源自番茄组氨酸脱羧酶基因的果实特异性表达启动子及其用途

摘要

本发明涉及源自番茄组氨酸脱羧酶-2(Solanum lycopersicum histidine decarboxylase-2；SlHD-2)基因的植物果实特异性表达启动子以及5′非翻译区(untranslated region；5′-UTR)，还涉及含有上述启动子和5′非翻译区的果实特异性表达载体，以及利用上述表达载体特异性表达外源基因的方法，还涉及用上述表达载体转化的植物体及其种子。与现有技术中广泛使用的可在所有组织中诱导外源基因表达的花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子相比，本发明的启动子能够在转化植物体中将导入的基因进行果实组织特异性表达。此外，本发明能够有效地应用到转化植物体开发当中，以达到在果实中生产有用物质的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及源自番茄组氨酸脱羧酶基因的果实特异性表达启动 子以及其用途。更具体地涉及源自番茄组氨酸脱羧酶基因的植物体果 实特异性表达启动子及5′非翻译区(untranslated region；以下简称 5′-UTR)；含有上述启动子及5′非翻译区的果实特异性表达载体；用 上述表达载体转化的植物体；利用上述表达载体将外源基因进行果实 特异性表达的方法，以及根据上述方法，进行果实特异性表达外源基 因的转化植物体以及其种子。

背景技术

对最近的研究倾向进行观察，研究的方向正在由以往的作为原核 生物的细菌中的物质表达向作为真核生物的植物的物质表达改变。这 是由于从真核生物的植物中获得的物质能够更加稳定地进行提取，并 且在植物体内进行合成期间，如糖基化过程中的物质变化的概率要小 于在细菌中的物质变化的概率。(Albert等，J Exp Bot.59(10)： 2673-2686.2008年5月31日在线公开)。

先前开发的35S启动子在双子叶植物组织的所有部位表达效率 都非常好，因此能最为有效地使用在植物体表达基因上。但是，这种 在希望的组织上将特定的物质进行转化的表达，是不必要的表达，使 得植物承担的负担非常重。因此需要进行在番茄等摄食果实的植物 中，减少茎或叶中的不必要表达，使其在果实中特异性表达的研究。 在植物研究方面番茄作为最好材料而受到瞩目，原因在于番茄是可以 摄食全部果肉的植物，能够将一些物质超表达后，在变熟的状态或生 的状态下摄食，并且可以作为疫苗发挥作用。基于这些优势，最近在 经口腔应用疫苗的开发方面，番茄果实被确认为非常好的材料。 (Giovanni Levia.EMBO Rep.2000年11月15日；1(5)：378-380)。 实际上从最近许多关于疫苗的研究项目可知，很多研究都是利用马铃 薯或甘薯等作物开发疫苗，并作为疫苗商品在市场上销售。(Mason 等，Proc Natl Acad Sci USA.1996年5月28日；93(11)：5335-5340)。 因此，想通过本研究，并且通过开发果实特异性超表达的启动子，对 物质的果实特异性表达进行研究。

由于番茄等植物的果实需要完全成熟后才能进行摄食，因此，在 刚进入成熟期的果实中，如果物质表达能够从开始时期持续到完熟 期，会有大量的物质蓄积到果实中。为了获得这样的效果，选出了即 使在成熟过程中，表达率也能够一直维持或逐渐增加的基因。

本发明的发明人通过微阵列方法选出了从番茄果实的绿熟到红 熟时期中基因的表达逐渐增加或维持的基因，并且选出了其中表达效 率最好的基因，即番茄组氨酸脱羧酶基因。在番茄果实成熟的过程中， 该基因作为从破色开始就蓄积表达的基因，与番茄果实的成熟有关， 因此很适合作为我们想获得的表达效率好的启动子。

韩国专利0784165公开了一种对于辣椒植物的病原体感染的抵 抗性和与辣椒果实成熟过程相关的源自辣椒植物的UDP-葡糖糖基转 移酶进行调节的启动子，韩国专利0574563公开了一种源自拟南芥的 植物体高效率表达启动子，以及含有该启动子的植物体高效率表达载 体，但其与本发明的启动子不同。

发明内容

本发明要解决的技术问题

本发明是根据上述要求而提出并完成。具体如下：将番茄组氨酸 脱羧酶基因的启动子以及5′-UTR进行克隆后，将启动子以及5′-UTR 引入到二元载体，并导入到番茄中，结果发现，外源基因在转化番茄 的果实组织中被特异性表达。

