番茄果实特异启动子在柑橘中的活性分析及柑橘果实差异表达基因的分离

摘要

果实特异启动子在利用转基因技术改良品质性状策略中起着重要作用。本研究利用瞬时表达及转基因技术研究了番茄果实特异启动子2A11在金柑(Fortunella crassifolia Swingle)中对GUS基因的表达调控，旨在探索番茄果实特异启动子可否应用于柑橘育种。同时，利用cDNA-AFLP技术筛选了脐橙果实成熟期间差异表达的基因片段，为果实特异启动子的分离奠定基础。主要结果如下： 1.构建适于瞬时表达的植物表达载体并研究番茄果实特异启动子2A11在金柑中指导GUS基因表达的特性为避免因GUS基因在农杆菌细胞中表达对植物瞬时表达研究的干扰，本研究应用接头连接酶切产物策略，以植物表达载体pCambia1301的带内含子的GUS (iGUS)基因替换植物表达载体pBI121中的GUS基因，构建了以pBI121为基础载体并含有iGUS的植物表达载体pLZ13，其正确性得到PCR、酶切以及测序的验证。以金柑不同组织为材料，通过农杆菌介导开展瞬时表达研究，结果表明pLZ13和pCambia1301载体两载体的GUS在CaMV 35S组成型启动子调控下的表达没有差异。同时，农杆菌染色表明，两载体中的iGUS基因不会导致GUS染色反应。本研究构建的pLZ13是一种同时适于瞬时表达和转基因研究的植物表达载体。 将克隆得到的番茄果实特异启动子2A11代替pLZ13中的CaMV 35S启动子构建成适于瞬时表达研究的植物表达载体。通过农杆菌介导的瞬时表达研究，发现在2A11启动子指导下，iGUS基因在金柑生殖器官中的表达较强，而在营养器官中表达很弱或者不表达。研究结果表明番茄果实特异启动子2A11具有作为金柑果实特异启动子的潜力。 2.获得了导入2A11-GUS的转基因金柑植株为验证瞬时表达的结果，本研究利用转基因技术对2A11启动子调控GUS基因的表达特性进行研究。通过将GUS基因构建于待测启动子2A11调控下，将sGUS(经过截短的GUS)基因置于CaMV 35S启动子下，将两者置于同一个植物表达载体的T-DNA区，构建成pLZ16植物表达载体。这样，通过转基因GUS和sGUS基因可被插入到植物染色体的同一位点，排除插入位点侧翼序列对两基因表达影响的差异，通过比较基因表达强度可判断2A11是否具有果实特异性。利用已经建立的金柑遗传转化体系，将该载体导入了金柑。通过普通PCR，多重PCR以及实时荧光定量PCR检测表明已获得3株转基因植株。为后续启动子活性分析奠定基础。 3.利用cDNA-AFLP技术分离了脐橙果实差异表达的基因以脐橙成熟、未成熟果实的果皮和果肉为试材，应用cDNA-AFLP结合Amresco3:1 HRB琼脂糖凝胶电泳技术，采用66对引物组合，对差异表达的基因进行了筛选，克隆了40个差异表达的cDNA-AFLP片段。测序和氨基酸序列同源性分析表明，这些基因参与了果实光合作用、呼吸作用、磷酯合成、基因转录以及对逆境和病原的响应，同时发现其中一个cDNA编码酸性转化酶/果胶甲酯酶基因家族的一个新成员。选择其中5个基因表达差异明显的cDNA-AFLP片段，利用实时荧光定量PCR技术验证了这些基因特异表达的真实性，并分析了它们在不同果实发育时期及不同组织中的基因表达情况。结果表明，它们在非果实组织中表达较低，而在成熟或未成熟的果皮或汁囊中表达较强，因此是后续柑橘果实成熟特异启动子分离工作的理想候选基因。

目录

论文说明:缩略语表

摘要

第一章文献综述

1.组织特异启动子的研究现状

1.1研究意义和必要性

1.2组织特异启动子的研究现状

1.3组织特异启动子在不同植物间的保守性

1.4组织特异启动子在柑橘上的应用

2.差异基因分离的主要方法

2.1 mRNA差异显示

2.2消减杂交

2.3基因表达系列分析

2.4抑制性消减杂交

2.5 cDNA-AFLP

2.6 cDNA芯片

2.7儿种差异基因分离方法的比较

2.8柑橘差异基因的分离

3.基因表达定量分析技术

3.1 Northern杂交

3.2半定量RTPCR技术

3.3实时定量RT-PCR技术

3.4基因表达定量分析技术比较

3.5柑橘基因表达分析的应用技术

4.启动子特异性功能的鉴定技术

4.1转基因技术

4.2瞬时表达

4.3两种研究方法比较

5.主要研究内容

第二章番茄果实特异启动子2A11的克隆及其在金柑中的瞬时表达

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1感受态细胞制备和转化条件优化

2.2启动子的克隆鉴定

2.3瞬时表达载体pLZ13的鉴定

2.4表达载体质粒纯化

2.5植物表达载体pLZ13中iGUS基因的瞬时表达特性功能鉴定

2.6含2A11启动子的植物表达载体pLZ14的鉴定

2.7含2A11启动子的植物表达载体pLZ14瞬时表达结果

3.讨论

3.1瞬时表达载体的构建

3.2 2A11启动子调控GUS基因的瞬时表达研究

第三章应用转基因手段研究番茄2A11启动子在金柑中的活性

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1植物表达载体pLZ15及pLZ16构建

2.2 pLZ15和pLZ16转化金柑

3.讨论

3.1适于启动子强度检测的表达载体构建

3.2农杆菌介导的金柑转基因

3.3转基因植株检测

第四章利用cDNAAFLP技术分离脐橙成熟果实特异表达基因

1.材料与方法

1.1材料

1.2 RNA提取

1.3 mRNA分离

1.4 mRNA荧光定量

1.5双链cDNA的合成

1.6 cDNAAFLP操作流程

2.结果与分析

2.1脐橙果实果皮果肉组织RNA的提取

2.2 cDNAAFLP技术体系的建立

2.3特异片段回收，克隆及测序结果

2.4利用荧光实时定量PCR验证cDNA-AFLP分离的差异TDFs

2.5候选特异表达基因在不同发育时期果皮果肉和非果实组织中的表达

3.讨论

3.1琼脂糖凝胶电泳

3.2选择性引物组合及其碱基的确定

3.3特异片段的分离及序列分析

3.4单引物扩增情况

3.5特异表达基因的鉴定

结 语

参考文献

附录 博士学习阶段参加研究课题及发表论文

致谢