和接种量

对于初次免疫来说，使用两个玻璃小瓶乳化来自1,000只蚊子的抗原(各自含有 1,000μl 300∶700体积比的唾液腺/PBS∶孟他奈德佐剂)，从而产生总体积为2ml的乳液。 对于随后免疫来说，类似地在总体积2,000μl中乳化来自500只蚊子的抗原。因此，在 随后免疫中注射乳液体积与初次接种物相同但浓度为一半的抗原。所有免疫中的对照兔 接受含有300∶700体积比的PBS∶佐剂的2ml乳液。在1小时乳化内将所有乳液接种到 兔中。

实验兔接受在8个位点处皮下注射的2,000μl唾液腺∶佐剂(以体积计比率为 300∶700)乳液，每个位点注射250μl。对照兔接受在8个位点处皮下注射的2,000μl PBS∶ 佐剂(以体积计比率为300∶700)乳液，每个位点注射250μl。

v)兔免疫计划表

表1提供用于产生本文所提供实例中所用多克隆抗体的免疫计划表。关于多克隆抗 体制备方法，所述计划表并不打算具有限制性，而是仅提供作为本文所用抗体的实例和 揭示内容。

B-SGM ELISA分析

使用酶联免疫吸附分析(ELISA)纯化附带物质。作为一实例，量化恶性疟原虫子 孢子制剂中的源自斯氏按蚊唾液腺的唾液腺物质(SGM)。准备ELISA板(Nunc麦克 索普斯特(Nunc MaxiSorp Cert)，N/Ster，PS，96孔平底免疫板，目录号439454)用 于分析，所述板具有SGM标准物的稀释液(从未感染蚊子的唾液腺制得)和唾液腺粗 制剂的子孢子的试样以及纯化子孢子制剂的试样。一级抗体是以1∶200稀释的兔抗SGM 血清(阐述于上文A中)。二级抗体是以1∶5,000稀释的碱性磷酸酶偶联抗兔IgG(普 洛麦格(Promega)，目录号S373B)。使用KPL蓝磷基质(Blue Phos Substrate)和斯 多福(Stop)试剂盒(KPL，目录号50-88-06和50-89-00)。在635nm下在分子装置微 板读数器上对板进行读数。

用于量化子孢子制剂中的SGM的分析有两个组成部分。第一组成部分由利用已知 浓度的参考SGM生成标准曲线组成，并且第二组成部分由量化纯化前和纯化后试样中 存在的SGM的量组成。使用已知SGM浓度的SGM参考标准物(RS-SGM)作为捕获 抗原生成每一分析的新标准曲线。为建立标准曲线，在含有1％HSA的E-199中制备浓 度降低(2.0μg/mL到0.05μg/mL)的RS-SGM的一系列稀释液。为评定纯化前和纯化 后子孢子制剂中的残余SGM，也将这些试样在含1％HSA的E-199中连续稀释。将稀释 RS-SGM试样和子孢子制剂用1X PBS进一步稀释到0.25％HSA并一式三份地添加到 ELISA板中。所述于PBS中的稀释由于可降低HSA含量而必需。HSA起封阻剂的作用 并且可降低分析的敏感性。将SGM涂布的ELISA板首先与兔多克隆抗SGM抗血清(参 见第100段)且随后与酶标记的抗兔抗体、最后与酶基质(参见第101段)一起培育。 在不存在SGM下，酶基质变色并且孔的内容物的光学密度(OD)改变。使用微板读数 器测定每一试样的OD。为测定SGM在子孢子制剂中的量，用罗吉斯(logistic)混合模 式拟合所述试样和参考标准物的OD值，所述混合模式具有共用渐近线和斜率但分离每 一试样的ED50值。ED50的相对值与参考试样中已知(或指配)浓度的SGM组合使用 以估计纯化前子孢子和VBP试样中的SGM浓度。基于含有共用参考标准物和测试试样 的三个实验分析根据纳入变量估计值的全部数据类似地测定子孢子制剂的95％置信上 限和下限。根据已知存于每一子孢子制剂中的子孢子的数量，计算每25,000个子孢子的 SGM的ng数，如同附带物质的减少因子和减少百分比一般。