解决技术问题的技术手段

为了解决上述问题，本发明提供一种源自番茄组氨酸脱羧酶基因 的果实特异性表达启动子或5′-UTR。

此外，本发明提供含有上述果实特异性表达启动子和/或5′-UTR 的果实特异性表达载体，以及用上述表达载体转化的植物体。

此外，本发明还提供如下一种在植物体内进行外源基因表达的方 法：在植物体果实中需要大量产出有用物质时，利用上述果实特异性 表达启动子或5′-UTR在植物体内进行外源基因表达。

此外，本发明还提供根据上述方法而制得的外源基因进行果实特 异性表达的转化植物体，以及其种子。

有益效果

根据本发明，利用源自番茄组氨酸脱羧酶基因的果实特异性表达 启动子以及5′-UTR，将外源基因在植物体中进行表达，结果确认所 述该利用源自番茄组氨酸脱羧酶基因的果实特异性表达启动子是能 够在植物体果实中对基因进行特异性表达的新的启动子。

附图说明

图1示出了SOL基因网络数据库的微阵列数据。(B)为根据番 茄成熟过程(A)以及SOL基因网络数据库 (http://www.sgn.cornell.edu)的微阵列数据，对在果实中特异性表达的 基因表达程序进行的概要分析。图中DAP为受粉后的天数；MG为 绿熟期(Mature green stage)；B为破色期(Breaking stage)。

图2示出了有关SlHD-1启动子区域分离的基因组步移PCR。图 中，A-D为从1泳道至4泳道的各自的基因组步移PCR产物；E为 全长940bp的SlHD-1启动子的PCR产物。(M，size marker；1-4， 各为用EcoRV，DraI，PvuII，StuI处理的番茄基因组DNA文库)

图3为转录开始部位(+1)的5′侧翼区域上游的SlHD-1启动子 序列。图中UTR为非翻译区域。

图4为启动子活性分析载体的模式图。图中，pCAM-2300HD (SlHD)是用于全长启动子的载体；pCAM-2300HDΔ630(ΔSlHD₆₃₀) 以及pCAM-2300Δ310(ΔSlHD₃₁₀)为部分缺失的启动子；pCAMBIA  1302(35S)是为了在番茄中瞬时表达的阳性对照组；NOS-t为NOS 终止子(NOS terminator)；35S，CaMV35S启动子；GFP为绿色萤光 蛋白编码基因；组氨酸标记，6组氨酸残基。

图5示出了番茄组织的SlHD-2基因表达。番茄组织以及不同的 果实发育阶段的SlHD-1基因表达水平，实时PCR结果(A)值为在 叶子上将肌动蛋白设定为1时的相对的SlHD-1表达水平。(B)为叶 子(1)、根(2)、种子(3)、花(4)、0.5cm的绿色果实(5)、MG (6)、黄色果实(7)、红色果实(8)的RT-PCR结果。阳性对照组 为番茄肌动蛋白基因。

图6示出了Southern印迹杂交。将由番茄植物分离的基因组DNA 的DNA斑点与500bp SlHD-1启动子探针进行杂交。在泳道1及泳道 2显示的箭头为SlHD-1启动子-特异性条带。各泳道含有10ug基因 组DNA，被HindIII(泳道1)及EcoRI(泳道2)切断。

图7为SlHD-2启动子活性分析结果。通过农杆菌侵染的瞬时表 达显示出，具有SlHD-1启动子的GFP表达的相对水平与番茄组织中 的CaMV 35S启动子不相上下。(A)值为把35S-GFP设定为1.00时 的相对GFP表达水平。(B)值表示平均。

图8显示了，根据农杆菌侵染法的瞬时表达中，利用了SlHD-2 全长启动子以及ΔSlHD630、ΔSlHD310部分缺失的启动子的GFP 表达水平与番茄红熟期的果实中的CaMV 35S启动子不相上下。值表 示平均，对各构建体反复取样3次。(GFP，绿色萤光蛋白；TSP，总 可溶性蛋白质；mg，番茄果实的绿熟期)

具体实施例

为了实现本发明的目的，本发明提供包括图3的序列(Seq ID  No.1)中的1至784(转录开始部位到-784至-1部位)的碱基序列的 果实特异性表达启动子。

与现有技术中广为使用的源自花椰菜的花叶病毒的CaMV35S启 动子在整个组织中对被导入的基因进行表达相比，上述本发明的果实 特异性表达启动子能够将转化植物体中被导入的基因进行果实特异 性表达。

为了实现本发明的目的，本发明提供含有图3序列(Seq ID No.1) 中的785至940(转录开始部位到+1至+156部位)的碱基序列的 5′-UTR。

并且，上述启动子序列或5′-UTR序列的变体包含在本发明的范 围内。变体的碱基序列虽然变化，但是其碱基序列的功能特性与序列 号1的碱基序列类似。具体地，上述启动子序列以及5′-UTR序列能 够包括与序列号1的碱基序列同一性超过70％以上的碱基序列，优选 为80％以上，更优选为90％以上，最优选能够达到95％以上。

对于多核苷酸的“序列同一性的％”通过两个最佳排列的序列和 比较区域进行比较来确认，与两个序列的最佳序列的参考序列(不包 括添加或缺失)相比，在比较区域中的多核苷酸序列的一部分能够包 括添加或缺失(即，缺口)。

为了实现本发明的另外一个目的，本发明提供含有上述植物体果 实特异性表达启动子和/或5′-UTR的果实特异性表达载体。

本发明的果实特异性表达载体仅含有上述本发明的启动子或也 可以将本发明的5′-UTR跟类似于CaMV35S的一般植物体表达启动 子组合使用，但优选为包括上述本发明的启动子和5′-UTR，以便有 利于在植物体中将导入基因进行果实特异性表达。

本发明的果实特异性表达载体能够用作瞬时表达载体，在导入了 外源基因的植物体内能够进行瞬时表达，也可用作在导入外源基因的 植物体内进行永久表达的植物表达载体。

能够用于本发明的二元载体与根癌土壤杆菌的Ti质粒同时存在 时，可以成为能够将植物体进行转化的含有T-DNA的右侧序列和左 侧序列的任一种二元载体，优选为本领域经常使用的pBI101(Cat#： 6018-1，Clontech，美国)、pBIN19(Genbank登录号为U09365)、 pBI121、pCAMBIA等载体。

根据本发明的一个具体例的果实特异性表达载体可以为图4所 示的pCAM-2300HD，但并不限于此。将本发明的启动子插入到具有 GFP基因的用于分析启动子的二元载体(pCAMBIA 1391Z)中，制 备pCAM-2300HD(图4)，并用于利用农杆菌(Agrobacterium)的植 物转化当中。能够将上述GFP报道基因替换为其它目的的外源基因， 这一点是本领域人员公知的。

术语“载体”用于指定向细胞内传递的DNA片段、核酸分子。 载体复制DNA，并能够在宿主细胞中独立再生产。术语“运载体” 经常与“载体”互换使用。“表达载体”表示重组DNA分子，该重组 DNA分子含有适当核酸序列，所述适当核酸序列对于目标编码序列 的表达以及在特定宿主生物中使可操作连接的编码序列进行表达所 必须的。真核细胞中可以利用的启动子、增强子、终止信号及聚腺苷 酸化信号是公知的。

植物表达载体的优选例为：当存在于根癌土壤杆菌等适当的宿主 内时，能够将其本身的一部分，所谓T-区域向植物细胞转移的Ti-质 粒载体。其它类型的Ti-质粒载体(参照EP 0 116 718B1号)用于 向原生质体转移杂种DNA序列。所述原生质体为将现在的植物细胞， 或杂种DNA适当地插入到植物的基因组内的能够产生新植物的原生 质体。Ti-质粒载体的最优选形态为如EP0 120 516B1及美国专利4, 940,838请求保护的所谓二元(binary)载体。能够将本发明的基因导 入到植物宿主内的其它适合的载体可从来源于双链植物病毒(如Ca  MV)以及单链植物病毒、双粒病毒等的病毒载体中选择，例如可以 选自缺陷植物病毒载体。这样的载体的使用特别利于很难将植物宿主 适当进行转化的情况。

表达载体优选为包括一个以上的选择性标记。上述标记通常为具 有能够用化学方法选择的特性的核酸序列，能够将转化的细胞从非转 化的细胞中区分开的所有基因都相当于所述标记。例如有草甘膦 (glyphosate)或草丁膦等除草剂抗性基因、卡那霉素、G418、博来 霉素(Bleomycin)、潮霉素(hygromycin)、氯霉素(chloramphenicol) 等耐抗生素病毒，但并不仅限于此。

根据本发明的一个具体例中的植物表达载体中，可以使用一般的 终止子，例如有胭脂碱合酶(NOS)终止子、水稻α-淀粉酶RAmyl  A终止子、菜豆碱(phaseoline)终止子、根癌土壤杆菌(Agrobacterium  tumefaciens)的章鱼碱(Octopine)基因的终止子等，但并不限于这 些。