表2显示10次生产活动的结果。“开始”代表在研磨从感染蚊子剥离的唾液腺后 汇集的粗制剂中每25,000个子孢子的SGM测量量(以ng表示)。“最终”代表通过 本文所提供方法纯化的制剂中的SGM的相应测量量。所述方法可显著纯化子孢子-- 99.9％或更多。

应认识到，从提供ng SGM/25,000个子孢子的实验测量产生的值是根据所述当前分 析的结果，并不绝对，并且如果使用另一分析或分析方法可在一定程度上不同。

表2.子孢子的纯化

a-构成标记‘开始’、‘减少因子’和‘减少百分比’的栏的数据偏斜。因此，计 算这些数据的几何平均值。以相同方式处理其它栏中的数据以一致。

实例2-活动3中的子孢子的纯化

如所揭示使用尺寸排阻过滤从经研磨唾液腺制剂纯化子孢子。在整个纯化过程中将 子孢子维持于纯化介质中。在纯化结束时，移除试样以进行目测观察(显微镜检验)、 生物负荷测试(美国药典<61>)、测试支原体和螺原体、活体外测定病毒性污染物和 SGM-ELISA分析。

A-子孢子的纯化

纯化用物质的制备：在管中一起接收来自272到356只蚊子的经研磨剥离产物。移 除剥离产物的试样(5μl)并汇集后在22℃下搁置用于目测观察(图1a)。随后将剩余 剥离产物用纯化介质稀释到10ml。此时移除试样(总共100μl)用于计数(20μl)和 SGM分析(60μl)。在纯化持续时间内将所有溶液和试样保持在约22℃下。

纯化程序：使用蠕动泵以约4ml/min(约140L/hr/m2)的流速将稀释剥离产物泵送 通过串联连接的三个过滤器(1号过滤器、2号过滤器和3号过滤器)并通过死端式过 滤捕获在4号过滤器上。1号过滤器(深度过滤器)的孔径为10微米(Polygard-CN 奥普特-密理博目录号SN1HA47HH3)。2号过滤器(深度过滤器)的孔径为0.6微米 (Polygard-CN奥普特过滤器-密理博目录号SN06A47HH3)。3号过滤器的孔径为1.2 微米(埃斯波膜，直径为47mm-密理博目录号RTTP04700)，保持在斯文-洛克过滤器 支架(沃特曼目录号420400)中。在配备有直径为90mm并且孔径为0.4μm的埃斯波 膜(密理博目录号HTTP09030)的搅拌式超滤试池(密理博，型号8200)中利用4号 过滤器捕获过滤物质。将第1运行的总共100ml纯化介质和第2到5运行的总共120ml 纯化介质与稀释剥离产物一起在膜间泵送。之后将另一100ml纯化介质施加到4号过滤 器。在滞留物体积达到约5ml到10ml时，将其收集在一起，用总共35ml纯化介质洗 涤，并将其转移到35ml无菌橡树岭离心管中。以类似方式收集另一35ml洗涤物并且 还将其转移到第二35ml无菌橡树岭离心管。将35ml橡树岭管以16,340g离心5分钟， 并且重新悬浮用于计数，并且保持在约22℃下。

计数后，将所述物质重新悬浮到约15-18x 10⁶个子孢子/ml的浓度。移除150μl用 于评定SGM并在执行SGM-ELISA分析之前在-70℃下冷冻存储。从纯化PfSPZ制剂移 除20μl并施加到显微镜载玻片(图1b)。使子孢子沉降至少5分钟，最多30分钟，并 且以200X放大观察子孢子。对纯化前试样实施类似程序(图1a和1b)。活动中每一 运行的具体数据提供于表3中并且纯化前和纯化后试样的显微镜分析(显微照片)提供 于图1a和1b中。