为了实现本发明的另一目的，本发明提供用本发明的果实特异性 植物表达载体转化的大肠菌(E.coli)或根癌土壤杆菌。

为了达成本发明的另一目的，本发明提供用本发明的果实特异性 植物表达载体转化的植物体以及其种子。

不管是双子叶或单子叶植物，本发明的果实特异性表达载体能够 转化任何植物体，但在本发明中是在番茄中进行了转化。根据本发明 的一个具体例的上述植物体可以是番茄、拟南芥、马铃薯、茄子、烟、 辣椒、牛蒡、茼蒿、莴苣、桔梗、菠菜、叶用甜菜、番薯、芹菜、胡 萝卜、六瓣合叶子、西芹、白菜、卷心菜、萝卜、西瓜、香瓜、黄瓜、 南瓜、葫芦、草莓、大豆、绿豆、四季豆或豌豆等双子叶植物。

植物的转化是指将DNA转移到植物的任意方法。这种转化方法 没有必要一定具有再生及(或)组织培养期。植物种的转化现在不仅 是对于双子叶植物，对于包括双子叶植物和单子叶植物两者的植物种 是常见的。原则上，任意的转化方法能够适用于将本发明的杂种DNA 导入到适当的先祖细胞。方法可以从对于原生质体的钙/聚乙烯乙二 醇法(Krens，F.A等，1982，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，June  1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)、原生质体的电穿孔法(Shillito R.D. 等，1985Bio/Technol.3，1099-1102)、作为植物要素的显微注射法 (Crossway A.等，1986，Mol.Gen.Genet.202，179-185)、各种植物 元件的(DNA或RNA-包被的)微粒轰击法(Klein T.M.等，1987， Nature 327，70)、植物的浸润或成熟花粉或小孢子的转化引起的根癌 农杆菌属介导的基因转移中(缺陷)病毒的感染(EP 0 301 316号) 等中进行选择。本发明的优选方法包括由农杆菌属介导的DNA传递。 特别优选为如记载于EP A 120 516号及美国专利第4,940,838号的利 用所谓二元载体的技术。

用于植物转化的“植物细胞”可以是任何植物细胞。植物细胞可 来自培养细胞、培养组织、培养器官或植物整体，优选为培养细胞、 培养组织或培养器官，以及更优选为培养细胞的任何形态。

“植物组织”为分化或未分化的植物组织，但并不限于这些，例 如包括果实、茎、叶子、花粉、种子、瘤组织及用于培养的多种形态 的细胞，即单一细胞、原生质体、芽及愈伤组织。植物组织可以为植 物或器官培养、组织培养或细胞培养状态中的组织。

为了达成本发明的另一目的，本发明提供将外源基因在转化植物 体中进行果实特异性表达的方法。

该方法包括在本发明的果实特异性表达载体上重组外源基因的 步骤；以及将上述重组的果实特异性表达载体转化到植物体上的步 骤。

上述外源基因可以为希望在植物体果实中表达的任何基因，在本 发明的果实特异性表达载体中位于上述启动子的后面，并可根据需要 与报道基因融合进行表达。将上述重组果实特异性表达载体转化到植 物体上的方法可以按照前面所述的方法实施。在本发明的一个具体例 中的方法中，上述植物体可以是番茄、拟南芥、马铃薯、茄子、烟、 辣椒、牛蒡、茼蒿、莴苣、桔梗、菠菜、叶用甜菜、番薯、芹菜、胡 萝卜、六瓣合叶子、西芹、白菜、卷心菜、萝卜、西瓜、香瓜、黄瓜、 南瓜、葫芦、草莓、大豆、绿豆、四季豆或豌豆等双子叶植物。

为了实现本发明的另一目的，本发明提供由上述方法制得的外源 基因进行果实特异性表达的转化植物体及其种子。上述转化植物体能 够由果实特异性表达启动子和/或5′-UTR将外源基因进行果实特异性 表达。

下面，通过具体实施例，对本发明更加详细地说明。这些实施例 仅是为了例示本发明，本发明的范围并不能解释为仅限于这些实施 例。

材料及方法

1、植物材料

番茄(Solanum lycopersicum cv.Micro-Tom)植物体在培养室中 保持24℃的温度。

2、为了得知番茄基因组(genomic)DNA分离及5′-上游区域的 基因组步移PCR

为了提取番茄基因DNA，利用液氮将番茄叶组织磨细，根据 DNeasy plant小型试剂盒(Qiagen，德国)的标准操作规程进行提取。 然后将2.5ug的基因组DNA利用80单位的DraI，EcoRV，PvuII，StuI 在37℃下处理16小时以上，以使得生成钝(blunt)端，然后用苯酚： 三氯甲烷(1∶1)进行纯化，用100％乙醇进行回收，然后溶于20ul 的灭菌蒸馏水中。将其中的4ul与基因组步移接头(Genome walker  Adaptor)片段(clontech，USA)进行连接，将接头(Adaptor)引物 1(AP1)和SlHD基因特异性引物1(GSP1)进行1次PCR，其反 应组成如下。DNA聚合酶缓冲液，1.5mM Mg(OAc)₂，各2.5mM dNTP (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)，各10pm引物(AP1及SlHDGSP1)； 模板为1ul连接DNA及0.1U DNA聚合酶，并且，1次PCR反应条 件为在94℃下25sec；72℃下，反应3min，共实施7次循环，之后在 94℃，25s；67℃，反应3min，共实施32次循环，追加地，在67℃ 下反应7min，共进行一次，然后将温度降至4℃，结束反应。将1次 PCR反应得到的产物稀释至1/50，然后用AP2和GSP2进行2次巢 式PCR反应，反应组成同1次PCR反应组成，2次巢式PCR反应为 在94℃下25s；72℃下，反应3min，共实施5次循环，在94℃，25s； 67℃，反应3min，共实施20次循环，追加地，在67℃下反应7min， 共进行一次，然后将温度降至4℃，结束反应。用于上述PCR反应的 引物序列如表1中所示。为了确认PCR的结果，用1％琼脂糖凝胶中 进行电泳实验。

3、DH5α/E.coli感受态细胞的制备及转化

将E.coli菌株DH5α接种到3ml的LB培养基中(蛋白胨10g/L， 酵母提取液5g/L，NaCl 10g/L，pH7.2)，在37℃下振荡培养18小时 以上后，在100ml的LB液体培养基中进行再培养，直至在600nm处 的O.D值为0.4～0.45。将培养液在冰上放置15分钟后，在4℃，4000rpm 转速下离心分离20分钟进行回收。用冰冷的80mM MgCl₂-20mM  CaCl₂溶液对回收得到的E.coli进行处理。然后放置于冰上15min， 然后在4℃，4000rpm转速下离心分离20分钟，然后用2ml的冰冷的 0.1M CaCl₂溶液处理后用于转化。当需要立即使用时，在冰上放置30 分钟后使用，与此相反，当不需要立即使用时，添加15～20％丙三醇 后，于-70℃下保存。

在感受态细胞中混入DNA后，在冰上放置30分钟，然后在42 ℃下放置90s进行热冲击后，加入1ml的不含有抗生素的LB液体培 养基，于37℃下培养1小时。然后涂布到含有抗生素的LB培养基上， 选出转化的菌落。培养选出的菌落，用Accup prep.小型试剂盒 (Bioneer，Korea)分离质粒后，采用限制性内切核酸酶进行确认。

4、农杆菌感受态细胞的制备及转化

将农杆菌属接种于5ml的YEP(酵母提取液10g/L，蛋白胨10g/L， NaCl 5g/L，pH7.2)液体培养基中，于28℃下振荡培养后，将培养得 到的1ml放置到50ml的YEP液体培养基中进行再培养，直至在600nm 处的O.D值为0.6-1.0。然后将其在冰上放置30分钟后，在4℃， 4000rpm转速下离心分离20分钟后，在冰冷的0.15M NaCl中再悬浮 后，在冰上放置10分钟。然后在4℃，4000rpm转速下离心分离20 分钟，然后将再次回收得到的沉淀悬浮于1ml的20mM CaCl₂中，分 别按照50ul进行加入。然后在液氮中急速冷冻，于-70℃下保存。

在保存的感受态细胞中加入1ug的DNA混合后，在液氮中冷冻 2分钟，在37℃下进行5分钟热冲击处理，轻轻地混合，然后再次重 复上述步骤。然后，在冰上放置30分钟后，加入1ml的YEP液体培 养基，在28℃下培养2小时后，涂布到含有Rif50mg/L、Km 50mg/L 的YEP固体培养基上，选出转化的菌落。