在活动3中，运行7次，每次运行使用272到356只蚊子(总共2146只蚊子)， 其中每次运行纯化子孢子的产率在40％到75％范围内(平均值为57％)，从而获得总共 61.3x 10⁶个纯化子孢子，之后移出所有试样用于过程内和释放分析。SGM分析(实例 1-表2-活动3)显示纯化子孢子含有0.23ng SGM/25,000个子孢子。所汇集纯化前物质 的SGM含量为836.64ng/25,000个子孢子。在所述实例中，在纯化过程中将子孢子总共 纯化3,637倍。经改进的美国药典<61>生物负荷分析显示无菌落形成单位，换句话说， 无微生物污染。

表3.子孢子产率-活动3

^*产率％＝100x(结束时的SPZ数/开始时的SPZ数)

实例3-活动6中的子孢子的纯化

如上文实例2中所述使用尺寸排阻过滤从经研磨唾液腺制剂纯化子孢子。在整个纯 化过程中将子孢子维持在纯化介质中。移除试样以进行目测观察(显微镜检验)、微生 物测试和用于量化试样中的SGM的量的SGM-ELISA分析。如实例2制备并纯化试样。

在活动6中，运行8次，每次运行使用343到395只蚊子(总共2997只蚊子)， 其中每次运行纯化子孢子的产率在51％到87.5％范围内(平均值为72.3％)，从而获得 总共160.5x 10⁶个纯化子孢子，之后移出所有试样用于过程内和释放分析(表4)。 SGM-ELISA分析(实例1-表2-活动6)显示纯化子孢子含有0.65ng SGM/25,000个子 孢子。所汇集纯化前物质的SGM含量为780.66ng/25,000个子孢子。在所述实例中，在 纯化过程中将子孢子总共纯化1,201倍。经改进的美国药典<61>生物负荷分析显示无菌 落形成单位，换句话说，无微生物污染。纯化前和纯化后试样的显微镜分析(显微照片) 提供于图2中。

表4.子孢子产率-活动6

^*产率％＝100x(结束时的SPZ数/开始时的SPZ数)

实例4：用活动5、6和7的经辐照(150GY)恶性疟原虫子孢子感染人类肝细胞 细胞系(HC-04[1F9])

方法.将PfSPZ与HC-04(1F9)细胞一起培育3天，并且随后评定PfLSA-1的表 达。

表5.在辐照PfSPZ后PfLSA-1在肝阶段寄生虫中的表达。

结果和解释。在肝阶段寄生虫中表达的恶性疟原虫肝阶段抗原-1(PfLSA-1)的检 测可指示减毒和纯化子孢子的效力。如表5中所示，在已将子孢子暴露于150Gy后， 由恶性疟原虫肝阶段寄生虫表达PfLSA-1。

实例5-用经辐照(100Gy、120Gy、142.5Gy、150Gy)或未经辐照恶性疟原虫子 孢子感染人类肝细胞细胞系(HC-04[1F9])。

方法.将子孢子在HC-04(1F9)细胞中培育3天，并且随后评定PfLSA-1的表达。

表6.在不同辐照剂量后表达PfLSA-1的肝阶段寄生虫的数。

结果和解释。将如所指示(表6)暴露于不同辐射剂量中的25,000个PfSPZ添加到 含有HC-04(1F9)细胞的8孔来博泰克(Lab-Tek)载玻片中。将载玻片培育3天并且 评定表达PfLSA-1的寄生虫。如表6中所示，与未辐照Pf子孢子相比，在所述分析中， 暴露于150Gy中的Pf子孢子的活性为未辐照Pf子孢子的91％。所述差别没有达到双尾 司徒登(Student′s)t-测试(p＝0.21)中统计显著性的水平。

所属领域的技术人员在考量本说明书和实践本文所揭示发明后将明了本发明的其 它实施例。打算将本说明书和实例仅视为实例性。此外，在上文中，已参照适宜实施例 阐述本发明，但所述实施例仅用于理解本发明。只要本发明不偏离权利要求书即可作出 多种变化或改变，权利要求书提供本发明的真实范围和精神。