5、SlHD启动子区域的重组载体

SlHD启动子区域通过基因组步移PCR确定了1kb区域，将其用 SlHD F引物和SlHD R引物进行PCR反应，为了将其重组到 pCAMBIA1391Z上，用HindIII和BamHI酶进行切割，通过T4连接 酶在24℃下进行3小时连接，转化到DH5α/E.coli感受态细胞上， 在LB+Km 50mg/L的琼脂板上进行挑选，将其用HindIII和BamHI 酶进行切割确认，并从而提取了质粒。将提取到的质粒转化到农杆菌 LBA4404菌株感受态细胞上，在YEP+Rif 50mg/L+Km 50mg/L的琼 脂板上进行挑选，然后将其用于利用了农杆菌侵染的植物转化中。

为了进行番茄瞬时表达试验，采用上述方法，在pCAMBIA2300 上融合有GFP的载体上重组了SlHD启动子区域，并转化到农杆菌 LBA4404感受态细胞上。此外，为了确认顺式作用元件的作用和表 达水平进行了缺失试验。为了进行缺失试验，将SlHD启动子区域分 别用-480/+156区域和-155/+156进行重组。首先将各个区域在全长中， 将ΔSlHD630引物和ΔSlHD310引物同SlHD反向引物一起进行PCR 反应，用HindⅢ和BamHⅠ酶进行切割，重组到pCAMBIA2300-GFP 载体上，将其转化到农杆菌LBA4404感受态细胞上。用于克隆的引 物序列如表1中所示。

6、RNA提取及实时PCR

为了用于实时PCR进行了RNA提取。利用TRI REAGENT取番 茄的0.5cm直径的青果、绿熟、破色(breaking)、红熟(red ripe)时 期的果实和叶子，分别取50mg试样磨细后使用。首先用TRI试剂将 50mg的番茄组织进行均质处理后，加入1ml的TRI试剂。进行漩涡 震荡(voltexing)处理后在室温下放置5分钟。加入0.2ml三氯甲烷 后剧烈混合。在室温下放置15分钟后，在4℃，12000rpm的转速下 进行15分钟离心分离。将0.5ml水相移至新的试管中，加入0.5ml 的异丙醇充分混合。在室温下放置10分钟后，在4℃，12000转速下 进行15分钟离心分离。去除上清液，仅将RNA粒状沉淀(pellet) 用0.5ml的75％EtOH洗净。然后将该沉淀充分溶于含有DEPC的20ul 水中。

RT-PCR采用上面提取得到的RNA。定量1ug RNA，分别与引物 混合后进行实验。使用了SYBR Green Master Mix试剂盒(QuantiTect  SYBR Green PCR Handbook.WWW.QIAGEN.COM)。实时PCR方法 是在94℃下进行15分钟热变性处理后，将循环条件设定为94℃下1 分钟、52℃下1分钟、72℃下30s，进行40次循环。引物采用SlHD 外显子和3′-UTR制备的特异性引物组进行的，在PCR反应后，作为 阳性对照组使用了番茄肌动蛋白基因的引物。

7、Southern印迹杂交

使用了20ug番茄基因组DNA。SlHD-2基因启动子是利用 Southern印迹DIG探针合成试剂盒(Rochi)，并利用已知的基因， 用DIG探针合成试剂盒对新获得的长度为360bp的5′-上游的DNA 进行PCR反应。确定了该产物后，进行了Southern印迹试验。在进 行DNA上样之前，利用之前制备好的引物合成DIG探针备用。然后 从番茄的叶子中提取整体基因组DNA，分别用HindⅢ、EcoRⅠ对 20ug的DNA处理后，加样到0.8％琼脂糖凝胶中。在25V下进行5 小时电泳处理。电泳结束后，采用真空方法，将凝胶的DNA转移到 纤维素膜(Hybond N+，Amersham)上进行杂交，并观察结果。在真 空装置上将膜(Hybond N+，Amersham)和凝胶叠加后，启动装置， 在凝胶上倾倒30ml的0.25M HCl，反应10分钟。倾倒50ml变性溶 液(0.4N NaOH)反应20分钟。倾倒50ml的中和溶液(0.2M Tris-HCl  pH7.5)，反应20分钟。然后，转移步骤以每30分钟充填一次转移液 (Transfer solution)的方式实施2小时。使用DIG探针抗体检出后， 采用显色法进行了实验。杂交是在杂交溶液(5xSSC，0.02％SDS， 0.1％N-月桂酰肌氨酸钠盐，1％阻断剂)中进行1小时预杂交。然 后去除预杂交溶液，加入25ml的用DIG进行标记的DNA探针溶液。 24小时后去除探针溶液，在常温下，用2xSSC，0.1％SDS溶液清洗 5分钟。将试剂更换为2xSSC，0.5％SDS溶液(20ml)，在和预杂交 步骤相同的温度下，清洗15分钟，清洗两次。在免疫检出步骤中采 用清洗缓冲液(0.1M马来酸，0.15M NaCl pH 7.5，0.3％吐温20)在 常温下清洗5分钟。将10x封闭液(封闭试剂，马来酸缓冲液)和马 来酸缓冲液(0.1M马来酸，0.15M NaCl，用NaOH调节成pH7.5) 按照1∶9混合后，在常温下孵育30分钟。在按照1∶9混合的封闭 缓冲液中加入抗-洋地黄毒-AP(当为20ml封闭缓冲液时为4ul抗-洋 地黄毒-AP)，在常温下反应30分钟。反应结束后用100ml清洗缓冲 液在常温下清洗15分钟，清洗两次。然后，用20ml的检测缓冲液 (0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl)在常温下处理5分钟。然后在该检测 缓冲液中加入200ul的NBT/BCIP(200ulNBT/BCIP/检测缓冲液 10ml)。在常温下反应16小时以上。

8、瞬时表达试验

为了进行瞬时表达试验先预培养农杆菌LBA4404菌株，然后在 20ml的含有200uM乙酰丁香酮的YEP液体培养基中再培养，直至 O.D＝～0.7后，在4℃、4500rpm转速下进行20分钟离心分离，然后 将回收的细胞再悬浮于20ml的添加了200uM乙酰丁香酮的1/2MS 培养基(MS 2.2g，2％蔗糖，pH5.7)中，利用注射器注射到番茄种 子中，使种子感染农杆菌，并渗入到叶和果实中。2.5天后取试样， 将其与蛋白质提取缓冲液(PEB)一起研磨后，在4℃、15000rpm转 速下进行30分钟离心分离，进行准备，通过利用组氨酸标记的单克 隆抗体的ELISA方法确认了表达量。以农杆菌自身表达的GUS表达 量为基准进行了归一化。

9、ELISA(酶联免疫吸附测定)

将试样与蛋白质包被缓冲液(PCB，3.3g/L Na₂CO₃，6.0g/LNaHCO₃  pH9.6)一起粉碎后，在4℃、15000rpm转速下进行离心分离，将上 清液在96孔微孔板上加入100ul，然后将其在常温下放置2小时。然 后用蛋白质提取缓冲液(PEB，1.16g/L Na₂HPO₄，0.1g/L KCl，0.1g/L  K₃PO₄，4.0g/L NaCl，pH7.4)清洗，加入200ul封闭缓冲液(5％脱 脂乳)后，在常温下放置2小时。然后，将其用PEB进行2次清洗， 加入50ul的稀释成10^-7的1次抗体(novagen，Germany)，在常温下 放置2小时，以使得希望相互作用的蛋白质间充分作用。然后用PEB 清洗4次以上，将2次组氨酸标记的单克隆抗体(sigma，USA)以 1∶2000的比例用PEB稀释，加入50ul。放置于室温下反应了1小时， 将其用PEB清洗4次后，加入50ul基质溶液(BD bioscience，USA)， 在常温下放置30分钟，加入50ul停止液(2.5M H₂SO₄)，结束反应。 测其450nm波长的吸光度值。(Konrad Birkhaug.Am J Public Health  Nations Health.1950年5月；40(5)：545-554)。

实施例1果实特异性表达基因组选取

在SOL基因网络数据库(http://www.sgn.cornell.edu)中的番茄 微阵列结果中，选取了随着果实的成熟，表达增加的共11个基因(图 1)。制作了能够将选出基因的3′UTR部分和外显子部位进行扩增的引 物，为了测定实际上果实中的表达率是否良好，使用RT-PCR对mRNA 的表达率进行调查的结果为：从绿熟期到红熟期(red ripe stage)，番 茄组氨酸脱羧酶-1、-2(SlHD-1，SlHD-2)及脂肪氧化酶、鸟苷酸结 合蛋白beta亚基(GBB)基因的表达率渐渐增加。

实施例2染色体步移(Genome Walking)

对微阵列找到的11个基因都进行了用基因组步移PCR得知启动 子部位的实验。首先利用已知的基因情报制作了基因特异性引物 GSP1和GSP2。在基因组步移程序库中利用该引物和在基因组步移试 剂盒上的接头特异性引物AP1、AP2进行了PCR反应。由SlHD-1、 SlHD-2、GBB基因中分离出了约1kb以上的推定的启动子。采用瞬 时表达分析方法，在番茄果实中，对由预实验分离得到的putative启 动子的活性进行确认的结果为，只有SlHD-2显示出了果实特异性表 达的上涨。用于SlHD-2基因的基因组步移PCR的引物组如表1中所 示。表1中，将GSP及AP引物用于基因组步移PCR中，将SlHD  Fwd/Rvs、ΔSlHD630、ΔSlHD310引物用于扩增全长及部分缺失的 启动子区域上，将Fwd/Rvs引物用于瞬时PCR分析上。

表1为了SlHD-1启动子分离而使用的引物

^*划线部分表示限制性内切酶。

根据4泳道基因组步移PCR找到了SlHD-2的156bp5′非翻译区 (5′UTR)和784bp的启动子部位(图2的A，B，C，D)，以此为 基础构成重叠群碱基序列后制作了SlHD Fwd/Rvs引物。用这些引物 在番茄基因组DNA中扩增含有5′UTR的约940bp启动子部位(图 2E)。将扩增的SlHD-2启动子部位重组到pGEM-T载体上，确定碱 基序列，通过PLANTCARE(www.plantcare.com)系统对SlHD-2启 动子部位进行分析的结果，找到了多种顺式作用元件。最小(Minimal) 启动子区域在-70和-30位置分别存在CAT框和TATA框，因此可以 推测出来。除此之外，还对SlHD-2启动子的碱基序列上的-780部位 的CAT框，-390部位的TGACG框的顺式作用元件进行分析(图3)。

实施例3番茄组织中SlHD-2基因的表达

在番茄的叶子、种子、茎、花组织和各个成熟阶段的果实组织中 提取RNA，进行实时PCR和RT-PCR的结果，除了红熟期的果实外， 在其它剩下的组织中，SlHD-2的表达均显示出了比肌动蛋白低的数 值。但是，随着果实的成熟，其表达量逐渐增加，在红熟期时显示出 了最高的表达量，这个表达量与肌动蛋白表达量相比，显示出了很高 的数值(图5)。因此可知，SlHD-2基因对果实特异性表达，并且可 知该基因是随着果实的成熟，表达增加的基因。

实施例4 Southern印迹杂交

组氨酸脱羧酶基因在番茄中以多种家族成员身份存在。为了得知 在番茄基因组中，SlHD-2启动子以第几拷贝存在，进行了Southern 印迹实验。用HindIII处理的试样在6kb的位置能够看到一个条带， 用EcoRI处理的试样在4kb的位置还能看到1个条带(图6)。从该 结果能够得知SlHD-2基因的启动子在番茄基因组中以1拷贝存在。

实施例5 SlHD-2启动子的活性分析

扩增SlHD-2基因启动子部位，将其重组到GFP C-末端部位融合 有六组氨酸残基的pCAMBIA2300-GFP质粒上制作了 pCAM-2300HD载体，以用于启动子活性分析(图4)。将含有重组的 pCAM-2300HD的农杆菌采用农杆菌渗透法注入到番茄组织中，2-3 天后确认了组织中瞬时表达的GFP量。将各个组织中受到CaMV35S 启动子调节的GFP基因(pCAMBIA 1302)的表达量视为1.00，对 SlHD-2启动子的相对活性比较的结果，可以看出在叶子组织中 SlHD-2的活性与35S启动子相比低0.5倍左右，与此相反，在红熟期 的果实中高出了2倍以上(图7的A)。并且，与叶子组织相比，在 果实中显示出了约2.5倍左右之高的表达量，考虑到与叶子组织相比 35S活性在红熟期的果实中降低为50％的水平，这样的结果能够证明 SlHD-2启动子为果实特异性表达(图7B)。

实施例6利用缺失分析的启动子活性部位调查

为了得知启动子的活性部位，进行了缺失分析。先将304bp缺失 了含有156bp的5′UTR的约940bp的启动子部位的5′上游部位的Δ SlHD630，以及缺失了5′上游部位的629bp的ΔSlHD310启动子重组 到pCAM2300-GFP上，采用瞬时表达法在番茄红熟期果实组织中进 行了启动子活性调查。其结果为，启动子活性在作为全长启动子的 SlHD-2中显示出了最高的活性，在两种缺失的启动子中表达量减少 了80％以上。并且，将ΔSlHD630和ΔSlHD310进行比较的结果为， 活性上几乎不存在差异(图8)。这说明显示果实特异性的顺式作用 元件可能存在于SlHD-2启动子的-784～-304附近。